Universitätsklinikum Ulm
Klinik für Neurologie
Prof. Dr. med. A. C. Ludolph
Einfluss mitochondrialer Schädigung im Alter und bei
neurodegenerativen Erkrankungen auf die alternative
Aktivierung und Phagozytosefähigkeit von
Mikrogliazellen
Dissertation zur Erlangung des
Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
vorgelegt von
Valentina Reimer
aus Starizkoje
2014
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: PD Dr. Anke Witting
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Dietmar R. Thal
Tag der Promotion: 20.11.2015
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. III
1 Einleitung ................................................................................................................................. 1
1.1 Mikrogliazellen .................................................................................................................. 1
1.2 Klassische und alternative Aktivierung ............................................................................... 1
1.3 Mitochondriale Dysfunktion in neurodegenerativen Erkrankungen ................................... 2
1.3.1 Mitochondriale Dysfunktion bei Chorea Huntington .................................................... 3
1.3.2 Mitochondriale Dysfunktion bei der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) .................... 5
1.3.3 Mitochondriale Dysfunktion bei Morbus Alzheimer ..................................................... 6
1.4 Fragestellung ..................................................................................................................... 7
2 Material und Methoden .......................................................................................................... 8
2.1 Material ............................................................................................................................. 8
2.1.1 Verwendete Mausstämme .......................................................................................... 8
2.1.2 Genotypisierung mittels PCR ....................................................................................... 9
2.1.3 Zellkultur ................................................................................................................... 10
2.1.4 Zytokin-Bestimmung ................................................................................................. 12
2.1.5 Immunzytochemie ..................................................................................................... 12
2.1.6 Phagozytose Experimente ......................................................................................... 13
2.1.7 Angesetzte Lösungen................................................................................................. 15
2.1.8 Allgemeine Laborgeräte ............................................................................................ 16
2.2 Methoden ........................................................................................................................ 17
2.2.1 Genotypisierung (PCR) ............................................................................................... 17
2.2.2 Zellkultur ................................................................................................................... 21
2.2.3 Zytokin-Assay ............................................................................................................ 24
2.2.4 Statistik ..................................................................................................................... 25
2.2.5 Immunzytochemie ..................................................................................................... 26
Seite I
Inhaltsverzeichnis
2.2.6 Phagozytose-Experimente ......................................................................................... 27
3 Ergebnisse .............................................................................................................................. 31
3.1 Etablierung von primären Mikrogliazellkulturen .............................................................. 31
3.2 Astrozytenkulturen .......................................................................................................... 32
3.3 Mikrogliazellkulturen erwachsener/Endstadium-Mäuse .................................................. 33
3.4 Unterschiede der IL-6-Produktion zwischen Mikroglia neugeborener und alter Mäuse .... 34
3.4.1 Interleukin 6-Produktion nativer Mikrogliazellkulturen.............................................. 35
3.4.2 Klassische Aktivierung von Mikrogliazellkulturen junger und alter Wildtyp-Mäuse .... 35
3.4.3 Alternative Aktivierung von Mikrogliazellkulturen junger und alter Wildtyp-Mäuse .. 36
3.4.4 Alternative Aktivierung am SOD1-Mausmodell für Amyotrophe ALS ......................... 37
3.4.5 Alternative Aktivierung am Mausmodell für Chorea Huntington (R6/2) ..................... 38
3.5 Phagozytose..................................................................................................................... 39
4 Diskussion .............................................................................................................................. 41
4.1 Erhöhter Inflammationsstatus von Mikrogliazellen im Alter ............................................. 41
4.2 Gehemmte alternative Aktivierung und gesteigerte Neuroinflammation bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie im Alter ..................................................................................... 43
4.3 Phagozytose von Aß-Plaques bei Alzheimer ..................................................................... 45
5 Zusammenfassung ................................................................................................................. 48
6 Literaturverzeichnis ............................................................................................................... 49
Danksagung .............................................................................................................................. 55
Lebenslauf ................................................................................................................................ 56
Seite II
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A
Aß
Ampère

Amyloid ß
ALS
Amyotrophe Lateralsklerose
ANOVA
analysis of variance (Varianzanalyse)
APP
amyloid precursor protein
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
CD11b
Cluster of Differentiation 11b
CO2
Kohlendioxid
DAPI
4′,6-Diamidino-2-phenylindol
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP’s
Desoxyribonukleosidtriphosphat
DPBS
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline
ECL
Enhanced Chemiluminescence
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FCS
Fötales Kälberserum
FTD
fronto-temporale Demenz
g
Gramm
g
Erdschwerebeschleunigung g = 9,81 m/s2
GFAP
Glial fibrillary acidic protein
Seite III
Abkürzungsverzeichnis
h
Stunde
HCl
Salzsäure
HD
Huntington`s disease
HIF-1
Hypoxie-induzierter Faktor 1
HRP
Horseradish peroxidase
hSOD1
humane Superoxiddismutase1
IFN-
Interferon-
IgG
Immunglobulin G
IGF-1
Insulin-like growth factor 1
IL
Interleukin
kb
Kilobasen
kg
Kilogramm
l
Liter
LPS
Lipopolysaccharid
M
molar
mg
Milligramm
MG
Mikrogliazellen
mIL-2
murines Interleukin-2
min
Minuten
ml
Milliliter
mM
Millimolar
µl
Mikroliter
MPTP
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin
mtDNA
mitochondriale DNA
NO
Stickstoffmonoxid
Seite IV
Abkürzungsverzeichnis
PBS
phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung
PCR
Polymerasekettenreaktion
PFA
Paraformaldehyd
PGC-1
PPAR- coactivator-1
PGC-1ß
PPAR- coactivator-1ß (Transkriptionsfaktor-Koaktivator)
PON
Poly-L-Ornithin 
PPAR
Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren
PS
Penicillin / Streptomycin
PVDF
Polyvinylidenfluorid
ROS
reactive oxygen species
ROT
Rotenon
rpm
Rotationen pro Minute
sec
Sekunden
SEM
Standardfehler
SOD 1
Cu/Zn-Superoxid-Dismutase 1
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
STAT6
Signal Transducers and Activator of Transcription 6 (Transkriptionsfaktor)
TAE
Tris-Acetat-EDTA
Taq
Thermophilus aquaticus
TE
Tris-EDTA
TMB
Tetramethylbenzidin
TNF- 
Tumornekrosefaktor-
Tris
Tris-(Hydroxymethyl-) Aminomethan
Tween-20
Polyoxyethylensorbitan-monolaurat
V
Volt
WT
Wildtyp
Seite V
Abkürzungsverzeichnis
z.B.
zum Beispiel
ZNS
Zentrales Nervensystem
3-NP
3-nitropropionic acid
Seite VI
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Mikrogliazellen
Mikrogliazellen (MG) sind die ortsansässigen, professionellen Makrophagen des zentralen
Nervensystems (ZNS) und fungieren als Sensoren auf pathologische Veränderungen. Im
normalen, gesunden Gehirn hat jede Mikrogliazelle jeweils ein Hirnareal, über das sie wacht.
Diese „ruhenden“ Mikroglia, die sich morphologisch durch typische, feine Verästelungen
auszeichnen, sind aber nicht untätig. Es ist vielmehr so, dass sie aktiv ein bestimmtes Areal
„scannen“ und so strukturelle und funktionelle Veränderungen sofort erkennen (Nimmerjahn et
al. 2005). Sobald sie solche Veränderungen, die infektiösen, traumatischen, neoplastischen oder
degenerativen Ursprungs seien können, entdecken, wandeln sie sich in eine aktivierte,
amöboide Form um. Diese können proliferieren, Antigene präsentieren, bioaktive Substanzen,
wie z.B. Zytokine, Chemokine und Stickstoffmonoxid (NO), freisetzen und an den Ort der
Schädigung migrieren. Die Aktivierung der Mikroglia kann von „on“-Signalen oder „off“-Signalen
induziert sein, also Faktoren, die während des pathologischen Ereignisses neu auftreten oder
stark ansteigen, oder Faktoren, die immer präsent sind und auf das pathologische Ereignis mit
einem Abfall reagieren. Bioaktive Stoffe, wie Interleukin-6 (IL-6), Tumornekrosefaktor- (TNF-
und Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), die von aktivierten Mikrogliazellen freigesetzt werden,
können sowohl protektiven als auch schädlichen Einfluss auf das umliegende Hirngewebe haben
(Hanisch u. Kettenmann 2007).
1.2 Klassische und alternative Aktivierung
Der klassische Weg der Makrophagen-Aktivierung erfolgt durch die Stimulation mit InterferonIFN-und Lipopolysaccharid (LPS) oder inflammatorischen Zytokinen, wie TNF-Zellen, die
auf diese Art und Weise stimuliert werden, setzen vermehrt proinflammatorische Zytokine, wie
TNF-, IL-1IL-6 und IL-12, reaktive Sauerstoffspezies und NO frei. In klassisch aktivierten
Makrophagen wird Arginin zu NO und Citrullin abgebaut. Diese Art der Aktivierung wird durch
den Transkriptionsfaktor HIF-Hypoxie-induzierter Faktor 1) vermittelt, ist metabolisch an
die Glykolyse gebunden und somit von Stoffwechselgängen im Zytoplasma abhängig (Abb. 1).
Der alternative Weg der Aktivierung ermöglicht Makrophagen Inflammation zu limitieren und
Wundheilung zu fördern. Makrophagen, die mit antiinflammatorisch wirkenden Zytokinen, wie
IL-4 und IL-13 stimuliert wurden, setzen weniger inflammatorische Zytokine frei, exprimieren
eine Vielzahl von Rezeptoren, wie z.B. endozytische/phagozytische Rezeptoren, und weisen eine
Seite 1
Einleitung
erhöhte Arginaseaktivität auf. Das heißt Arginin wird nicht mehr für die Produktion von NO
verwendet, sondern wird zu Polyaminen und Prolin verstoffwechselt. Prolin, als ein
Hauptbestandteil von Kollagen, dient der Wundheilung (Abb. 1). Diese Art der Aktivierung wird
durch PGC-1PPAR- coactivator-1 und STAT6 (Signal Transducers and Activator of
Transcription 6) vermittelt und ist an den in den Mitochondrien stattfindenden
Fettsäurestoffwechsel gebunden (Lacy-Hulbert u. Moore 2006).
Abbildung 1.: Klassische und Alternative Aktivierung von Makrophagen
(Lacy-Hulbert u. Moore 2006), Copyright Elsevier
1.3 Mitochondriale Dysfunktion in neurodegenerativen Erkrankungen
Eine
Gemeinsamkeit
vieler
neurodegenerativer
Erkrankungen
sind
mitochondriale
Dysfunktionen. Hohes Alter stellt den größten Risikofaktor für deren Entstehung dar.
Zunehmende Mutationen in der mitochondrialen DNA und oxidativer Stress tragen zum
Alterungsprozess bei und spielen somit auch in neurodegenerative Erkrankungen, wie Morbus
Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose und Chorea Huntington, eine entscheidende Rolle. Viele
krankheitsspezifische Proteine von neurodegenerativen Erkrankungen interagieren mit
Mitochondrien bzw. mitochondrialen Proteinen (Lin u. Beal 2006).
Des Weiteren rufen Toxine, die die mitochondriale Atmungskette inhibieren, neurodegenerative
Erkrankungen in Menschen und Tieren hervor. Die Hemmung vom Komplex I (NADHSeite 2
Einleitung
Dehydrogenase) mit 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) oder Rotenon (ROT)
kann bei Tieren das Parkinson-Syndrom, mit dem dazugehörigen Untergang dopaminerger
Neurone in der Substantia nigra, auslösen.
Die Hemmung vom Komplex II (Succinatdehydrogenase) mit 3-Nitropropionic acid (3-NP) oder
Malonat verursacht bei Tieren einen Huntington-artigen Phänotyp mit dem dazugehörigen
Untergang von Neuronen des Kortex und des Striatum (Lin u. Beal 2006).
Die mitochondrialen Toxine ROT und 3-NP inhibieren bereits in nicht-toxischen Konzentrationen
die IL-4-induzierte alternative Aktivierung von Mikroglia. Die durch LPS-induzierte klassische
Aktivierung bleibt unbeeinflusst. Mitochondriale Dysfunktion in den Mikrogliazellen von Mäusen
hemmt daher spezifische Antworten der alternativen Aktivierung. Man kann daraus schließen,
dass eine intakte Atmungskette eine Voraussetzung für die alternative Aktivierung ist.
Mitochondriale Dysfunktion in neurodegenerativen Erkrankungen könnte durch die reduzierte
antiinflammatorische Antwort eine mögliche Erklärung für die anhaltende Neuroinflammation
in neurodegenerativen Erkrankungen sein (Ferger et al. 2010).
1.3.1 Mitochondriale Dysfunktion bei Chorea Huntington
Morbus Huntington ist eine unheilbare, autosomal-dominant vererbte Störung, die durch den
Verlust langer Projektionsneurone in Kortex und Striatum und klinisch durch Chorea,
psychiatrische Auffälligkeiten und Demenz charakterisiert ist.
Der zugrunde liegende Gendefekt besteht aus einer erhöhten Anzahl von CAG-TripletWiederholungen im Exon 1 des Huntington-Gens, welches für einen Polyglutaminabschnitt
innerhalb des Proteins, namens Huntingtin, codiert. Das normale Huntington-Gen enthält ca. 6
bis 37 CAG-Triplet-Wiederholungen, während das pathologische Huntington-Gen aus 35 bis 121
dieser CAG-Triplet-Wiederholungen bestehen kann. Zwischen der Anzahl der CAG-TripletWiederholungen im pathologischen Huntington-Gen und dem Alter beim Auftreten der ersten
Symptome besteht eine reziproke Korrelation. Je höher die Anzahl der CAG-TripletWiederholungen, desto größer die Wahrscheinlichkeit bereits in jungen Jahren zu erkranken.
Obwohl das mutierte Huntingtin bereits von Geburt an ubiquitär in allen Geweben exprimiert
wird, führt es zu einem selektiven Zelltod von Neuronen in Kortex und Striatum, der erst
zwischen dem 35. und 50. Lebensjahr symptomatisch wird. 15 bis 20 Jahre nach Ausbruch endet
die Erkrankung tödlich. Es gibt noch keine effektive Therapie (Mangiarini et al. 1996).
Seite 3
Einleitung
Abbildung 2: Rolle der Mitochondrien bei Chorea Huntington
(Lin u. Beal 2006), Copyright Nature Publishing Group
In Huntington-Gehirnen ist die Komplex II-Aktivität vermindert. Zudem verursacht der Komplex
II-Inhibitor 3-NP) degenerative Prozesse im Striatum und damit verbunden auch
Bewegungsstörungen bei Ratten und Primaten. Eine Überexpression von Komplex IIUntereinheiten reduziert den Zelltod striataler Neurone, die mutiertes Huntingtin exprimieren.
Mutiertes Huntingtin verbindet sich mit der äußeren Mitochondrienmembran und erhöht die
Sensitivität zur Calcium-induzierten Cytochrom c-Freisetzung. Außerdem gelangt mutiertes
Huntingtin auch in den Zellkern, wo es bindet und das Level und die Transkriptionsaktivität vom
Tumorsuppressor-Protein p53 erhöht. p53 aktiviert den proapoptotischen Co-Faktor BAX,
entweder direkt oder indirekt durch eine gesteigerte Expression von NOXA und PUMA aus der
Bcl-2 Familie (Abb. 2).
Neuere Studien haben zudem gezeigt, dass bei Huntington - Patienten und einigen Huntington Mausmodellen die Expression von PGC-1herunterreguliert ist. Der Coaktivator PGC-1ist ein
Schlüsselregulator der mitochondrialen Biogenese und der Atmungskette und vermittelt die
Expression einiger Transkriptionsfaktoren, die hierfür benötigt werden (McGill u. Beal 2006).
Mutiertes Huntingtin hemmt die Expression von PGC-1indem es mit einem entscheidenden
Transkriptionskomplex, dem CREB/TAF-Komplex, interagiert. Mangel an PGC-1verschlimmert
den Phänotyp transgener Huntington-Mausmodelle und in vivo-Transfektion mit PGC-1kann
manche Aspekte der striatalen Gewebspathologie von Huntington-Mäusen verbessern (Cui et al.
2006).
Seite 4
Einleitung
1.3.2 Mitochondriale Dysfunktion bei der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS)
Für die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist der selektive Untergang von Motoneuronen im
Rückenmark,
Hirnstamm
und
Motorcortex
charakteristisch,
der
zur
Atrophie
der
Skelettmuskulatur, Paralyse und schließlich innerhalb von 2 - 5 Jahren nach Ausbruch zum Tod
führt. Die Ätiologie von ALS ist unbekannt. 90 % der Fälle sind sporadisch, ohne bekannte
Ursache, und 10 % sind familiär. Von den familiären Fällen, sind 20 % mit Mutationen der Cu/ZnSuperoxid-Dismutase (Cu/Zn-SOD) assoziiert.
In einigen Familien mit autosomal-dominanter, fronto-temporaler Demenz (FTD) und ALS
konnte ein genetischer Zusammenhang zu Chromosom 9p21 nachgewiesen werden. Vermehrte
Wiederholungen eines nicht-kodierenden GGGGCC-Hexanukleotids im C9ORF72-Gen in
Chromosom 9p sind mit FTD/ALS assoziiert. Klinische Analysen konnten zeigen, dass diese
C9ORF72-Hexanukleotid-Wiederholungen die häufigste genetische Auffälligkeit sowohl bei der
familiären FTD (11,7%) als auch der familiären Form der ALS (23,5%) darstellen (DeJesusHernandez et al. 2011).
Sowohl die sporadische als auch die familiäre Form der ALS weisen in Postmortem- und BiopsieProben von Rückenmark, Nerven und Muskulatur Anomalien in Struktur, Anzahl und
Lokalisation der Mitochondrien auf (Lin u. Beal 2006).
Abbildung 3: Rolle der Mitochondrien bei ALS (Lin u. Beal 2006), Copyright Nature Publishing Group
Seite 5
Einleitung
Die Überexpression des mutierten SOD1-Gens beeinträchtigt die Aktivität der Atmungskette und
senkt die mitochondriale Calcium-Ladefähigkeit. SOD1 befindet sich in der äußeren
Mitochondrienmembran, im Membranzwischenraum und in der Matrix. Mutiertes SOD1
verursacht in den Mitochondrien eine Cytochrom c-Freisetzung und Apoptose. Mutiertes SOD1
fördert eine abnorme mitochondriale Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, kann
Aggregate bilden, die den Protein-Importweg in der äußeren Mitochondrienmembran
blockieren oder das antiapoptotische Bcl-2 binden und ablösen (Lin u. Beal 2006).
Zudem konnte auch PGC-1 als relevanter, geschlechtsabhängiger Krankheitsmodifizierer für
ALS
identifiziert
werden.
Einzelnukleotid-Polymorphismen
(engl.
Single
Nucleotide
Polymorphism, SNP) in der hirnspezifischen Promoterregion von PGC-1 modulieren das
Erkrankungsalter und das Überleben in zwei großen, unabhängigen ALS-Populationen, jedoch
nur beim männlichen Geschlecht. Analog dazu konnte in Tierstudien gezeigt werden, dass ein
Mangel an „full-length-PGC-1“ zu einem signifikant früherem Krankheitseintrittsalter und einer
grenzwertig verkürzten Überlebenszeit bei männlichen Geschlecht führt (Eschbach et al. 2013).
1.3.3 Mitochondriale Dysfunktion bei Morbus Alzheimer
Alzheimer ist eine altersabhängige neurogenerative Störung. Klinisch zeichnet sich diese
Erkrankung durch einen fortschreitenden Verlust kognitiver Fähigkeiten aus, und damit
verbundenen
Verhaltensauffälligkeiten
und
neuropsychologischen
Symptomen.
Pathognomonisch für Alzheimer sind Amyloid (Aß)-Plaques, aus fehlerhaft gefalteten ßAmyloid-Peptiden, und intrazelluläre Neurofibrillen aus hyperphosphoryliertem Tau. Hinweise
auf eine mitochondriale Dysfunktion bei der Pathogenese von Alzheimer geben die verminderte
Aktivität der drei Citratzyklus-Schlüsselenzym-Komplexe, Pyruvatdehydrogenase, IsocitratDehydrogenase und a-Ketoglutarat-Dehydrogenase in untersuchten postmortem AlzheimerGehirnen und Fibroblasten von Alzheimer-Patienten (Bubber et al. 2005). Ebenso liefert die
verminderte Aktivität der Komplexe I, III und IV der Atmungskette in Thrombozyten und
Lymphozyten von Alzheimer-Patienten und postmortem Gehirngewebe einen weiteren Hinweis
für eine mitochondriale Dysfunktion (Valla et al. 2006).
Zudem gibt es Hinweise darauf, dass Mutationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) eine
entscheidende Rolle bei der mitochondrialen Dysfunktion bei Alzheimer spielen. In einer Studie
zu diesem Thema wurden 20 Punktmutationen in den Genen der mtDNA-codierten Cytochrom
c-Oxydase-Untereinheiten I, II und III von Alzheimer-Patienten, ermittelt (Hamblet et al. 2006).
Seite 6
Einleitung
Hinzu kommt, dass Proteine, die mit Alzheimer in Verbindung stehen, direkten Einfluss auf
Mitochondrien haben und so mitochondriale Dysfunktion verursachen können. Zu diesen
Proteinen gehört unter anderem APP (amyloid precursor protein), welches direkt an die
Mitochondrien kortikaler Neurone von Alzheimer-transgenen Mäusen bindet (Chaturvedi u.
Beal 2008).
Ein weiteres Kennzeichen von Alzheimer sind aktivierte Mikrogliazellen, die Aß-Plaques
umgeben. Aß-Peptide werden für potente Mikrogliaaktivatoren gehalten. Aber welche Rolle
Mikrogliazellen bei der Pathologie von Alzheimer spielen, ist noch ungeklärt. In einer Studie
wurde gezeigt, dass alternativ aktivierte Mikroglia von Ratten, die mit IL-4 behandelt wurden,
die Aufnahme und den Abbau von oligomeren Aß1 - 42 erhöhen (Shimizu et al. 2008).
1.4 Fragestellung
In neurodegenerativen Erkrankungen, wie Chorea Huntington, ALS und Alzheimer, und bei
Alterung spielen sowohl mitochondriale Dysfunktion als auch Mikrogliaaktivierung eine
entscheidende Rolle. Mitochondriale Dysfunktion inhibiert die alternative Aktivierung und
könnte damit auch die anhaltende Neuroinflammation erklären.
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich in den Mikrogliazellen von Mausmodellen
für Huntington (B6CBA-Tg (HDexon1) und ALS (B6.CG-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J) eine Inhibition der
alternativen Aktivierung zeigt.
Da Alterung der Hauptrisikofaktor für neurodegenerative Erkrankungen ist, interessierte uns, ob
es Unterschiede in der alternativen Aktivierung von jungen und alten Mikroglia gibt. Die
Experimente wurden deshalb mit Mikrogliazellen von neugeborenen, noch gesunden Mäusen,
und Mikrogliazellen von Mäusen im Endstadium ihrer Erkrankung, durchgeführt.
Zusätzlich sollte im Hinblick auf die Pathogenese von Alzheimer in dieser Arbeit untersucht
werden, ob die alternative Aktivierung Einfluss auf die Phagozytosefähigkeit von Mikrogliazellen
hat. Hierfür wurden primäre Mikroglia von Wildtyp (C57BL/6) - Mäusen auf Gehirnschnitte von
Alzheimerpatienten aufgebracht und proinflammatorisch mit Lipopolysaccharid (LPS) oder
antiinflammatorisch mit Interleukin-4 (IL-4) stimuliert.
Seite 7
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verwendete Mausstämme
Der Mausstamm SOD1-G93A ( SOD1)
Der transgene Mausstamm B6.CG-Tg (SOD1-G93A) 1Gur/J, kurz SOD1 wurde ursprünglich von
der Firma The Jackson Laboratories bezogen und wird aktuell an der Universität Ulm mittels
Erhaltungszucht gezüchtet. Transgene SOD1-Mäuse exprimieren eine mutierte humane
Superoxiddismutase (hSOD1). An der Stelle 93 trägt die Aminosäuresequenz anstatt des Glycins
ein Alanin.
Homozygote Tiere sind nicht lebensfähig und versterben intrauterin. Da den SOD1-Mäusen das
korrespondierende mutierte Allel des hSOD1-Tansgens fehlt, werden die Mäuse als hemizygot
bezeichnet. Transgene SOD1-Mäuse werden als Mausmodell für ALS verwendet, da diese Tiere
eine Degeneration von Motoneuronen und einige klinische Symptome zeigen, die ebenfalls im
Krankheitsverlauf der ALS beim Menschen auftreten. Beim Menschen können initial kleinere
Muskelgruppen der oberen (40 % der Fälle) und der unteren Extremität (ebenfalls 40 % der
Fälle) von der Atrophie betroffen sein. In selteneren Fällen (ca. 20 %) kommt es zu einem
bulbären Krankheitsbeginn, der sich durch Sprech- und Schluckbeschwerden äußert. Anders als
beim Menschen kommt es bei der SOD1-Maus zunächst zur Beeinträchtigung von einem oder
beider Hinterbeine.
Bei der SOD1-Maus treten die ersten Symptome im Alter von ca. 13 Wochen auf. Die
durchschnittliche Lebenserwartung liegt bei 5 - 6 Monaten (Gurney et al. 1994).
Die Versuche wurden sowohl mit neugeborenen als auch mit Tieren im Endstadium ihrer
Erkrankung durchgeführt.
Der Mausstamm R6/2
1996 wurde das transgene Mausmodell R6/2 für Huntington entwickelt. Embryos im
Einzelzellstadium wurden mit dem Transgen transfiziert. Das integrierte Transgen ist ein Klon
eines Fragments vom 5´-Ende eines Huntington-Gens aus einem Patienten mit juveniler
Huntington. Es umfasst ca. 1kb des aus 11 Exons bestehenden Huntington-Gens. Die Mutation
beinhaltet die Promotor-Region, Exon 1 und etwa 141-157 CAG-Triplet-Wiederholungen.
Seite 8
Material und Methoden
Unter den neugeborenen Mäusen gab es eine männliche R6/2-Maus, die mit C57BL/6 und
CBAxC57BL/6 Weibchen rückgekreuzt wurde. Es entstanden vier Mauslinien mit unterschiedlich
langen CAG-Triplet-Wiederholungen (R6/0, R6/1, R6/2 und R6/5).
Bei der neuropathologischen Untersuchung der Gehirne fiel ein um etwa 20 % geringeres
Gehirngewicht der transgenen Tiere im Vergleich zu den gesunden Mäusen auf. Das Corpus
striatum war im Vergleich zu gesunden Tieren verkleinert. Die Morphologie des gesamten ZNS
war jedoch bei den transgenen Tieren bei erster Inspektion unauffällig. Es konnten weder fokale
Läsionen noch Areale mit Neurodegeneration entdeckt werden. Die immunhistochemische und
elektronenmikroskopische Untersuchung der Gehirne zeigte jedoch das Auftreten striataler,
intranukleärer Einschlusskörper, deren Anzahl parallel zur Progredienz des Krankheitsverlaufs
zunahm.
Die R6/2-Linie ist mit bis zu 144 CAG-Wiederholungen das am häufigsten genutzte Mausmodell
für Huntington. Die R6/2-Mäuse entwickeln im Alter von 9 - 11 Wochen die ersten Symptome
und sterben im Alter von 10 bis 13 Wochen (Mangiarini et al. 1996).
Der Mausstamm C57BL/6
Der „C57 black 6“-Mausstamm gehört zu den am meisten verwendeten Inzuchtstämmen. Er
zeichnet sich durch eine gute Zuchtleistung und eine mittlere Lebenserwartung von 700 - 800
Tagen unter normalen Haltungsbedingungen aus.
Der Umgang mit den Tieren und die Präparationen erfolgten nach den Richtlinien des
Tierforschungszentrum Ulm. Das Versuchsprotokoll wurde vom Tierschutzbeauftagten der
Universität Ulm genehmigt.
2.1.2 Genotypisierung mittels PCR
SOD 1 - Genotypisierung
Agarose
# A9539, Sigma
DNA-Isolations-Kit
Quick Extract DNA Extraktionslösung 1.0,
Biozym
Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP’s)
# 41240, Promega
Ethylendiamintetraessigsäure
# A4892,0100 AppliChem
(EDTA)-Lösung pH 8,0 (0,5 M)
Seite 9
Material und Methoden
Ethidiumbromid
# 111608, Merck
PCR-Kit
# 10342-020, Invitrogen
(Taq-Polymerase, MgCl , 10x PCR-Puffer)
2
Primer mIL2-f
Thermo Fisher
Primer mIL2-r
Thermo Fisher
Primer hSOD1-G93A-f
Thermo Fisher
Primer hSOD1-G93A-r
Thermo Fisher
Thermocycler
T professional Thermocycler, Biometra
Tris-Acetat
# 93362-250G, Sigma
UV-Lampe
GenoSmart, VWR
R6/2-Genotypisierung
Dimethylsulfoxid (DMSO)
# D5879, Sigma
DNA-Größenmarker
# 10068-013, GibcoBRL
DNA-Isolations-Kit
# K 1820-02, Invitrogen
Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP)
# 41240, Promega
2-Mercaptoethanol
# M3148, Sigma-Aldrich
Magnesiumchlorid (MgCl )
# M1028-10X1ML, Sigma
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)
# 1.01217.1000, Merck
Primer 33935
Invitrogen
Primer 35093
Invitrogen
Rinderserumalbumin (BSA)
# 11930, Serva
Taq-Polymerase
# 10342-020, Invitrogen
Tris-HCl
# 9090.3, Roth
2
2.1.3 Zellkultur
Absaugsystem
BVC 21, Vacuubrand
Aquadest (Aqua-Spüllösung)
# 8771079, DeltaSelect
Binokular
MbC-10
CO2 -Inkubator
Heraeus, Thermo Scientific
Desoxyribonuklease I (DNAse)
# LS 002138, Worthington
(10 mg /ml DPBS)
Seite 10
Material und Methoden
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
# 61965.059, Invitrogen/Gibco
DMEM (1X, 500 ml, mit Phenolrot)
DMEM (1X, 500 ml, ohne Phenolrot)
# 31053-044, Invitrogen/Gibco
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
# 14040-174, Invitrogen/Gibco
DPBS (1X, mit Ca2+ und Mg2+)
DPBS (1X, ohne Ca2+ und Mg2+)
# 14190-169, Invitrogen/Gibco
Foetal Bovine Serum Gold (FBS)
# A15-151, PAA
Glutamax
# 35050-038, Invitrogen
Lichtmikroskop
Axiovert 25, Zeiss
Lichtquelle
KL1500 electronic, Schott
Messpipetten (5,0 ml)
# 612-1097, VWR
Messpipetten (10,0 ml)
# 612-1098, VWR
Mikroskop
Axiovert 135, Zeiss
Neubauer Zählkammer (Bright Line)
# 1310000, Optik Labor
Pasteurpipetten
# 612-1702, VWR
(Material: Glas, Volumen: 2 ml)
Penicillin - Streptomycin
# 15140-122, Invitrogen/Gibco
Pipetboy
Pipetboy acu, IBS Integra Biosciences
Pipetten
Research Einkanal-Pipetten, Eppendorf
Research Pro 8-Kanal-Pipette, Eppendorf
Pipettenspitzen
1000 µl
# 70.762, Sarstedt
200 µl
# 70.760.002, Sarstedt
10 µl
# 70.1115, Sarstedt
Poly-L-Ornithin (PON)-Hydrobromid
# P 3655, Sigma-Aldrich
(Endkonzentration: 100 μg/ml)
Präparationsbesteck (steril)
Stimulanzien
Interleukin-4 (IL-4)
# 404-ML-010, R&D Systems
Lipopolysacharrid (LPS)
# L 4391, Sigma–Aldrich
Trypanblau (0,4 %)
# T 8154, Sigma-Aldrich
Trypsin 2,5 % (10x)
# 15090-046, Invitrogen/Gibco
Seite 11
Material und Methoden
24-well-PLatten
# 353847, BD Falcon
96-well-Platten
# 353872, BD Falcon
Zellkulturschale (56,7 cm2)
# 734-2043, VWR, Nunc
Zellkulturflaschen (25 cm2)
# 156367, Nunc
Zellkulturflaschen (75 cm2)
# 83.1813.002, Sarstedt
Zellsieb
# REF 352360, BD Falcon
Zentrifuge
Heraeus Sepatech, Minifuge RF,
Thermo Scientific
Zentrifugenröhrchen (15 ml)
# 188271 Greiner Bio-One
Zentrifugenröhrchen (50 ml)
# 227261 Greiner Bio-One
2.1.4 Zytokin-Bestimmung
Absorptions-Reader für Mikroplatten
+ Steuerungssoftware
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELx800UV BioTek
KCjunior 1.41.6 BioTek
# 735-0083, NUNC/ Thermo Fisher Scientific
(ELISA)-Platten
Interleukin-6 (IL-6)-ELISA-Kit
# 431301, Biozol
Mehrkanal-Pipetten, 8-Kanal, 100 - 1200 μl
Finnpipette Novus Thermo Scientific
Mehrkanal-Pipetten, 8-Kanal, 20 - 300 μl
Eppendorf Research Pro Eppendorf
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
# 71627, Fluka
Natriumcarbonat (Na2CO3)
A 1352, 1000, Appli Chem
Photometer
ELx 800uv, Universal Microplate Reader,
Bio-Tek
Protein-Assay-Kit
# 500-0116, Bio-Rad
Stop Solution, Schwefelsäure
# 109074, Merck
TMB Substrat Solution
# BLD-421101, Biozol
Triton X-100
# A4975,01, AppliChem
Tween-20
# P 9416, Sigma – Aldrich
2.1.5 Immunzytochemie
Antikörper

Alexa Fluor 488
anti-rabbit IgG (H+L)
# A-11008 Invitrogen
Seite 12
Material und Methoden

Alexa Fluor 568
goat anti-rat IgG
# A11077, Invitrogen

anti-GFAP
# Ab7779-500, Abcam

Rat-anti-mouse CD11b
# MCA74, Serotec
Computer-Analysesoftware
AxioVision 3.1
4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-
# H-1200, Vectashield
Mounting
Fluoreszenzmikroskop
Axiovert 135, Zeiss
Mikroskopkamera
AxioCam MRm, Zeiss
Paraformaldehyd
# 1.04005, Merck
2.1.6 Phagozytose Experimente
Gehirnschnitte von Alzheimer Patienten
Aqua Mount
# 13800, Lerner Laboratories
Poly-D-Lysine-Hydrobromid
# P 6407-5MG, Sigma
Western Blot
Antikörper

Beta Amyloid,
1-16 (6E10)
# SIG-39320, Covance

Goat Anti-Mouse IgG
(H+L)-HRP Conjugate
# 172-10011, Bio-Rad
Belichtungskassette
# RPN13642, Amersham Biosciences
Blotting Paper
# RPN6100M, Hybond
Blot-Kammer
Mini-Protean, Bio-Rad
Enhanced Chemiluminescence
# RPN2132, GE Healthcare
(ECL) Substrat
Filmentwickler
Optimax 2010, Protec
Glycin
# A1377, 1000 AppliChem
Hyperfilm ECL
#28906837, GE Healthcare
Kappillarspitzen
# 223-9915, Bio-Rad
Kaliumchlorid (KCl)
# 529552-1KG, Calbiochem
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
# 1048730250, Merck
Seite 13
Material und Methoden
Laborschüttler
PMK-30, Grant
Ladepuffer (Tricine Sample Buffer)
#161-0739, Bio-Rad
Laufpuffer (Tris-Tricine-SDS-Buffer)
# 161-0744, Bio-Rad
2-Mercaptoethanol
# M3148, Sigma-Aldrich
Methanol
# 80640, Sigma-Aldrich
Milchpulver
# T145.2, ROTH
Molekulargewichtsmarker

SeeBlue Plus2 Prestained
Standard
# LC5925, Invitrogen

Amersham High-Range
Rainbow Molecular
# RPN756E, GE Healthcare
Weight Marker
Natriumchlorid (NaCl)
# 27810.295, VWR
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
# A3567, 1000, AppliChem
Natriumazid
# 1.06688.0100, Merck
Protease-Inhibitor-Cocktail
# 1860932, Thermo-Scientific
PVDF-Transfer-Membran
# IPVH00010, Millipore
Reaktionsgefäße (500 μl)
# 72.704 Sarstedt
Spannungsquelle
E835, Consort
Thermocycler
Biometra, T professional
Thermomixer
Thermomixer compact, Eppendorf
Tricine-Gel (16,5 %)
# 161-1107, Bio-Rad
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)
# 75825 USB Corporation
Urea
# U-6504, Sigma
Immunhistologie
Ameisensäure
# UN1779, AppliChem
Antikörper

Alexa Fluor 568
goat anti-rat IgG
# A11077, Invitrogen

Beta Amyloid (A),
17-24, (4G8)
# SIG-39240, Covance

Rat-anti-mouse CD11b:
# MCA74, Serotec

Alexa Fluor 488 Streptavidin
# S32354, Invitrogen
Seite 14
Material und Methoden
Computer-Analysesoftware
AxioVision 3.1
DAPI-Mounting
# H-1200, Vectashield
Fluoreszenzmikroskop
Axiovert 135, Zeiss
Objektträger
# J1800AMNZ, Menzel Gläser
Paraformaldehyd (PFA)
# 1.04005, Merck
2.1.7 Angesetzte Lösungen
R6/2-PCR-Puffer
0,17 mg/ml BSA
2,0 mM MgCl
2
10 mM 2-Mercaptoethanol
16,6 mM NH (SO )
4
4
67 mM TrisHCl
Assay Diluent
1% BSA in PBS
Blocking-Buffer
5 % Milchpulver in PBST
Coating-Buffer
100 mM NaHCO3
33.6 mM Na2CO3
DMEM/10% FBS
DMEM (1X, 500 ml, mit Phenolrot)
100 U/ml Penicillin
100 μg/ml Streptomycin
10 % hitzeinaktiviertes FBS
DMEM/ohne FBS
DMEM (1X, 500 ml, ohne Phenolrot)
100 U/ml Penicillin
100 μg/ml Streptomycin
2mM Glutamax
PBS (pH 7,2 - 7,4)
137 mM NaCl
8,1 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
2,5 mM KCl
PBST (pH 7,4)
0,05 % TWEEN - 20 in PBS
Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer (pH 8.0)
1 mM EDTA
0,04 M TrisAcetat
Transfer-Puffer
25 mM Tris
Seite 15
Material und Methoden
0,192 M Glycin
15 % Methanol
Wash Buffer
0, 05 % Tween - 20 in PBS
2.1.8 Allgemeine Laborgeräte
Magnetrührer
KMO 2 basic, IKA
RET basic, IKA
pH-Meter
pH 523, WTW
Tischzentrifuge (Microlitre centrifuge)
Biofuge pico, Heraeus Instruments
Rotor: PP3/96, #3324, Heraeus Instruments
Vortexer
K-540-GE, Bender & Hobein AG
Waagen
ALC-110.4 , Acculab
BL610, Sartorius
Seite 16
Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Genotypisierung (PCR)
Um die noch phänotypisch unauffälligen Jungtiere in die transgenen und nicht transgenen
Versuchsgruppen einteilen zu können, wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) zur
Genotypisierung durchgeführt.
DNA Isolierung
Für die Diagnostik des Genotyps wurde von jedem Tier eine DNA-Probe benötigt. Dazu wurde
den Jungtieren, nachdem sie von der Mutter isoliert wurden, ein 3 mm langes Stück der
Schwanzspitze abgetrennt. Damit eine eindeutige Zuordnung des Genotyps zu jedem Tier
gewährleistet werden konnte, wurden jedem Tier spezifische Ohrmarkierungen gesetzt. Bei den
Jungtieren waren solche Markierungen nicht nötig, da die Genotypisierung im Anschluss an die
Präparation erfolgte.
Mit Hilfe eines DNA-Isolations-Kits wurde die DNA aus jeder Schwanzspitze nach Anleitung des
Herstellers isoliert. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst bei 55 °C mit Proteinase K und einem
optimierten, die Proteindenaturierung-fördernden Digestionspuffer lysiert. Die überschüssige
RNA wurde durch Digestion mittels RNAse A beseitigt. Die Lysate wurden mit Ethanol und
Binding Buffer gemischt und anschließend auf die Zentrifugationssäule pipettiert. Bei diesem
Arbeitsschritt erfolgte die Bindung der DNA an eine Siliziumdioxid-Membran in der
Zentrifugationssäule.
Anschließend
wurden
Verunreinigungen
mit
Wash
Buffer
herausgewaschen und die DNA mittels Elution Buffer von der Zentrifugationssäule gelöst. Die so
gewonnene DNA wurde bis zur weiteren Untersuchung bei 4 °C gelagert.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine einfache in-vitro-Technik zur Amplifizierung spezifischer DNA-Sequenzen. Zur
Vervielfältigung eines DNA-Fragments definierter Länge verwendet man mindestens zwei
Oligonukleotide, so genannte Primer, die zu den Randstücken des gewünschten DNA-Stücks
jeweils komplementär sind und in gegenläufiger Richtung an den komplementären DNA-Strang
binden können. Nach einer Hitzedenaturierung werden die Primer an die DNA angelagert
(Annealing) und von einer hitzebeständigen DNA-Polymerase verlängert (Elongation). Dieser
Zyklus (Denaturierung, Annealing, Elongation) wird bis zu 35-mal wiederholt. Bei jedem Zyklus
Seite 17
Material und Methoden
entstehen so die gewünschten Fragmente, die im nächsten Zyklus als Matrize dienen. Auf diese
Weise findet eine exponentielle Amplifikation statt.
Essentiell für diese Reaktion ist eine hitzestabile Polymerase, da die Denaturierung der DNATemplates bei 94 °C stattfindet. Daher wird die Taq-Polymerase verwendet. Nach der
Beendigung der PCR werden in der Regel 5 - 10 µl des Endprodukts auf ein Agarosegel
aufgetragen.
Bestimmung der SOD1-Tiere
Hierfür wurde nach dem dargestellten Schema (Tabelle 1) jede Probe mit einem Volumen von
50 µl angesetzt, wobei hier zwei Primer-Paare benutzt wurden, ein Primerpaar für die humane
SOD1 (hSOD1) und das andere für das murine IL-2 (mIL-2) als Kontrolle (Tabelle 2).
Tabelle 1: Ansatz einer SOD1-PCR
Reagenz
Volumen
Aqua dest.
27,0 µl
10x PCR-Puffer
5,0 µl
50 mM MgCl2
1,5 µl
2 mM dNTP`s
4,0 µl
Primer mIL-2-f
2,0 µl
Primer mIL-2-r
2,0 µl
Primer hSOD1-G93A-f
2,0 µl
Primer hSOD1-G93A-r
2,0 µl
Taq – Polymerase (5U/µl)
0,5 µl
DNA-Template
4,0 µl
Gesamtvolumen
50 µl
Tabelle 2: Primer für die SOD1-PCR
Primer
Sequenz
mIL-2-f
5`-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3´
mIL-2-r
5´-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATC-3´
hSOD1-G93A-f
5´-CATCAGCCCTAATCCATCTGA-3´
hSOD1-G93A-r
5´-CGCGACTAACAATCAAAGTGA-3´
Seite 18
Material und Methoden
Die Ansätze wurden in einen Thermocycler gegeben und mit dem aufgeführten Programm
(Tabelle 3) amplifiziert.
Tabelle 3: PCR Programm für die SOD1-PCR
Schritt
Temperatur
Dauer
Bemerkung
Denaturierung
95 °C
5 min
Initiale Denaturierung der DNA
dsDNA => ssDNA
Denaturierung
95 °C
60 sec
Annealing
60 °C
60 sec
Primerspezifisch
30 Zyklen
Extension
72 °C
50 sec
Extension
72 °C
10 min
Kühlung
4 °C
unendlich
Kühllagerung
Agarose-Gelelektrophorese
Das Prinzip der DNA-Gelelektrophorese beruht auf der Erzeugung eines elektrischen Feldes
durch eine Stromquelle, so dass negativ geladene DNA-Moleküle zur Anode wandern. Kleinere
DNA-Moleküle können sich schneller durch das Gel bewegen als größere. Zur Detektion der DNA
wurden 2 %-ige Agarosegele verwendet, für deren Herstellung die Agarose in TAE-Puffer durch
Erhitzen gelöst wurde. Anschließend wurden 50 ml der Lösung mit 5 µl Ethidiumbromid
versetzt, gemischt und in Gelagarosekammern überführt. Nach dem Auspolymerisieren wurde
das Gel in die mit TAE gefüllte Gelelektrophoresekammer gelegt und vollständig mit Puffer
bedeckt. Jede PCR-Probe wurde mit Ladepuffer versetzt und in die Slots des Gels pipettiert.
Zudem wurde pro Gel immer eine Spur mit dem Größenmarker, eine mit der Positivkontrolle,
eine mit der Negativkontrolle und eine mit Wasser beladen. Die Negativkontrolle enthielt die
DNA-Probe einer Maus, von der man wusste, dass sie eine Wildtyp-Maus war. Die
Positivkontrolle enthielt eine DNA-Probe von einer bekannten transgenen Maus und die
Wasserkontrolle sollte eine Kontamination des verwendeten Aqua dest. und der übrigen
Reagenzien, wie z.B. Primer, 10 x Puffer usw. ausschließen. Anschließend wurde eine Spannung
von 80 Volt für 30 min angelegt. DNA wandert aufgrund der enthaltenen Phosphatreste zur
positiv geladenen Anode.
Seite 19
Material und Methoden
Die Sichtbarmachung der DNA erfolgte unter einer UV-Lampe. Ethidiumbromid hat sich in die
DNA eingelagert und fluoreszierte im ultravioletten Licht. Als transgen wurde eine Maus
bezeichnet, wenn neben der Kontrollbande von IL-2 in Höhe von 300 bp eine zweite Bande in
der Höhe von ca. 230 bp (hSOD1 Amplifikat) auf dem Agarosegel erkennbar war. Als WildtypMaus wurden Tiere bezeichnet, bei denen nur eine Bande im Bereich von 300 bp (mIL-2) zu
erkennen war.
Bestimmung der R6/2-Tiere
Die phänotypisch unauffälligen R6/2-Jungtiere wurden ebenfalls mittels PCR, mit dem
aufgeführten Primerpaar (Tabelle 5), einer transgenen und nicht-transgenen Gruppe
zugeordnet. Jede Probe wurde mit einem Volumen von 25 µl angesetzt (Tabelle 4) und mit dem
beschriebenen Programm (Tabelle 6) amplifiziert.
Tabelle 4: Ansatz einer R6/2 - PCR
Reagenz
Volumen
100 x Primer f
0,25 µl
100 x Primer r
0,25 µl
50 x dNTPs
0,5 µl
10 x R6/2-PCR-Puffer
2,5 µl
10 % DMSO
2,5 µl
100 x Taq-Polymerase
0,25 µl
Aqua dest.
15,75 µl
DNA - Template
3,0 µl
Gesamtvolumen
25 µl
Tabelle 5: Primer für die R6/2 PCR
Primer
Sequenz
Primer 33935
CGCCTGAGGCAGCAGCGGCTGT
Primer 35093
GCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCC
Seite 20
Material und Methoden
Tabelle 6: Programm für R6/2 PCR
Schritt
Temperatur
Dauer
Denaturierung
90 sec
94 °C
[Denaturierung
30 sec
94 °C
Annealing
30 sec
68 °C
Extension]
90 sec
72 °C
Extension
10 min
72 °C
Kühlung
Unendlich
4 °C
Bemerkung
[34 Zyklen]
Kühllagerung
Als transgen wurden Tiere bezeichnet, wenn eine Bande auf der Höhe von ca. 79 bp auf dem
Agarosegel erkennbar war. Als Wildtyp wurden Tiere bezeichnet, bei denen diese Bande fehlte.
2.2.2 Zellkultur
Präparation von Mikrogliazellen aus neugeborenen Mäusen
Die Herstellung primärer Mikrogliazellkulturen erfolgte aus dem Kortex von neugeborenen, 1 - 5
Tage alten Mäusen. Die Tiere wurden dekapitiert und das Gehirn aus der Schädeldecke
entnommen. Nach Entfernung des Cerebellums, der Bulbi oculi, der Hirnhäute und der
Blutgefäße unter dem Okular wurden die Hemisphären an der Sterilbank dreimal mit eiskaltem
DPBS gewaschen und für 4 - 5 min mit 1250 µl 10 x Trypsin und 50 µl DNAse (10 mg/ml DPBS) in
DPBS bei Raumtemperatur inkubiert. Trypsin diente dazu Zellen aus dem Gewebeverband zu
lösen und zu vereinzeln. Die DNAse wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml verwendet um
das Verklumpen von Zellen durch DNA, die aus toten Zellen austritt, zu verhindern.
Anschließend wurde nochmals dreimal mit DPBS gewaschen. Nach Zugabe von weiteren 50 µl
DNAse wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette homogenisiert. Nach Zugabe von 5 ml DMEM/10%
FBS/PS folgte die Zentrifugation bei 200 g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wurde
abgenommen und das Pellet nochmals in DMEM/10% FBS/PS resuspendiert. Die Zellen wurden
in 75 cm2 Kulturflaschen, welche zuvor mit Poly-L-Ornithin (PON) beschichtet wurden, in
DMEM/10% FBS/PS ausplattiert. Die PON-Beschichtung erfolgte indem die Zellkulturflaschen
mit 100 μg/ml PON-Lösung für 30 min bei 37°C/5%CO2 inkubiert und im Anschluss zweimal mit
sterilem, destilliertem Wasser und einmal mit DPBS (mit Ca 2+ und Mg2+) gewaschen wurden. Pro
Flasche wurden die Zellen aus zwei Mäusehirnen ausplattiert. Das Gesamtvolumen, bestehend
aus Zellhomogenat und Medium, betrug 10 ml pro Flasche. Nach drei Tagen wurden die
Seite 21
Material und Methoden
Kulturen dreimal mit DPBS gewaschen, mit 10 ml neuem DMEM/10% FBS/PS versetzt und
zurück in den Inkubator gestellt. Die Zellen wurden für 7 - 10 Tage in DMEM/10% FBS/PSMedium bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Kulturen, bestehend aus einem konfluenten
Astrozytenmonolayer,
worauf
sich
Mikrogliazellen
befanden,
konnten
anschließend
abgeschüttelt werden. Durch Schütteln der Kulturflaschen lösten sich die Mikrogliazellen vom
Astrozytenmonolayer und verteilten sich im Medium. Dieses mit Mikroglia versehene Medium
wurde gesammelt und bei 200 g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in
DMEM/Glutamax/PS resuspendiert und die Mikrogliazellen anschließend in einer Dichte von 3 x
104 Zellen in 96-well-Platten bzw. 15 x 104 Zellen auf PON (1 µg/ml) beschichtete Deckgläser in
DMEM/Glutamax/PS ausplattiert. Eine Stunde später wurde das Medium, mit darin
schwimmendem Zellschrott, gewechselt.
Die Zellzählung zur Einstellung der gewünschten Zelldichte erfolgte mittels einer NeubauerZählkammer. Hierfür wurden tote Zellen durch den Farbstoff Trypanblau angefärbt und von der
Zählung ausgeschlossen. 10 µl der vorhandenen Zellsuspension wurden im Verhältnis 1:1 mit
einer 0,4 %-Trypanblau-Lösung vermengt und anschließend 10 µl dieser Mischung zwischen
Kammer und Deckglas pipettiert. Unter dem Mikroskop wurden 4 große (= 16 kleine) Felder
ausgezählt und der Mittelwert bestimmt. Ein großes Feld enthält ein Volumen von 0,1 µl. Die
Zellzahl pro ml Flüssigkeit errechnet sich daher durch Multiplikation mit 104. Aus einer Flasche
konnte man insgesamt viermal Mikrogliazellen ernten und ausplattieren.
Präparation von Mikrogliazellen aus erwachsenen Mäusen
Die Präparation der Mikrogliazellen aus erwachsenen Mäusen erfolgte grundsätzlich wie bei den
neugeborenen, bis auf folgende Unterschiede:

Nach Entfernung des Cerebellums, der Bulbi, der Hirnhäute und der Blutgefäße wurden
die Hemisphären mit Hilfe eines Skalpells in kleine Stücke geschnitten und anschließend
ebenfalls dreimal mit DPBS gewaschen.

Die Inkubationszeit nach Zugabe von Trypsin und DNAse betrug nicht 5 sondern ca. 15
min und erfolgte bei 37 °C.

Nach dem Homogenisieren des Gehirns und der Zugabe von 5 ml DMEM/10% FBS/PS
wurde das Homogenat vor dem Zentrifugieren durch ein Sieb pipettiert um größere
Gehirnklumpen zu entfernen.
Seite 22
Material und Methoden

Die Zellen wurden in PON beschichteten 25 cm2 Kulturflaschen in DMEM/10% FBS/PS
ausplattiert.

Man verwendete ein Gehirn pro Flasche und das Gesamtvolumen betrug 4 ml pro
Flasche.

Die Kultivierung erfolgte wesentlich länger, nämlich Wochen bis Monate.

Die Flaschen wurden dreimal mit DPBS gewaschen.

Zum Lösen der Mikroglia vom Astrozytenrasen war einfaches Schütteln und Beklopfen
der Flaschen nicht ausreichend. Um die relativ fest-haftenden Mikroglia zu lösen, wurde
das in den Flaschen befindliche Medium abgesaugt und 500 µl Trypsin-EDTA und 500 µl
DPBS hinzugegeben. Unter dem Lichtmikroskop beobachtete man wie sich die Mikroglia
lösten und fügte zum Abstoppen 4 ml DMEM/10% FBS/PS hinzu. Das Zeitfenster zum
Abstoppen der Trypsinierung war relativ eng. Ziel war es so viele Mikroglia wie möglich
zu lösen, aber die Reaktion rechtzeitig zu stoppen, bevor sich auch Astrozyten aus ihrem
Zellverband lösten.
Astrozyten
Da im Rahmen der Immunzytologie auch Astrozyten benötigt wurden, wurden diese ebenfalls
auf Deckgläschen ausplattiert. Die Astrozyten wurden nach der letzten Mikrogliaabschüttlung
aus den Zellkulturflaschen gewonnen. Hierfür wurden die Flaschen einmal mit DPBS gewaschen
und die festsitzenden Zellen anschließend mit 0,05 % Trypsin und 0,5 mM EDTA vom
Flaschengrund gelöst. Nach dem Abstoppen der Trypsinierung, wurde der Überstand aus den
Flaschen gesammelt und bei 200 g für 10 min zentrifugiert. Das Ausplattieren auf die PONbeschichteten Deckgläschen erfolgte in einer Zelldichte von 1,5 x 104 in DMEM/Glutamax/PS.
Stimulation der Mikrogliazellen
Die Hälfte der in den Wellplatten kultivierten Mikrogliazellen wurde für 24 Stunden mit dem
antiinflammatorisch wirkenden
Zytokin IL-4
stimuliert.
Anschließend wurden einige
Mikrogliazellen, wie im Schema (Tabelle 7) dargestellt, für 18 Stunden mit dem
proinflammatorisch wirkenden LPS inkubiert.
Seite 23
Material und Methoden
Tabelle 7: Schema der Mikrogliastimulation
Kontrolle
1 µg/ml LPS
LPS + IL-4
10 ng/mg IL-4
Proteinbestimmung
Die quantitative Proteinbestimmung erfolgte mittels eines Lowry-Assays der Firma BioRad.
Prinzip der Lowry-Methode ist die Kombination zweier Reaktionen. Die erste, Biuretreaktion,
beruht auf der Bildung eines blau-violetten Komplexes zwischen Peptidbindungen und Kupfer
(II)-Ionen in alkalischer Lösung. In einem zweiten Schritt wird Kupfer (II) zu Kupfer (I) reduziert.
Kupfer (I) wiederum reduziert das gelbe Folin-Ciocalteu-Reagenz (Molybdän (VI)- und Wolfram
(VI)-Heteropolysäuren) zu Molybdänblau. Die Extinktion der Proben wird mittels Photometrie
bei 750 nm gemessen. Zur Erstellung der Proben wurden die Zellen zunächst für 15 min mit 30
µl/well von 1 % Triton in PBS lysiert. Der Assay wurde anschließend mit je 5 µl von diesen
Proben und den Standard-Proteinlösungen, mit BSA als Referenzprotein, nach Angaben des
Herstellers durchgeführt.
Die Standardlösungen wurden im selben Puffer angesetzt wie die Proben (1 % Triton in PBS).
Anschließend wurde BSA in diesem Puffer gelöst und auf die Konzentrationen 1,5 mg/ml, 1
mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml und 0 mg/ml verdünnt. Nach der Extinktionsmessung
konnte nun eine Standardkurve erstellt werden, anhand derer die Umrechnung auf die
Proteinkonzentration mg/ml erfolgte.
2.2.3 Zytokin-Assay
Um festzustellen inwieweit sich die Zytokin-Freisetzung aus den Mikrogliazellen verschiedener
Mausmodelle, in unterschiedlichem Alter, aber bei gleicher Stimulation unterscheidet, wurde im
Zellüberstand der Gehalt an IL-6 mittels eines entsprechenden Enzyme Linked Immunosorbent
Seite 24
Material und Methoden
Assay (ELISA) gemessen. ELISA ist ein immunologisches Nachweisverfahren, das auf einer
enzymatischen Farbreaktion basiert.
Zunächst wurden 96-well-ELISA-Platten mit einem spezifischen Antikörper (Capture antibody),
der in Coating buffer gelöst wurde, über Nacht beschichtet. Anschließend folgten vier
Waschschritte mit 300 µl Wash Buffer pro well für jeweils eine Minute. Nach einstündiger
Blockierung zum Absättigen unspezifischer Bindungen mit 1 % BSA in PBS bei Raumtemperatur
erfolgte die 2-stündige Inkubation mit je 100 µl der Zellüberstände bei Raumtemperatur. In
dieser Phase bindet der an die Platte gebundene Antikörper das im Zellüberstand vorhandene
Antigen.
Nach vier weiteren Waschschritten mit 300 µl um die ungebundenen Bestandteile der Probe zu
entfernen, wurden die Platten mit je 100 µl eines biotinylierten Antikörpers für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Dieser Antikörper dient als Detektions-Antikörper und bindet an ein
anderes Antigenepitop als der Capture-Antikörper. Nach weiteren vier Waschschritten mit je
300 µl Wash Buffer, um überschüssige Antikörper zu entfernen, erfolgte im Dunkeln die 30minütige Inkubation mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP, Horseradish Peroxidase),
welches an den biotinmarkierten Antikörper bindet. Nach fünf Waschschritten mit je 300 µl
Wash Buffer folgte abschließend die Inkubation mit TMB Substratlösung für 15 min im Dunkeln.
Dieses chromogene Substrat wird von der Meerrettichperoxidase zu einem Reaktionsprodukt
umgesetzt, welches durch einen Farbumschlag nachgewiesen werden kann. Die Farbreaktion
wurde abschließend mit 100 µl 2N Schwefelsäure gestoppt und die Absorption innerhalb von 30
min nach der Stopreaktion bei 450 nm photometrisch gemessen.
Um eine Kalibrierungskurve für die optische Extinktion zu erhalten, wurde eine Serie mit
bekannten Antigenkonzentrationen (0 pg/ml, 7,8 pg/ml, 15,6 pg/ml, 31,25 pg/ml, 62,5 pg/ml,
125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml) auf die oben beschriebene Art durchgeführt. Anhand der IL6-Kalibrierungskurve erfolgte die Umrechnung des Zytokingehalts in pg/ml.
2.2.4 Statistik
Die statistische Auswertung der Daten, aus mindestens drei unabhängigen Versuchen, wurde
mit dem Programm GraphPad Prism 5.01 für Windows durchgeführt. Es erfolgte zunächst die
deskriptive Statistik der Daten und dann die statistische Prüfung mit einer einfachen
Varianzanalyse (one-way ANOVA) und dem darauffolgenden Bonferroni's Multiple Comparison -
Seite 25
Material und Methoden
Posthoc-Test. Mittelwerte wurden jeweils mit Standardfehler (Mittelwerte ± SEM) angegeben.
Die Signifikanzniveaus wurden auf * p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 festgelegt.
2.2.5 Immunzytochemie
Es ist nicht auszuschließen, dass sich beim Ausplattieren der Mikrogliazellen auch Astrozyten
lösten und mitausplattiert werden. Um herauszufinden, wie rein die verwendeten
Mikrogliazellkulturen tatsächlich waren, wurden die auf den Deckgläschen ausplattierten Zellen
(15 x 104) zum einen mit einem Antikörper gegen „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP), einem
Intermediärfilament im Zytoplasma von Astrozyten, und zum anderen mit einem Antikörper
gegen das Oberflächenprotein CD11b, welches im ZNS nur auf Mikroglia-Zellen zu finden ist,
markiert. Zusätzlich wurden alle Zellkerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI, welcher selektiv
an nukleäre DNA bindet, gefärbt, um so die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
Protokoll der Immunfluoreszenz-Färbung
Die mit 15 x 104 Zellen ausplattierten Deckgläser wurden, nachdem sie 24 - 48 h (Mikroglia) bzw.
48 - 72 h (Astrozyten) inkubierten, aus den 24-well-Platten entnommen und zweimal mit PBS
gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 min fixiert und
dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,1 %
Triton für 5 min und weitere drei Waschschritte mit PBS. Dann wurde zum Absättigen
unspezifischer Bindungen für 15 min mit Blocking Buffer (1 % BSA in PBS) blockiert und über
Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper in Blocking Buffer inkubiert. Verwendet wurde „ratanti-mouse CD11b“ im Verhältnis 1:50 um Mikroglia zu markieren und „rabbit-anti-GFAP“ im
Verhältnis 1:200 um Astrozyten anzufärben. Am nächsten Tag wurden die Zellen zunächst
dreimal mit 0,05 % Tween 20 in PBS gewaschen und anschließend für 1 h bei Raumtemperatur
mit dem Sekundärantikörper in 0,1 % Tween 20 in PBS inkubiert. Die gebundenen
Primärantikörper wurden entsprechend mittels “Alexa Fluor 568-conjugted goat-anti-rat IgG“ im
Verhältnis 1:200 und „Alexa Fluor 488-conjugated goat-anti-rabbit IgG“ im Verhältnis 1:200
detektiert. Nach drei weiteren Waschschritten erfolgte abschließend das Eindeckeln auf
Objektträgern mit ca. 3 µl Vectashield versetzt mit DAPI.
Es wurden drei voneinander unabhängige Färbungen durchgeführt, je drei Fotos in 20 xVergrößerung erstellt und die mit DAPI-angefärbten Zellkerne gezählt. Auf diese Weise wurde
Seite 26
Material und Methoden
ermittelt, wieviele Zellen sich insgesamt in dem fotografierten Bereich befanden. Anschließend
wurden im selben Bereich die anti-CD11b bzw. die anti-GFAP markierten Zellen gezählt.
Dieses Vorgehen konnte bei den Zellkulturen aus den erwachsenen Mäusen nicht eingehalten
werden. Da aus einer Zellkulturflasche nur wenige Zellen zu gewinnen waren, wurde nur eine
exemplarische Auszählung anhand einer Färbung durchgeführt.
2.2.6 Phagozytose-Experimente
Gehirnschnitte
Das Material für die Gehirnschnitte von Alzheimer-Patienten wurde von der Pathologie Ulm zur
Verfügung gestellt. Es wurden 10 µm dicke Kryoschnitte angefertigt und auf Poly-D-Lysinbeschichteten Deckgläsern aufgebracht. Zwei dieser Deckgläser wurden mit Aqua-Mount auf
Objektträgern fixiert. Die Lagerung dieser Schnitte erfolgte bei - 80 °C.
Für die Experimente wurden die Deckgläser zunächst vorsichtig vom Objektträger entfernt und
Aqua-Mount mittels 70 % Ethanol entfernt. Anschließend wurden sie in die wells einer 24-well
Platte gelegt und dreimal vorsichtig mit DPBS gewaschen. Die abgeschüttelten Mikrogliazellen
wurden auf diesen Schnitten in einer Dichte von 15 x 104 Zellen pro well in DMEM/ 10 % FBS/PS
ausplattiert. Nach 2 Stunden wurde das Medium gewechselt. Nun wurde DMEM/PS in die wells
pipettiert. Die Stimulation der Mikroglia mit IL-4 erfolgte noch am selben Tag. 24 Stunden später
erfolgte die LPS-Stimulation. Nach weiteren 48 Stunden konnten die Zellen und Aß-Plaques
gefärbt bzw. der Gehirnschnitt samt Mikroglia für den Western-Blot lysiert werden.
Färbung der Aß-Plaques und Mikroglia
Die Zellen auf den Gehirnschnitten wurden zunächst einmal gewaschen, indem vom Rand
ausgehend vorsichtig PBS auf die Deckgläser pipettiert wurde. Anschließend wurden Gewebe
und Zellen mit 4 % PFA für eine Stunde fixiert. Nach drei Waschschritten mit PBS, wurden die
Zellen für 5 min mit Ameisensäure permeabilisiert. Es folgten drei weitere Waschschritte, bevor
über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 °C mit dem Primärantikörper gegen Mikrogliazellen
(rat - anti - mouse CD11b) im Verhältnis 1:50 in 0,1 % Tween 20 in PBS inkubiert wurde.
Am nächsten Tag erfolgte nach drei Waschschritten mit 0,05 % Tween 20 in PBS die einstündige
Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Alexa Fluor 568-conjugated goat-anti-rat IgG) und dem
biotinmarkierten Amyloid ß-Antikörper 4G8. Beide Antikörper wurden im Verhältnis 1:200 in
PBS 0,1 % Tween 20 verwendet. Dieser und alle anschließenden Schritte erfolgten im Dunkeln.
Seite 27
Material und Methoden
Nach dreimaligem Waschen mit 0,05 % Tween 20 in PBS wurde für 15 min mit Streptavidin
Alexa 488 im Verhältnis 1:200 in 0,1 % Tween 20 in PBS inkubiert. Es folgten drei weitere
Waschschritte mit 0,05 % Tween 20 in PBS, bevor die Deckgläser mit der Gewebeseite nach
unten mit einem Tropfen Vectashield versetzt mit DAPI auf den Objektträgern aufgebracht
wurden. Die anschließende Lagerung erfolgte bei 4 °C.
Die optische
Auswertung und Dokumentation der Präparate erfolgte unter dem
Fluoreszenzmikroskop und mittels Erstellung von Bildern in 10- bzw. 20-facher Vergrößerung.
Western Blot
Vorbereitung
Zur Herstellung der Lysate für einen Western Blot wurden die Gehirnschnitte mit den
ausplattierten Mikroglia zunächst einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 8M Urea und 1
µl Protease-Inhibitor-Cocktail für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden Gewebe und
Zellen mechanisch vom Deckglas gelöst.
Von den so entstandenen Lysaten wurde dann eine Protein-Bestimmung für den folgenden
Western Blot durchgeführt. Die Lysate wurden bei - 80 °C gelagert.
Probenaufbereitung und Elektrophorese
Die 16,5 %-Tricine-Fertiggele enthielten zehn Probetaschen, die mit jeweils 25 µl beladen
werden konnten. Nach dem Einspannen der Gele in eine Elektrophoreseapparatur wurde der
innere und äußere Puffertank mit Laufpuffer aufgefüllt und die Kämme vorsichtig aus dem Gel
entfernt.
Nach der Denaturierung der Proben, bestehend aus Ladepuffer und Lysat, im Thermomixer (10
min bei 99 °C) wurden die Geltaschen des Gels mit Hilfe einer Pipette gespült und mit 25 µl
beladen.
Der Ladepuffer wurde wie vom Hersteller empfohlen hergestellt, indem 20 µl ßMercaptoethanol zu 980 µl Tricine Sample Buffer hinzugefügt wurde. Die Lagerung erfolgte bei
- 20 °C. Das Verhältnis von Protein zu Ladepuffer sollte mindestens 1:2 betragen, wobei die
Proteinmenge zwischen 1 bis 30 µg liegen kann.
Da das Ziel dieses Western Blots die Quantifizierung von Aß-Protein in den einzelnen Proben
war, wurde als Positivkontrolle auch eine reine Aß-Protein-Probe angefertigt. Um das
Molekulargewicht der Proteinbanden bestimmen zu können, wurde zusätzlich zu den Proben
Seite 28
Material und Methoden
eine Tasche mit einer 1:1 Mischung aus zwei Molekulargewichtsmarkern, mit unterschiedlichem
Größenspektrum, beladen. Die Elektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 100 mA bis
die Blaubande des Ladepuffers das Gelende erreicht hatte. Die Elektrophoreseapparatur stand
während des gesamten Vorgangs auf Eis.
Das Prinzip dieses Verfahrens ist die Auftrennung von Proteinen, die durch eine Gelmatrix
wandern. Ein Gel auf Polyacrylamidbasis dient als Trennmedium. Zudem wird das anionische
SDS im Überschuss zu den Proteinproben hinzugegeben, um die Eigenladungen von Proteinen
zu überdecken bis sie eine konstante Ladungsverteilung aufweisen. Durch die anschließende
Denaturierung der Proteinkomplexe (10 min bei 99 °C) brechen Wasserstoffbrücken auf und
zerstören Sekundär- und Tertiärstrukturen. Zusätzlich wurde den Proben das im Ladepuffer
enthaltene ß-Mercaptoethanol zugegeben, das als reduzierende Substanz zusätzlich die
Disulfidbrücken in den Proteinen spaltet.
Dadurch ist die Laufgeschwindigkeit der Proteine im Gel nur noch von dem relativen
Molekulargewicht abhängig.
Proteintransfer
Nach der Auftrennung der Proteinlösung in einem SDS-Page können die Proteine aus dem Gel
durch Anlegen eines elektrischen Feldes auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran
übertragen und mittels spezifischer Antikörper selektiv nachgewiesen werden. Für den Transfer
der aufgetrennten Proteine wurde das Tankblottingverfahren verwendet. Hierfür wurden zwei
Stücke Whatman-Papier und eine in 100 % Methanol-aktivierte PVDF-Membran auf die Größe
des Trenngels zugeschnitten und in Transferpuffer getränkt. In Form eines Sandwichs wurde
anschließend das Stück Whatman-Papier, dann die PVDF-Membran, das Tricine-Gel und letztlich
ein weiteres Whatman-Papier unter Vermeidung von Luftblasen zwischen zwei Schwammtücher
zusammengefügt und in die Blotkammer eingespannt. Nachdem die Kammer mit Transferpuffer
gefüllt wurde, konnte der Proteintransfer durch Anlegen einer Stromstärke von 150 mA für 1 h
gestartet werden. Die Proteine wandern somit in Richtung Anode aus dem Gel heraus und
werden von der Membran gebunden.
Immunologischer Nachweis
Im Anschluss an den Transfer wurde die PVDF-Membran für 5 min in PBST gekocht, dreimal mit
PBST gewaschen und über Nacht bei 4 °C in einer Milchlösung (5 % Milchpulver in PBST)
Seite 29
Material und Methoden
blockiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzusättigen. Am folgenden Tag wurde die
Membran dreimal mit PBST gewaschen, bevor die Inkubation mit dem Primärantikörper gegen
Beta-Amyloid 1-16 (6E10) in PBST mit 1 % BSA und 0,05 % Natriumazid für 2 - 3 h erfolgte. Nach
der Inkubation wurde die Membran dreimal mit PBST gewaschen und anschließend für 1 h mit
dem Sekundärantiköper (anti-mouse IgG) im Verhältnis 1:2500 in PBST mit 2,5 % Milchpulver
inkubiert. Nach drei Waschschritten erfolgte die Detektion der Proteine mittels Enhanced
Chemiluminescence (ECL). Der Sekundärantiköper ist Peroxidase-konjugiert, welche die
Oxidation des Luminols in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid katalysiert.
Wie vom Hersteller beschrieben wurden die beiden Komponenten ECL-A und ECL-B im
Verhältnis 1:40 angesetzt und die PVDF-Membran in dieser Lösung für 1 min inkubiert.
Daraufhin wurde die Membran in eine Plastikfolie gelegt und auf einen Röntgenfilm zur
Exposition in eine Röntgenfilmkassette gelegt. Bei geschlossener Kassette wurde für mindestens
eine Minute belichtet und der Film anschließend in der Dunkelkammer entwickelt.
Seite 30
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Etablierung von primären Mikrogliazellkulturen
Sowohl an Mikrogliazellen neugeborener Mäuse, die sich relativ leicht aus den Kulturflaschen
ernten ließen, als auch an Mikroglia von erwachsenen/ Endstadium-Tieren, die nur durch
Trypsinierung vom Astrozytenrasen zu lösen waren, wurden immunzytochemische Färbungen
durchgeführt. Es ist nicht auszuschließen, dass sich beim Ausplattieren der Mikrogliazellen auch
Astrozyten lösen und mitausplattiert werden. Dies ist insbesondere bei einer relativ aggressiven
Methode, wie der Trypsinierung wahrscheinlich. Um herauszufinden, wie rein die verwendeten
Mikrogliazellkulturen tatsächlich waren, wurden die auf den Deckgläschen ausplattierten Zellen
zum einen mit einem Antikörper gegen das Oberflächenprotein CD11b, welches im ZNS nur auf
Mikrogliazellen zu finden ist, und zum anderen mit einem Antikörper „glial fibrillary acidic
protein“ (GFAP), einem Intermediärfilament im Zytoplasma von Astrozyten, markiert. Zusätzlich
wurden alle Zellkerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol),
welcher selektiv an nukleäre DNA bindet, markiert, um so die Gesamtzahl der ausplattierten
Zellen zu bestimmen. Exemplarisch wurden am Fluoreszenzmikroskop Übersichtsbilder von
Wildtyp - Mikrogliazellen junger und alter Mäuse in 20-facher Vergrößerung angefertigt.
Die immunzytochemische Färbung primärer Mikroglia neugeborener Mäuse mit anti-CD11b und
anti-GFAP erfolgte 24 - 48 h nach dem Ausplattieren der Zellen. Die Auszählung der anti-CD11bmarkierten Zellen ergab eine Reinheit von 90,3 ± 4,9 % Mikrogliazellen in den Kulturen (Abb. 4).
Die astrozytenspezifische GFAP-Färbung markierte korrespondierend dazu lediglich 1 ± 0,9 %
der Zellen (Abb. 4).
Seite 31
Ergebnisse
a.
CD11b
b.
GFAP
c.
DAPI
d.
DAPI
Abbildung 4: Immunzytochemische Darstellung von Mikrogliazellkulturen neonataler Mäuse
Mittels immunzytochemischer Markierung des Oberflächenproteins CD11b (a.) konnten Mikroglia detektiert
werden. Durch Markierung von „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) (b.), einem Intermediärfilament im Zytoplasma
von Astrozyten konnten Astrozyten identifiziert werden. Zusätzlich wurden alle Zellen mit DAPI (4′,6-Diamidino-2phenylindol) markiert um Zellkerne darzustellen (c., d). Am Fluoreszenzmikroskop wurden Übersichtsbilder in 20facher Vergrößerung aufgenommen.
3.2 Astrozytenkulturen
Die Astrozyten wurden nach dem Abschütteln von Mikroglia gewonnen, indem der in den
Zellkulturflaschen verbliebene Astrozytenrasen, durch Zugabe von Trypsin in das Medium,
gelöst wurde. Die immunzytochemische Markierung von CD11b und GFAP erfolgte im Gegensatz
zu den Mikroglia erst 48 - 72 h nach dem Ausplattieren der Zellen.
Da Astrozyten im Vergleich zu Mikroglia verstärkt Zellklumpen bildeten und teilweise Ausläufer
aufwiesen, gestaltete sich die Auszählung schwieriger. Die anti-CD11b-Markierung von
Astrozyten (Abb. 5 a.) zeigte bei gleicher Belichtungszeit ein im Vergleich zu Mikrogliazellen
schwächeres, aber doch erkennbares Signal. Die anti-GFAP-Markierung (Abb. 5 b.) zeigte bei
Seite 32
Ergebnisse
Astrozyten ein kräftiges, grün fluoreszierendes Signal, das bei Mikrogliazellen nicht vorhanden
war. Die Auszählung der anti-GFAP-markierten Zellen ergab, dass 67,3 ± 3,8 % der
abtrypsinierten und ausplattierten Zellen Astrozyten waren (Abb. 5).
a.
CD11b
b.
GFAP
c.
DAPI
d.
DAPI
Abbildung 5: Immunzytochemische Darstellung von Astrozyten neonataler Mäuse
Die anti-CD11b-Markierung von Astrozyten (Abb. a.) zeigte bei gleicher Belichtungszeit ein im Vergleich zu
Mikrogliazellen schwächeres, aber erkennbares Signal. Die anti-GFAP-Markierung (Abb. b.) zeigte ein stark grün
fluoreszierendes Signal, mit dem Astrozyten identifiziert werden konnten. Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl
wurden zusätzlich alle Zellkerne mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) markiert (c.,d.). Am Fluoreszenzmikroskop
wurden Übersichtsbilder in 20-facher Vergrößerung aufgenommen.
3.3 Mikrogliazellkulturen erwachsener/Endstadium-Mäuse
Die immunzytochemische Markierung von CD11b und GFAP der Zellen aus Mikrogliazellkulturen
erwachsener/Endstadium-Mäuse erfolgte ebenso wie bei den primären Mikrogliazellen 24 - 48
h nach dem Ausplattieren. Eine exemplarische Auszählung in 40-facher Vergrößerung ergab,
dass es sich bei 30 % der Zellen in den Kulturen um Astrozyten handelte (Abb. 6). Anders als bei
den jungen Astrozyten zeigten die alten Astrozyten ihre typische stern- bzw. spinnenförmig
verzweigte Morphologie (Abb. 6b.). Die anti-CD11b-Markierung zeigte jedoch entgegen den
Seite 33
Ergebnisse
Erwartungen auch bei morphologisch eindeutig als Astrozyten identifizierbaren Zellen ein
positives Signal (Abb. 6a). Insgesamt waren die Mikrogliazellkulturen erwachsener Mäuse somit
mit mehr Astrozyten versetzt als die Kulturen aus neugeborenen Mäusen. Dies ist durch die
Trypsinierung, mit der die festsitzenden „alten“ Mikroglia vom Astrozytenmonolayer gelöst
wurden, zu erklären. Bei den restlichen ca. 70 % der Zellen handelt es sich um Mikroglia und
sonstige Gliazellen.
a.
b.
GFAP
DAPI
Abbildung 6: Immunzytochemische Darstellung von Mikrogliazellkulturen erwachsener Mäuse
Durch Markierung von „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) (b.) konnten Astrozyten identifiziert werden. Diese
zeigten ihre typische, stern- bzw. spinnenförmige Morphologie. Die immunzytochemische Markierung des
Oberflächenproteins CD11b (a.) führte sowohl zu einem Signal von Mikroglia als auch Astrozyten. Zusätzlich
wurden alle Zellenkerne mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) markiert (b.). Am Fluoreszenzmikroskop wurden
Übersichtsbilder in 40-facher Vergrößerung aufgenommen.
3.4 Unterschiede der IL-6-Produktion zwischen Mikroglia neugeborener und alter Mäuse
Um festzustellen, inwieweit sich die Zytokin-Freisetzung aus den Mikrogliazellen verschiedener
Mausmodelle, in unterschiedlichem Alter, aber bei gleicher Stimulation unterscheidet, wurde im
Seite 34
Ergebnisse
Zellüberstand der Gehalt an IL-6 mittels eines entsprechenden Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA) gemessen.
3.4.1 Interleukin 6-Produktion nativer Mikrogliazellkulturen
Bereits ohne jegliche Stimulation zeigte sich bei den Zellkulturen erwachsener Wildtyp (WT)und SOD1 (Cu/Zn Superoxid Dismutase 1)-Mäuse ein deutlich höheres IL-6-Niveau im Vergleich
zu den Jungtieren. Insbesondere beim SOD1-Modell war die produzierte IL-6-Menge im
Zellüberstand alter Mikrogliazellen signifikant höher als bei den Jungtiermikroglia (Abb. 7).
Interleukin-6 (pg / mg Protein)
Wildtyp
SOD 1 - Mausmodell
**
2500
2000
1500
1000
500
0
jung
alt
jung
alt
Abbildung 7: IL-6-Menge von neugeborenen und erwachsenen Wildtyp- sowie SOD1-Mäusen ohne Stimulation
Mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Proteinbestimmung wurde als Referenz die Interleukin-6Menge in pg/mg Protein aus den Mikrogliazellkulturen neugeborener und erwachsener Wildtyp- sowie SOD-Mäuse
bestimmt. Die Mikrogliazellen der erwachsenen Tiere produzieren bei gleicher Zelldichte und ohne jegliche
Stimulation deutlich mehr IL-6 als die Mikrogliazellen der jeweiligen Jungtiere (n=12-19). Die Ergebnisse sind in
Mittelwerten ± SEM dargestellt. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001.
3.4.2 Klassische Aktivierung von Mikrogliazellkulturen junger und alter Wildtyp (WT)-Mäuse
Die 18-stündige Stimulation junger und alter WT-Mikrogliazellen mit dem proinflammatorisch
wirkendem Lipopolysaccharid (LPS) führte in beiden Altersgruppen zu einer signifikant höheren
Ausschüttung von IL-6 im Vergleich zu Mikrogliazellen, die nicht (Kontrolle, Kon) oder mit dem
antiinflammatorisch wirkenden Interleukin-4 (IL-4) vorbehandelt wurden (Abb. 8).
Seite 35
Ergebnisse
Zudem zeigte sich auch hier, dass das Interleukin-6-Niveau der Mikrogliazellen erwachsener WTMäuse in den unterschiedlichen Stimulationsgruppen höher war, als das der jungen
*
*
25000
Wildtyp jung
*
*
20000
Wildtyp alt
15000
10000
5000
LP
S
IL
-4
on
K
LP
S
K
IL
-4
0
on
Interleukin-6 (pg / mg Protein)
Mikrogliazellen (Abb. 8).
Abbildung 8: Signifikante Interleukin-6 (IL-6)-Ausschüttung von Mikrogliazellen neugeborener und erwachsener
Wildtyp-Mäuse nach Lipopolysaccharid (LPS)-Stimulation
Mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) und Proteinbestimmung wurde als Referenz die IL-6-Menge in
pg/mg Protein aus den Mikrogliazellkulturen neugeborener und erwachsener Wildtyp-Mäuse ohne, nach
Interleukin-4 und nach LPS-Stimulation bestimmt. Die Mikrogliazellen produzierten bei gleicher Zelldichte nach LPSStimulation signifikant mehr IL-6 (n=9-13). Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt. *= p < 0,05; **= p
< 0,01; ***= p < 0,001.
3.4.3 Alternative Aktivierung von Mikrogliazellkulturen junger und alter Wildtyp-Mäuse
Um festzustellen, ob es Unterschiede bezüglich der alternativen Aktivierung von Mikrogliazellen
junger und alter WT-Mäuse gibt, wurden Mikroglia für 6 h mit dem antiinflammatorisch
wirkenden Zytokin IL-4 (10 ng/mg) stimuliert. Anschließend wurden diese Mikrogliazellen
zusätzlich für 18 Stunden mit dem proinflammatorisch wirkenden LPS (1 µg/ml) inkubiert (siehe
Tabelle 7, S. 24).
Die mit IL-4 vorbehandelten primären WT-Mikrogliazellen produzierten nach LPS-Stimulation
signifikant weniger IL-6 als diejenigen Zellen nach alleiniger, 18-stündiger LPS-Stimulation. Die
gleiche Versuchsdurchführung mit Mikrogliazellen erwachsener WT-Mäuse führte, trotz
Seite 36
Ergebnisse
vorangegangener IL-4-Stimulation, zu keiner signifikanten Reduktion der IL-6-Produktion nach
Wildtyp jung
150
Wildtyp alt
***
100
50
IL
-4
+
LP
S
+
LP
S
LP
S
IL
-4
0
LP
S
Interleukin-6 (% von Lipopolysaccharid)
LPS-Stimulation (Abb. 9).
Abbildung 9: Alternative Aktivierung bei Mikrogliazellen neugeborener und erwachsener Wildtyp (WT)-Mäuse
Mikrogliazellen wurden für 6 Stunden mit 10 ng/mg Zytokin Interleukin-4 stimuliert. Anschließend wurde ein Teil
dieser Mikroglia sowie unbehandelte Mikroglia für 18 Stunden mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert. Die
Bestimmung der Interleukin-6-Menge aus dem Zellüberstand erfolgte mittels eines Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA). Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt; n=12-19 wells. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***=
p < 0,001.
3.4.4 Alternative Aktivierung am SOD1-Mausmodell für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)
Um herauszufinden, wie es sich bezüglich der alternativen Aktivierung im Mausmodell für ALS
verhält, wurden wie bereits oben beschrieben auch die Mikrogliazellen neugeborener und
erwachsener SOD1-Mäuse (SOD1-G93A) zunächst für 6 Stunden mit IL-4 vorbehandelt und
anschließend für 18 Stunden mit dem proinflammatorisch wirkenden LPS stimuliert. Die
Auswertung zeigte, dass es in beiden Altersgruppen trotz Vorbehandlung mit dem
antiinflammatorischen IL-4 zu keiner signifikanten Hemmung der LPS-induzierten IL-6Produktion kam (Abb. 10).
Seite 37
SOD 1 jung
SOD 1 alt
150
100
50
IL
-4
+
LP
S
IL
-4
+
LP
S
LP
S
0
LP
S
Interleukin-6 (% von Lipopolysaccharid)
Ergebnisse
Abbildung 10: Alternative Aktivierung von Mikrogliazellen neugeborener und erwachsener SOD (Cu/Zn Superoxid-Dismutase 1)-Mäuse (SOD1- G93A)
Nach 6-stündiger Interleukin-4-Stimulation (10 ng/mg) wurde ein Teil dieser Mikrogliazellen sowie unbehandelte
Mikroglia für 18 Stunden mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert und die Interleukin-6-Menge aus dem
Zellüberstand bestimmt. Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt; n=12-21 wells; *= p < 0,05; **= p <
0,01; ***= p < 0,001.
3.4.5 Alternative Aktivierung am Mausmodell für Chorea Huntington (R6/2)
Um herauszufinden, ob es auch im Mausmodell für Chorea Huntington Hinweise für eine
unzureichende alternative Aktivierung gibt, wurden die Mikrogliazellen neugeborener R6/2Mäuse ebenfalls für 6 Stunden mit IL-4 vorbehandelt und anschließend teilweise für weitere 18
Stunden mit dem proinflammatorisch wirkenden LPS stimuliert. Auch hier kam es zu keiner
signifikanten Reduktion der LPS-induzierten IL-6-Ausschüttung nach vorangegangener IL-4Stimulation (Abb. 11).
Da es bereits bei den erwachsenen WT- als auch den erwachsenen SOD1-Mikrogliazellen zu
keiner relevanten Herabsetzung der LPS-induzierten IL-6-Produktion nach IL-4-Vorbehandlung
kam, wurde darauf verzichtet das Experiment nochmals an den Zellen erwachsener R6/2-Tiere
durchzuführen.
Seite 38
R6/2 jung
150
100
50
0
LP
S
+
IL
-4
LP
S
Interleukin-6 (% von Lipopolysaccharid)
Ergebnisse
Abbildung 11: Alternative Aktivierung von Mikrogliazellen neugeborener R6/2-Mäuse (Mausmodell für Chorea
Huntington)
Stimulation der Mikrogliazellen für 6 Stunden mit 10 ng/mg Zytokin Interleukin-4. Anschließend wurde ein Teil
dieser vorbehandelten Mikroglia sowie unbehandelte Mikrogliazellen für 18 Stunden mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid
(LPS) inkubiert. Die Interleukin-6 (IL-6)-Menge wurde aus dem Zellüberstand mittels eines Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt; n=14-19 wells; *= p
< 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001.
3.5 Phagozytose
Um herauszufinden, ob die alternative Aktivierung Einfluss auf die Phagozytosefähigkeit von
Mikrogliazellen hat, wurden primäre Mikroglia von C57BL/6-Mäusen auf Gehirnschnitten von
Alzheimerpatienten aufgebracht und nach dem gleichen Schema wie für die Zytokinbestimmung
entweder gar nicht (Kon), nur antiinflammatorisch mit 10 ng/mg IL-4, nur proinflammatorisch
mit 1 µg/ml LPS oder mit 10 ng/mg IL-4 und anschließend mit 1 µg/ml LPS stimuliert. Die
Stimulation der Mikroglia mit IL-4 erfolgte am Tag der Ausplattierung. 24 h später erfolgte die
LPS-Stimulation. Nach weiteren 48 h erfolgte die immunhistochemische Färbung der Aß-Plaques
mit dem biotinmarkierten Amyloid ß-Antikörper 4G8 (grün) und der Mikrogliazellen mit dem
Antikörper gegen CD11b (rot). Zusätzlich wurden alle Zellkerne mit DAPI markiert (blau).
Die Kontrollaufnahme in 10-facher Vergrößerung (Abb. 12.) zeigte hauptsächlich schmale Zellen
mit mehreren langgestreckten Ausläufern. Es war keine Gruppierungstendenz um die AßSeite 39
Ergebnisse
Plaques
nachzuweisen.
Einzelne
Zellen
erschienen
vergrößert
(weißer
Pfeil).
Die
antiinflammatorische IL-4-Stimulation zeigte sich zellmorphologisch identisch zu den ruhenden
Mikroglia aus der Kontroll-Aufnahme. Durch die IL-4-Stimulation war kein Effekt erkennbar. Im
Gegensatz dazu führte die proinflammatorische Aktivierung mit LPS zu einer deutlichen
Veränderung der Zellmorphologie. Die Aufnahme in 20-facher Vergrößerung zeigte deutlich
vergrößerte und abgerundete Zellsoma. Die Aufnahme nach IL-4-Stimulation mit anschließender
Aktivierung durch LPS zeigte ein ähnliches Bild. Die Soma erschienen aufgetrieben und rundlich
bis oval. In keiner der Aufnahmen war eine deutliche Gruppierungstendenz um Aß-Plaques oder
sichtbare Phagozytose nachweisbar (Abb. 12).
Kon
10 ng/mg IL-4
1 µg/ml LPS
10 ng/mg IL-4
+ 1 µg/ml LPS
Abbildung 12: Markierung der Aß-Plaques und Mikroglia
Auf Gehirnschnitten von Alzheimerpatienten wurden primäre Mikroglia aufgebracht und proinflammatorisch mit 1
µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) oder antiinflammatorisch mit 10 ng/mg Interleukin-4 stimuliert. Anschließend
erfolgte die immunhistochemische Färbung der Aß-Plaques mit dem biotinmarkierten Amyloid ß-Antikörper 4G8
(grün) und der Mikrogliazellen mit dem Antikörper gegen CD11b (rot). Zusätzlich wurden alle Zellkerne mit DAPI
markiert (blau). Die optische Auswertung und Dokumentation der Präparate erfolgte unter dem
Fluoreszenzmikroskop und mittels Erstellung von Bildern in 10- bzw. 20-facher Vergrößerung.
Seite 40
Diskussion
4 Diskussion
In der vorliegenden, experimentellen Arbeit wurde untersucht, ob Mikrogliazellen aus
Mausmodellen für Morbus Huntington (R6/2) und ALS (SOD 1) eine Inhibition der alternativen
Aktivierung zeigen. Uns interessierte hierbei auch, ob es Unterschiede in der alternativen
Aktivierung zwischen jungen und alten Mikroglia gibt, da Alter den Hauptrisikofaktor für
neurodegenerative Erkrankungen darstellt. Die Experimente wurden deshalb an den
Mikrogliazellen von neugeborenen, noch gesunden Mäusen, und den Mikrogliazellen von
erwachsenen Mäusen, teilweise im Endstadium ihrer Erkrankung, durchgeführt. Im Hinblick auf
die Pathogenese von Alzheimer wurde zudem untersucht, ob die alternative Aktivierung Einfluss
auf die Aß-Phagozytosefähigkeit von Mikrogliazellen hat.
4.1 Erhöhter Inflammationsstatus von Mikrogliazellen im Alter
Mikrogliazellen alter Mäuse zeigen ein deutlich höheres Inflammationssniveau als junge
Mikroglia. In unseren Experimenten wurde dies dadurch bestätigt, dass bereits ohne jegliche
Stimulation sowohl bei den erwachsenen WT- als auch bei den erwachsenen SOD1-Mäusen im
Vergleich zu den Jungtieren eine deutlich höhere IL-6-Menge im Zellüberstand der
Mikrogliazellkulturen nachgewiesen werden konnte. Es gibt bereits signifikante klinische und
experimentelle Ergebnisse, die zeigen, dass ZNS-Inflammation im Alter zunimmt. Ein
Kennzeichen des Alterungprozesses im Gehirn ist erhöhter oxidativer Stress und
Lipidperoxidation. Daher besagt eine Hypothese, dass die Akkumulation freier Radikale im Laufe
der Zeit zu einer progredienten Inflammation im Gehirn führt. Für diese Hypothese spricht, dass
eine Unzahl von Microarray -Studien zeigte, dass es zu einem Anstieg von inflammatorischen
und prooxidativen Genen und gleichzeitig zu einer Reduktion von antioxidativen Genen in den
Gehirnen alter Nagetiere kommt (Lee et al. 1999; Norden u. Godbout 2013). Zudem wurden in
den Gehirnen alter Nagetiere erhöhte Zytokinlevel, z. B. von IL-1und IL-6 (Ye u. Johnson 1999;
Sierra et al. 2007) sowie eine Reduktion mehrerer antiinflammatorischer Zytokine, wie IL-10 und
IL-4 (Ye u. Johnson 2001; Maher et al. 2005) nachgewiesen.
Bei der Herstellung der Zellkulturen bestanden deutliche Unterschiede zwischen jungen und
alten Mikrogliazellen. Hervorzuheben ist insbesondere, dass die Kultivierung der alten Mikroglia
wesentlich länger (Wochen bis Monate) dauerte und dass die alten Mikrogliazellen nur durch
das Hinzufügen von Trypsin in das Medium vom Astrozytenrasen zu lösen waren. Letztendlich
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Diskussion
bestanden in den durchgeführten Experimenten die Mikrogliazellkulturen alter Mäuse zu ca. 70
% und die Kulturen jungen Mäusen zu ca. 90 % aus Mikroglia. Man kann zwar davon ausgehen,
dass die erzielten Ergebnisse vor allem durch die Stimulation von Mikrogliazellen zu erklären
sind, teilweise jedoch auch durch den Einfluss anderer Zellen (Astrozyten und Fibroblasten) in
den Kulturen möglich sind. Astrozyten beispielsweise scheinen im Alter ebenfalls einen
erhöhten Inflammationsstatus aufzuweisen. Zum Beispiel kommt es im Gehirn alter Nagetiere
und Menschen zu einer vermehrten Expression von GFAP (Nichols et al. 1993; Eng et al. 2000;
Cotrina u. Nedergaard 2002). Der altersassoziierte GFAP-Anstieg ähnelt dem Profil aktivierter
Astrozyten bei ZNS-Inflammation und traumatischen ZNS-Verletzungen (Eng et al. 2000; Pekny
u. Pekna 2004). Insgesamt deuten diese experimentellen und klinischen Daten darauf hin, dass
Astrozyten im Alter ein höheres inflammatorisches Profil zeigen. Da Astrozyten direkt mit
Neuronen
und
Mikrogliazellen
kommunizieren,
kann
ein
„inflammatorischer“
Astrozytenphänotyp potentiell Mikrogliaregulation beeinflussen (Tichauer et al. 2007). Zudem
sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich. Altersbedingte
Veränderungen in Astrozyten könnten daher die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke, vor allem
unter inflammatorischen Bedingungen und bei neurodegenerativen Erkrankungen, beeinflussen
(Zlokovic 2008; Popescu et al. 2009). Astrozyten sezernieren zusätzlich Zytokine und Chemokine,
die den Zweck erfüllen periphere Immunzellen in das Gehirn zu rekrutieren. Ein Beispiel hierfür
ist der Wachstumsfaktor TGF-β1 (transforming growth factor), der zu einer erhöhten Expression
von MCP-1 (CCL2) auf Astrozyten führt. Da TGF-ß die GFAP-Expression während der
Differenzierung steigert, könnte dies die zunehmende GFAP-Expression von Astrozyten im alten
Gehirn erklären (Norden u. Godbout 2013).
Weiterführende
Experimente
mit
Astrozytenkulturen
unterschiedlichen
Alters
unter
Bestimmung von proinflammatorischen Interleukinen, wie IL-6, könnten dazu beitragen die
Rolle von Astrozytenaktivierung bei Neuroinflammation zu klären.
Des Weiteren gilt es zu bedenken, dass die unterschiedliche Verfahrensweise bei der
Zellkultivierung möglicherweise Einfluss auf die Zytokinausschüttung hatte und somit auch die
unterschiedlichen Ergebnisse zwischen Mikrogliazellen neugeborener und erwachsener Mäuse
beeinflusst haben könnte. Bei der relativ aggressiven Methode des Abtrypsinierens der alten
Mikrogliazellen vom Astrozytenrasen sind sicherlich auch Zellen zugrunde gegangen und haben
mit der Ausschüttung von intrazellulären Bestandteilen zur Mikrogliaaktivierung beigetragen.
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Diskussion
Mikroglia reagieren bekanntermaßen auf Moleküle, die normalerweise nicht im gesunden ZNS
zu finden sind, wie z.B. Blutgerinnungsfaktoren und intrazelluläre Bestandteile aus nekrotischen
Zellen (z.B. DNA, RNA), Immunglobulin-Antigen-Komplexe oder Opsonisierungskomplemente
(Hanisch u. Kettenmann 2007).
4.2 Gehemmte alternative Aktivierung und gesteigerte Neuroinflammation bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie im Alter
Die alternative Aktivierung scheint an den Mausmodellen für neurodegenerative Erkrankungen
wie ALS und Morbus Huntington sowie allgemein im Alter gehemmt zu sein. In unseren
Experimenten konnte gezeigt werden, dass die mit IL-4 vorbehandelten primären WTMikrogliazellen nach LPS-Stimulation signifikant weniger IL-6 produzierten als diejenigen Zellen,
welche lediglich mit LPS stimuliert wurden. Die Mikrogliazellen erwachsener WT-Mäuse,
neugeborener und erwachsener SOD1-Mäuse (SOD1-G93A) sowie neugeborener HD-Mäuse
(R6/2) zeigten bei gleicher Stimulation hingegen keine signifikante Reduktion der LPSinduzierten IL-6-Produktion nach vorangegangener Inkubation mit dem antiinflammatorisch
wirkenden IL-4, was auf eine Dysfunktion der alternativen Aktivierung hinweist.
Eine Rolle bei der Inhibition der antiinflammatorisch-wirkenden, alternativen Aktivierung bei
neurodegenerativen Erkrankungen könnten mitochondriale Dysfunktionen von Mikrogliazellen
spielen. Anhand von Experimenten an primären Mikroglia konnte gezeigt werden, dass
mitochondriale Toxine (3-nitropropionic acid (3-NP) und Rotenon), die bekanntermaßen beim
Menschen und in Tierexperimenten zu Neurodegeneration führen, keinen Einfluss auf die LPSinduzierte Aktivierung haben, indem die Ausschüttung von Tumornekrosefaktor-α (TNF- α), IL-6
und IL-1β gemessen wurde. Dagegen erschien die IL-4-induzierte, alternative Aktivierung
teilweise inhibiert, was anhand von Messungen der Arginaseaktivität, der Expression von
insulin-like growth factor 1 (IGF-1) und der Reduktion der LPS-induzierten Zytokinausschüttung
belegt werden konnte (Ferger et al. 2010).
Eine Inhibition der alternativen Mikrogliaaktivierung könnte wiederum die anhaltende,
chronische Neuroinflammation bei neurodegenerativen Erkrankungen erklären.
Neurodegenerative Erkrankungen wie Multiple Sklerose, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson,
Morbus Huntington, ALS, usw. stehen bekanntlich in Zusammenhang mit chronischer
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Diskussion
Neuroinflammation (Block u. Hong 2005; Mrak u. Griffin 2005). Neuropathologische und
neuroradiologische Studien deuten darauf hin, dass neuroinflammatorische Veränderungen
bereits dann bestehen, wenn es noch zu keinem signifikanten Untergang von Neuronen im
Verlauf der Erkrankung gekommen ist (Frank-Cannon et al. 2009).
Im Hinblick auf die Huntington-Erkrankung konnte in Studien unter anderem gezeigt werden,
dass es während des Krankheitsverlaufs sowohl peripher als auch im ZNS zu einer Inflammation
kommt. Am R6/2-Mausmodell für Huntington konnten erhöhte Serumspiegel von IL-6 und
konsekutiv
auch
erhöhte
IL-6-Effektoren
wie
Alpha-2-macroglobulin
(A2M)
und
Komplementfaktoren nachgewiesen werden (Dalrymple et al. 2007). Im ZNS konnten mittels
Genexpressionsanalysen einiger Gehirnregionen bei Huntington-Patienten im Vergleich zu
Kontrollen mehr Gliosen und eine erhöhte Expression von Genen, die mit Inflammation in
Zusammenhang stehen, wie GFAP und Komplementfaktoren, nachgewiesen werden. Diese
Veränderungen waren insbesondere im Putamen und Nucleus caudatus nachzuweisen, wo die
Pathologie bei Huntington auch am Ausgeprägtesten ist (Hodges et al. 2006).
Mehrere Studien weisen auf ein verändertes Immunprofil bei der Huntington-Erkrankung hin
bereits vor dem Auftreten erster klinischer Symptome, was dafür sprechen könnte, dass
striatale und kortikale Neurodegeneration durch Inflammation verschlimmert werden könnte.
Zum Beispiel weisen die Plasmaproben von Huntington-Genträgern bereits vor dem Auftreten
klinischer Symptome erhöhte Spiegel proinflammatorischer Zytokine auf, welche an der
angeborenen Immunantwort beteiligt sind. Forschern war es sogar möglich zwischen Kontrollen
und präsymptomatischen Huntington-Genträgern zu unterscheiden, indem die Spiegel
bestimmter Zytokine (IL-5, IL-6 und IL-10) im Plasma bestimmt wurden (Bjorkqvist et al. 2008).
In Gehirnen von Genträgern von mutiertem Huntingtin sind Mikroglia vor dem Auftreten von
Symptomen aktiviert, wobei eine vermehrte Mikrogliaaktivierung in Zusammenhang steht mit
einer erhöhten Chance Huntington-Symptome in den nächsten 5 Jahren zu entwickeln (Tai et al.
2007). Und bei manifesten Symptomen korreliert die Mikrogliaaktivierung mit der Schwere der
Erkrankung (Sapp et al. 2001; Pavese et al. 2006).
In Hinblick auf ALS zeichnen sich die Areale mit untergehenden Neuronen bei ALS-Patienten und
an ALS-Mausmodellen durch die Anwesenheit von Zytokinen, Immunzellen, einschließlich TZellen, aktivierten Mikroglia und Astrozyten aus (Kawamata et al. 1992; Henkel et al. 2004).
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Diskussion
Zudem konnte mittels PET-Bildgebung bei ALS-Patienten ein Anstieg aktivierter Mikroglia im
Motorkortex nachgewiesen werden, was mit motorischen Symptomen korreliert (Turner et al.
2004). In manchen ALS-Modellen bestimmt die Anwesenheit von Immunzellen den Phänotyp
der Erkrankung und das Chemokin MCP-1, ein potenter Stimulus von Mikroglia, ist im Liquor von
ALS-Patienten erhöht (Henkel et al. 2004; Kuhle et al. 2009), was darauf hindeuten könnte, dass
Neuroinflammation zum Krankheitsprogress beiträgt. Zudem korrelieren die im Serum von ALSPatienten erhöhten Spiegel von Inflammationsmarkern mit der Schwere der Behinderung
(Keizman et al. 2009). Multiple Genloci wurden bereits als ursächlich für die familiäre Form der
ALS identifiziert, 20 % der familiären Fälle beinhalten eine „gain-of-function“-Mutation in der
SOD 1 (Rosen 1993). Abgesehen von der gut bekannten Rolle von SOD1 als kritisches
antioxidatives Enzym gibt es auch Hinweise darauf, dass ein Anteil seiner normalen Funktion
darin
besteht
Proteinaggregation
zu
vermeiden,
ein
Phänomen,
das
bekanntlich
Neurodegeneration beschleunigt. Jedoch legen einige Studien nahe, dass SOD1-Mutationen in
Neuronen allein nicht ausreichen um ALS zu verursachen und dass Dysfunktionen von Gliazellen
zu Krankheitsentwicklung und Fortschreiten beitragen (Pramatarova et al. 2001; Lino et al.
2002; Clement et al. 2003; Sargsyan et al. 2005). Ablation der Mikrogliaexpression von
mutantem SOD 1 (mSOD1) oder Knochenmarktransplantation von Wildtyp-Mäusen in mSOD1Mäuse führten zu einer längeren Lebensdauer der mutierten Mäuse (Beers et al. 2006; Boillee
et al. 2006). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SOD1-Mutationen indirekt zum
Neuronenuntergang beitragen, indem eher Gliazellen als Neurone beeinflusst werden.
Übereinstimmend damit konnte gezeigt werden, dass mSOD1-Mäuse, die mit LPS stimuliert
wurden mehr inflammatorische Mediatoren, wie TNF (Weydt et al. 2004), MCP-1, TGF-β (Henkel
et al. 2004) und IFN-γ (Ferri et al. 2004), ausschütten als Kontrollmäuse. TNF-Spiegel korrelieren
mit dem Schweregrad des Motoneuronenuntergangs in ALS-Mausmodellen (Elliott 2001) und
beide TNF-Rezeptoren sind im Serum von ALS-Patienten erhöht (Poloni et al. 2000). In
präklinischen Studien an Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass bestimmte antiinflammatorische Behandlungen, die darauf abzielen Mikrogliaaktivierung zu supprimieren, bei
Mäusen,
die
humanes,
mutiertes
SOD1
exprimieren,
zu
einer
Verlängerung
der
Lebenserwartung um mehr als 30 % führten (West et al. 2004).
4.3 Phagozytose von Aß-Plaques bei Alzheimer
Die Alzheimer-Erkrankung unterscheidet sich von anderen neurodegenerativen Erkrankungen
durch das Vorhandensein von extrazellulären Ablagerungen seniler Amyloid-Plaques. Senile
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Diskussion
Plaques können in Alzheimer-Gehirnen in unterschiedlichen Alterungsstadien, von diffus bis
dicht konfiguriert auftreten, enthalten aber alle das Amyloid beta Protein (Aß). Aß-Peptid bildet
unlösliche, pathologische, extrazelluläre Aggregate, die Mikroglia anzuziehen scheinen, da sich
Mikroglia um Aß-Ablagerungen zusammenlagern (Streit 2004). Experimentelle Studien an Tieren
geben Hinweise darauf, dass Mikroglia Amyloid phagozytieren und abbauen können (Frautschy
et al. 1992; Weldon et al. 1998), aber die Phagozytose bei der Alzheimer-Erkrankung
offensichtlich entweder uneffektiv oder inadäquat ist. Eine Schlüsselfrage in diesem
Zusammenhang ist, ob Amyloid an sich im Alzheimer-Gehirn einen persistierenden Stimulus
darstellt und so neuronale Schädigung verursacht oder ob begleitende Faktoren diesen Effekt
hervorrufen. Direkte Injektion von Aß in das Gehirn führt zur Aktivierung von Mikrogliazellen
und zum Verlust spezifischer Neuronenpopulationen (Weldon et al. 1998). Transgene Mäuse,
die humanes, mutiertes ß-Amyloid-Precursor-Protein überexprimieren, entwickeln AßAblagerungen und damit assoziiert wahrscheinlich auch neuronale Schädigung. Diese AßAblagerungen enthalten aktivierte Mikroglia (Irizarry et al. 1997; Frautschy et al. 1998).
Die von uns durchgeführten Phagozytose-Experimente konnten die Annahme einer
Mikrogliaaktivierung durch das Vorhandensein von Aß-Plaques nicht bestätigen. Für die
immunhistochemische
Färbung
wurden
primäre
WT-Mikrogliazellen
(C57BL/6)
auf
Gehirnschnitten von Alzheimer-Patienten ausplattiert und inkubiert. Es kam zu keiner
Gruppierung von Mikrogliazellen um Aß-Plaques. Auch bei unterschiedlicher Stimulation der
Mikroglia mit LPS (klassische Aktivierung) und LPS + IL-4 (alternative Aktivierung) konnten
immunhistochemisch im Vergleich zur Kontrolle keine signifikanten Unterschiede bezüglich der
Phagozytose im Vergleich festgestellt werden. Um das Ergebnis dieses Phagozytoseexperiments
zu quantifizieren, wurden die Gehirnschnitte mit den darauf ausplattierten Mikroglia auf die
gleiche Weise behandelt und anschließend lysiert um einen Aß-Western-Blot durchzuführen.
Der Western-Blot war jedoch trotz mehrfacher Durchführung und multiplen Variationen
bezüglich des Durchführungsprotokolls (Antikörperkonzentrationen, Inkubationszeiten) nicht
adäquat verwertbar. Obwohl die Aß-Banden abgrenzbar waren, konnte keine suffiziente
Aussage darüber getroffen werden, ob die durchgeführten Stimulationen der Mikrogliazellen zu
relevanten Unterschieden der Aß-Peptid-Menge im Rahmen von Phagozytose führte.
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Diskussion
In Studien konnte gezeigt werden, dass proinflammatorische Zytokine, wie LPS, mikrogliale
Phagozytose hemmen, die durch die fibrilläre Form von Aß (fAß) in vitro induziert wird
(Koenigsknecht-Talboo u. Landreth 2005). fAß-Exposition aktiviert Mikroglia und induziert deren
Phagozytoseaktivität über den Toll-like receptor (TLR)-Signalweg (Bamberger et al. 2003; ReedGeaghan et al. 2009). Korrespondierend führt eine Blockade des TLR-Signalwegs oder anderer
Bestandteile des fAß-Rezeptor-Komplexes durch Eingriff in die Rezeptor-Ligand-Interaktion oder
deren nachgeschaltete Effektoren zu einer Reduktion der fAß-induzierten Phagozytose
(Bamberger et al. 2003). Mikrogliazellen, denen es an TLR2, TLR4 oder deren Effektor CD14
mangelt, scheitern daran in Anwesenheit von fAß Phagozytose zu induzieren (Reed-Geaghan et
al. 2009). Diese Ergebnisse heben die Schlüsselfunktion von Pattern-Recognition-Receptors
(PRRs) bei der fAß-Absorption und Phagozytose hervor. Interessanterweise wird die Aβinduzierte Phagozytose inhibiert, wenn Mikrogliazellen gleichzeitig mit proinflammatorischen
Zytokinen wie IL-1ß, TNF-α, IFN-γ, MCP-1 und CD40L inkubiert werden (Koenigsknecht-Talboo u.
Landreth 2005). Diese Ergebnisse passen zu den Effekten die an LPS-behandelten Zellen
beobachtet wurden. Co-Inkubation von Zellen mit antiinflammatorischen Zytokinen wie IL-4 und
IL-10 oder Cyclooxygenase-Hemmern blockiert die Fähigkeit von proinflammatorischen
Zytokinen die Aß-induzierte Phagozytose zu hemmen durch die Inhibition der Prostaglandin E2
(PGE2)-Produktion oder dessen Signalweg (Koenigsknecht-Talboo u. Landreth 2005). Es konnte
gezeigt werden, dass proinflammatorische Zytokine den Abbau von fAß durch Mikroglia
hemmen, wohingegen antiinflammatorische Zytokine den Abbau in vivo begünstigen. Die
Hemmung des Aß-Abbaus ist möglicherweise eine Konsequenz der Herabregulierung von
proteosomalen Enzymen (Yamamoto et al. 2008). Passend zu diesen Resultaten führt ein KnockOut des PGE2 EP2-Rezeptors in einem Mausmodell für Alzheimer zu einer signifikanten
Reduktion des Gesamtgehalts an Aß-Peptid und Aß-Plaques (Liang et al. 2005). Die Behandlung
von Alzheimer-Mäusen mit antiinflammatorischen Mitteln, wie LXR (liver X receptor)-Agonisten,
PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)-Agonisten und Nicht-steroidalen
Entzündungshemmern (NSAID), führt zu einer verstärkten Phagozytose von fAß und damit
verbunden auch zu einer Besserung der Alzheimer-Pathologie (Lim et al. 2000; Heneka et al.
2005). Diese Ergebnisse unterstützen die Wichtigkeit des Inflammationsstatus im Hinblick auf
die Regulierung der Mikroglia-vermittelten Aß-Beseitigung und bieten therapeutische
Möglichkeiten durch die Entwicklung spezifischer antiinflammatorischer Mittel.
Seite 47
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
In neurodegenerativen Erkrankungen, wie Chorea Huntington, Amyotrophe Lateralsklerose
(ALS) und Alzheimer, und bei Alterung spielen bekanntlich sowohl mitochondriale Dysfunktion
als auch Mikrogliaaktivierung eine entscheidende Rolle. Mitochondriale Funktionsstörungen
inhibieren die alternative Mikrogliaaktivierung und könnten damit auch die anhaltende
Neuroinflammation bei neurodegenerativen Erkrankungen und im Alter erklären.
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Mikrogliazellen aus Mausmodellen für
Huntington (R6/2) und ALS (SOD1) eine Inhibition der alternativen Aktivierung aufweisen. Da
Alter der Hauptrisikofaktor für neurodegenerative Erkrankungen ist, sollte geklärt werden ob es
Unterschiede bezüglich der alternativen Aktivierung zwischen jungen und alten Mikroglia gibt
und im Hinblick auf die Pathogenese von Alzheimer, ob alternative Aktivierung Einfluss auf die
Aß-Phagozytosefähigkeit von Mikrogliazellen hat.
Anhand der durchgeführten Experimente konnte bestätigt werden, dass Mikrogliazellen
allgemein im hohen Alter ein deutlich gesteigertes Inflammationsniveau zeigen als junge
Mikroglia. Zudem deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die alternative Aktivierung bei den
Mausmodellen für ALS und Morbus Huntington bereits im jungen Alter, sowie allgemein im
hohen Alter gehemmt ist.
Weiterhin konnten wir zeigen, dass eine alternative Aktivierung der Mikrogliazellen nicht zu
einer gesteigerten Phagozytose von Aß-Plaques führt und die Akkumulation von Aß-Plaques
daher nicht im Zusammenhang steht mit einer im Alter gehemmten alternativen Aktivierung
von Mikrogliazellen.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass eine Hemmung der
antiinflammatorischen, alternativen Mikrogliaaktivierung bei den untersuchten Mausmodellen
für neurodegenerative Erkrankungen und allgemein im hohen Alter vorliegt, was die anhaltende
Neuroinflammation bei Neurodegeneration erklären könnte.
Zukünftig gilt es mögliche Zusammenhänge/Signalwege zwischen mitochondrialer Dysfunktion,
der
alternativen
neurodegenerativen
Mikrogliaaktivierung
Erkrankungen
zu
und
klären
anhaltender
und
Neuroinflammation
dadurch
neue,
bei
spezifische
Therapiemöglichkeiten zu eröffnen.
Seite 48
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Seite 54
Danksagung
Danksagung
Mein besonderer Dank für die hilfreiche Unterstützung bei der Erstellung meiner Doktorarbeit
gilt Dr. rer. nat. Anke Witting. Sie brachte mir sehr viel Geduld entgegen und sorgte mit
wertvollen Ratschlägen und fundiertem Fachwissen für das Gelingen der Arbeit.
Mein Dank für die formale Betreuung gilt Herrn Prof. A. C. Ludolph.
Besonderer Dank der Mitarbeiterin Irma Merdian für die große Hilfe und die Ratschläge bei der
Laborarbeit.
Ein großer Dank gilt meinen Freunden Branko Cirovic, Sepiede Azghandi und Dominik Bühler. Sie
gaben mir mit ihrem Fachwissen viele Anregungen für meine wissenschaftliche Arbeit.
Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die das Studium und eine
Doktorarbeit niemals möglich gewesen wären.
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Lebenslauf
Lebenslauf
Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
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Die Magie der Zellen Vortragsabend

Janina Krüger

Kutschenfahrt

Direkte Laserinterferenzstrukturierung und anodische Oxidation zur

Die Genomstabilität ist wichtig für die Fitness und das Überleben

Kündigung kryokonservierter Zellen deutsch

3R-Prinzip für Alternativmethoden

Willkommen_files/Anmeldung Agmid Mitgliedschaft

Einladung zum Einladung zum Kolloquium Equinum: quium Equinum:

Texte in Zellen bearbeiten Krähenberg – Verlag