Investigating SipA-dependent Salmonella Typhimurium invasion in

Diss. ETH No. 23037
Investigating SipA-dependent
Salmonella Typhimurium invasion in vitro
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
DANIEL ANDRITSCHKE
M.Sc., Universität Zurich
born January 3rd 1987
Citizen of Germany
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt (examiner)
Prof. Dr. Urs Greber (co-examiner)
Prof. Dr. Jason Mercer (co-examiner)
2015
SUMMARY
Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium (S. Tm) is an enteroinvasive
bacterial pathogen that represents a global health risk and one of the leading causes for
human gastroenteritis. Infections occur via the oral route through ingestion of contaminated
food or water. The invasion of gut epithelial cells plays a central role in the infection cycle of
S. Tm. Common symptoms include diarrhea, nausea, vomiting and abdominal pain. Infections
in healthy people are mostly self-limiting, but can be life-threatening for infants, elderly and
immunocompromised patients. Because of the readily available tools available to genetically
manipulate S. Tm, it has become a model organism for invasive bacteria. In order to improve
therapies against Salmonella ssp. and other pathogenic bacterial pathogens, it is of high
importance to gain detailed understanding of their infection processes.
S. Tm has evolved sophisticated infection mechanisms. It employs two type three secretion
systems (TTSS), TTSS-1 and TTSS-2, which inject a cocktail of effector proteins into host cells
to induce internalization and establish a replicative niche, respectively. These bacterial
effectors deregulate endogenous host cell mechanisms and S. Tm exploits them for its own
advantage. Essential effectors required for internalization are SipA, SopE, SopE2 and SopB.
They directly or indirectly induce actin polymerization leading to pronounced membrane
ruffles at the site of infection. A number of interacting host cell factors are known for these
effectors. However, comprehensive knowledge about molecular mechanisms is needed to
fully understand the process of infection.
In this work, we set out to decipher these ill-defined mechanisms. Using a combination of
quantitative approaches like high-content RNAi screening, modelling and bioinformatics and
qualitative cell biological methods, we investigated SipA-mediated Salmonella Typhimurium
infection in an in vitro cell culture model. This type of invasion has been previously described
to be morphologically distinct from wild type and SopE-mediated S. Tm infection processes
and could potentially add important details to the understanding of SipA-driven molecular
processes.
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Chapter II describes the integration of a formerly performed genome wide siRNA screen on
S.TmSipA (a strain lacking SopE, SopE2 and SopB, only driving invasion using SipA) into an
analysis pipeline of the InfectX consortium aiming to explore the infectome of invasive
bacteria and viruses. By reanalyzing this screen and functionally clustering hits we were able
to pinpoint actin polymerization processes involved in this type of invasion. We found that,
despite the morphological differences between SipA- and SopE-mediated invasion, similar
parallel host cell mechanisms are involved. These differ in their degree of dependency from
the SopE-type of S. Tm invasion. In contrast to S. TmSopE, SipA-driven infection seems to employ
the nucleation promoting factor WAVE2 to activate the same downstream actin nucleators to
enter host cells. Additionally, it might use a second route of actin polymerization, exploiting
proteins of the SPIRE family of actin nucleators.
Because of the equally organized setup of our RNAi screening platform within the InfectX
consortium, it was possible to tackle the profound problem of off-target effects in highcontent siRNA screens of different pathogens. In collaboration with bioinformaticians in the
consortium, we found miRNA-like seed regions in our sets of siRNAs that reproducibly changed
infection phenotypes. Therefore, we attributed off-targets to this effect. Additionally, through
another collaboration with modelers in the consortium it was possible to reconstruct single
siRNA phenotypes by predicting their potential to induce on- or off-target effects. This
improved the interpretation of screening results. Our findings show that RNAi screens are
great tools to uncover novel pathways and, in combination with different modelling
approaches, can pave the way to better understand the interplay between host cells and
pathogens.
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ZUSAMMENFASSUNG
Salmonella Typhimurium (S. Tm) ist ein enteroinvasives, bakterielles Pathogen dass ein
globales Gesundheitsrisiko darstellt und zu den Hauptverursachern für Gastroenteritis zählt.
Infektionen erfolgen durch Schlucken von kontaminiertem Wasser oder Nahrung. Die Invasion
von Darmepithelzellen spielt eine zentrale Role im Infektionszyklus von S. Tm. Zu den
allgemein
auftretenden
Symptomen
zählen
Durchfall,
Übelkeit,
Erbrechen
und
Bauchschmerzen. Infektionen in gesunden Patienten sind meist selbst limitierend. In sehr
jungen, alten und immunsupprimierten Menschen können diese jedoch lebensbedrohlich
werden. Aufgrund der verfügbaren Möglichkeiten S. Tm genetisch zu verändern, hat es sich
zu einem Modellorganismus für invasive Bakterien entwickelt. Um Therapien gegen
Salmonellen ssp. und andere pathogene Bakterien zu verbessern ist es wichtig detailliertes
Verständnis des Infektionsprozesses zu erlangen.
Salmonella Typhimurium benutzt ausgeklügelte Infektionsmechanismen. Mit Hilfe von zwei
Typ 3 Sekretionssystemen (TTSS), TTSS-1 und TTSS-2, die ein Gemisch an Effektorproteinen in
Wirtszellen injizieren, wird die Aufnahme von S. Tm induziert und eine Nische zur Replikation
zur gebildet. Diese bakteriellen Effektoren deregulieren endogene Wirtszellmechanismen.
SipA, SopE, SopE2 und SopB sind essentielle Effektorproteine für die Aufnahme in Wirtszellen.
Diese Proteine induzieren, direkt oder indirekt, die Polymerisation von Aktin, welche zu
ausgeprägten Membranausstülpungen um Infektionsstellen führt. Einige Interaktionen dieser
Effektoren mit Wirtszellen sind bereits bekannt. Um den ganzen Prozess vollkommen zu
verstehen ist jedoch mehr Wissen über die molekularen Mechanismen nötig.
In dieser Arbeit versuchen wir die nicht ausreichend bekannten Mechanismen zu
entschlüsseln. Wir untersuchen SipA-abhängige S. Tm Invasion mit einer Kombination aus
Modellierung-, Bioinformatik-, Zellbiologie- und Screening-Experimenten in einem in vitro
Zellkulturmodel. Kürzlich wurde gezeigt, dass SipA-Invasion sich morphologisch von Wildtyp
und SopE-Invasion unterscheidet. Wir können aus unseren Versuchen Schlüsse daraus ziehen
wie SipA-abhängige molekulare Prozesse ablaufen.
In Abschnitt II wird die Integration des Datensatzes eines früheren Genom-weiten siRNA
Experimentes an S. TmSipA in einen Analysekanal des InfectX Konsortiums beschrieben. Dieses
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Konsortium wurde initiiert um das Infektom von invasiven Bakterien und Viren zu
entschlüsseln. Durch die Reanalyse des Screen und unter Verwendung einer funktioneller
Häufungsanalyse der Ergebnisse ist es uns gelungen, Prozesse der Aktinpolymerisation zu
finden die im Infektionsprozess involviert sind. Trotz der morphologischen Unterschiede
zwischen SipA und SopE-vermittelter Invasion spielen vergleichbare Mechanismen in beiden
Invasionsformen eine Rolle. Der Unterschied zwischen den Invasionformen besteht hier im
Wesentlichen im Grad der Beteiligung der Wirtsproteine. SipA-induzierte Invasion hängt stark
vom Nukleations-treibenden Faktor WAVE2 ab. Dieser wiederrum aktiviert die gleichen Aktin
Nukleatoren die auch in SopE-abhängiger Invasion gebraucht werden. Zusätzlich wird
vermutlich noch eine zweite Route, die SPIRE Proteine beinhaltet, genutzt um Aktin zu
polymerisieren.
Aufgrund des vergleichbaren Aufbaus der RNAi Screening Plattformen im InfectX Konsortium
war es möglich das ausgeprägte Problem von Off-Target-Effekten in diesen Experimenten zu
untersuchen. In Kollaboration mit Bioinformatikern des Konsortiums haben wir microRNAähnliche "Seed"-Regionen in unserer siRNA Sammlung gefunden. Diese beeinflussen unsere
Phänotypen reproduzierbar und nachhaltig. Durch eine weitere Kollaboration im Konsortium
war es möglich Phänotypen einzelner siRNA zu rekonstruieren. Dies wurde durch
Modelvoraussagen ihrer "On-" und "Off-Target" Effekte erreicht und verbesserte die
Interpretation von Screening Resultaten merklich. Unsere Ergebnisse zeigen dass RNAi
Screens sehr gute Werkzeuge darstellen um bisher unbekannte Signalwege aufzudecken und,
in Kombination mit verschiedenen Modellansätzen, zukünftig den Weg zu einem besseren
Verständnis des Zusammenspiels zwischen Wirtszellen und Pathogenen zu ebnen.
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