SC - Institut für Organische Chemie

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Säulenchromatographie (SC)
2.1 Literatur
2.2 Aufgabe: Säulenchromatographische Trennung eines Gemisches aus
β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen (Vergleich von Schwerkraft- und
Blitzchromatographie)
2.3 Fragen zur Säulenchromatographie
2.4 Anhang 1: Herstellung des Gemisches für die säulenchromatographische
Trennung
2.5 Anhang 2: Fehlerquellen bei der säulenchromatographischen Trennung des
Gemisches aus β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen
2.1 Literatur:
Bevor Sie die Versuche zur Säulenchromatographie beginnen, lesen Sie bitte folgende
Literatur:
Lit. 1: S. Hünig, G. Märkl, J. Sauer, P. Kreitmeier, A. Ledermann (Hrsg.: J. Podlech),
Arbeitsmethoden in der Organischen Chemie, 3. überarb. Aufl., Verlag
Lehmanns, Berlin, 2014
Auf dieses Skript kann auch über das Internet zugegriffen werden unter:
http://www.ioc-praktikum.de
Lit. 2: Thomas Lehmann, Anleitung zur Säulenchromatographie;
http://userpage.chemie.fu-berlin.de/~tlehmann/gp/versuche/saeule.pdf
2.2 Aufgabe: Säulenchromatographische Trennung eines Gemisches
aus β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen (Vergleich von Schwerkraft- und Blitzchromatographie)
Vergleichen Sie die Leistungsfähigkeit einer klassischen Schwerkraftsäule mit der einer
Blitzchromatographie. Arbeiten Sie hierzu in Zweiergruppen und trennen Sie ein
Gemisch aus β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen (zur Herstellung des Gemisches
siehe Anhang 1)
a) mit Hilfe der klassischen Schwerkraftsäule mit Kieselgel (0,063 – 0,200 mm,
Chem.-Ausg. 2227) und
b) mit Hilfe der Blitzchromatographie mit Kieselgel (0,040 – 0,063 mm, Chem.-Ausg.
2228)
Ermittlung der Trennbedingungen mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie
(DC)
Mit Hilfe der DC wird das Trennproblem zunächst analysiert. Hierzu werden
unterschiedliche Laufmittelgemische (aus Essigsäureethylester und Petrolether)
getestet. Da als stationäre Phase Kieselgel dient, können Sie die Kieselgel-DCFertigplatten verwenden.
Sie erhalten ein Gemisch aus β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen. Fertigen Sie DCs
des Gemisches mit Essigsäureethylester/Petrolether als Eluens in verschiedenen
Mischungsverhältnissen (von 0:100 bis 100:0) an. Verwenden Sie für die DC-Proben
Lösemittel, die Sie genau so behandelt haben, wie die Lösemittel zur eigentlichen
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Säulenchromatographie! (Eine Anleitung zum Anfertigen von Dünnschichtchromatogrammen finden Sie in den Grundoperationen Ihres OC1-Praktikums.)
Bestimmen Sie für alle detektierbaren Komponenten in den DCs die zugehörigen RfWerte. (In welchem Bereich müssen die so ermittelten Rf-Werte liegen, damit bei der
präparativen Chromatographie eine Trennung der Komponenten möglich ist?)
Berechnen Sie für die Hauptkomponenten aus dem DC den Trennfaktor  und den
Retentionsfaktor k.
Mit der besten Lösungsmittelmischung werden je 1 ml Gemisch auf den zwei oben
beschriebenen (siehe Aufgabe) chromatographischen Systemen getrennt. Die Säulen
sollen jeweils einen Durchmesser von 2.5 cm haben und ca. 30 cm hoch mit Kieselgel
befüllt sein.
Durchführen der Säulenchromatographie
Im Praktikum werden die Säulen in der Regel trocken gepackt, da so im Vergleich zur
Nassfüllung eine dichtere und homogenere Packung der Säule erreicht werden kann,
die Zonen dementsprechend schmäler werden und die Trennleistung bei gleicher
Säulenlänge steigt.
Hängen Sie die Säule im Abzug auf und füllen Sie die Säule mit Kieselgel (0,040 –
0,063 mm, Chem.-Ausg. 2228) ca. 15-20 cm hoch auf. Achten Sie darauf, dass Sie
beim Befüllen der Säulen kein Kieselgel einatmen! Verschließen Sie die Säule mit
einem Gummistopfen und drehen sie die Säule um, sodass das Kieselgel in der Kugel
oder im oberen Ende der Säule ist. Ziehen Sie nun am Säulenausgang Vakuum, bis
das Kieselgel gut entgast ist (es entweicht sichtbar kein Gas mehr). Wenn auch nach
mehreren Minuten noch Gas entweicht, ist der Säulenverschluss oder die Díchtung
undicht. Beheben Sie dies. Drehen Sie die Säule nach dem Entgasen um und
verdichten Sie das Kieselgelbett durch Schläge mit einem Vakuumschlauch oder einen
Vibrator. Wenn sich das Bett nicht mehr setzt, ziehen Sie zuerst schnell den
Gummistopfen ab und heben dann langsam das Vakuum von der Pumpe her auf.
Achten Sie darauf, dass das Kieselgelbett eine vollkommen ebene Oberfläche im
rechten Winkel zur Säulenwand bildet, bevor Sie das Vakuum aufheben.
Folgende Schritte gelten für die Säulenchromatographie ohne Pumpe und
Detektor:
Schichten sie vorsichtig 2 – 3 cm Seesand auf das Kieselgel. Achten Sie hierbei
darauf, dass die Kieselgeloberfläche nicht beschädigt wird. Auch der Seesand
muss eine ebene Oberfläche erhalten. Sie erreichen dies wieder durch vorsichtige
Schläge mit einem Vakuumschlauch an die Säule. Füllen sie nun bei geöffnetem
Hahn Ihr Lösungsmittel (Essigsäureethylester/Petrolether) so ein, dass das
Kieselgel und möglichst auch die Seesandschicht nicht aufgewirbelt werden. Am
Besten trägt man die ersten Milliliter des Lösungsmittels mit Hilfe einer
Pasteurpipette auf. Lassen Sie hierzu das Lösungsmittel an der Säulenwand
entlang rinnen und führen Sie die Pipette dabei im Kreis herum, so dass das
Lösungsmittel auf die gesamte Innenfläche der Säule und den Seesand rinnt. Sie
können alternativ auch einen Pulvertrichter aufsetzen und das Lösemittel langsam
über den Rand des Trichters einfüllen (Nicht direkt in die Öffnung des Trichters
gießen! Wenn Tropfen auf die Seesandfläche platschen, wird die ebene Oberfläche
beschädigt und muss dann vor Aufgabe der Lösung wieder eingeebnet werden
(natürlich ohne die Kieselgeloberfläche zu beschädigen). Wenn das Lösungsmittel
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einige Zentimeter hoch auf der Säule steht, können Sie weiteres Lösungsmittel
direkt, d.h. ohne Pasteurpipette, einfüllen. Drücken Sie nun das Lösungsmittel mit
dem Halbgebläse durch das Kieselgel.
Achtung: Bei hohem Essigsäureethylesteranteil wird das Kieselgel heiß, sodass
beim Druckabfall Gasblasen entstehen können, die die Säulenpackung zerstören.
Dieser Effekt kann auch bei reinem Petrolether als Eluens und schnellem
Druckabfall auftreten. Den Druck also immer langsam, am besten über die Säule
abbauen lassen.
Füllen Sie Lösungsmittel nach, ohne dass Luftblasen die Sandschicht erreichen.
Wenn Ihre Säule wieder abgekühlt ist und praktisch keine Gaseinschlüsse im
Kieselgel zu sehen sind, ist die Konditionierung beendet.
Nach der Konditionierung lassen Sie das Lösungsmittel ohne Druck bis in den
Seesand absinken. Geben Sie vorsichtig die zu trennenden Lösung wie oben beim
Lösungsmittel beschrieben mit einer Pasteurpipette auf und warten Sie bis diese im
Sand eingesunken ist (evtl. leicht Druck anlegen). Achtung: Wird beim Auftragen
der Lösung die Seesandoberfläche beschädigt, verschlechtert dies Ihr
Trennergebnis. Ist die gesamte Lösung aufgetragen und in die Seesandschicht
eingesunken, so spülen Sie den verwendeten Kolben mit 1 -2 ml Lösungsmittel und
tragen auch diese Waschlösung auf die Säule auf. Waschen Sie damit auch die
Innenwände der Säule sauber. Sie könne diesen Spülvorgang wenn nötig
wiederholen. Sie sollten dabei aber nur so wenig Lösungsmittelvolumen wie
unbedingt notwendig verwenden.
Es kommt nun darauf an, dass sich die aufgetragene Lösung und das
Lösungsmittel am Säulenkopf nicht miteinander mischen. Vergewissern Sie sich,
dass die aufgetragene Lösung (Spüllösung) in den Seesand eingesunken ist und
geben Sie dann mit einer neuen Pasteurpipette 1 – 3 mL reines Lösungsmittel auf
die Sandschicht. Warten Sie wiederum ab, bis das Lösungsmittel gerade eben
eingesickert ist und wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal mit 1 – 3 mL
reinem Lösungsmittel.
Geben Sie nun vorsichtig soviel Lösungsmittel auf die Säule, bis die Kugel mit
Lösungsmittel gefüllt ist und führen Sie die Chromatographie durch. Bei der ersten
Säule verwenden Sie nur die Schwerkraft. Bei der zweiten Säule pumpen Sie das
Eluens mit dem Halbgebläse mit Kraft durch die Säule. Geben Sie rechtzeitig
Lösungsmittel nach und heben Sie den Druck nicht schlagartig auf. Nehmen Sie
die Fraktionen nach Volumen in Rundkolben auf, engen diese ein und fertigen Sie
zum Abschluss ein DC mit allen Fraktionen und dem eingesetzten Gemisch an.
Folgende Schritte gelten für die Säulenchromatographie mit Pumpe und Detektor
(Diese Technik können Sie nach Rücksprache mit und Einweisung durch die
Assistenten auch bei späteren Trennungen anwenden):
Setzen Sie den oberen Stempel in die Säule ein und bewegen Sie diesen bis zur
Kieselgeloberfläche. Drücken Sie den Stempel niemals in das Kieselgel.
Spülen Sie die Pumpe und alle Leitungen und den Detektor mit Ihrem
Lösungsmittel. Schließen Sie die Leitungen danach an Ihrer Säule an und starten
die Pumpe. Pumpen Sie Ihr Lösungsmittel solange durch die Säule, bis keine
Luftblasen mehr zu sehen sind. Pumpen Sie auch so lange, bis eine evtl.
auftretende Erwärmung abgeklungen ist.
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Hängen Sie den Schlauch nach dem Detektor in das Vorratsgefäß. Bis die Säule
konditioniert ist, können Sie das Eluens ohne Reinigung wieder verwenden.
Befüllen Sie die Probenschleife mit Ihrer Probenlösung. Ziehen Sie hierzu die
Probenschleife mit einer Spritze leer, tauchen die Ansaugleitung der
Probenschleife in Ihrer Probenlösung und ziehen die Lösung vorsichtig in die
Probenschleife. Achten Sie darauf, die Probenschleife nicht zu überfüllen. Legen
Sie nun den Schalter um, damit die Probe auf die Säule eluiert wird. Nehmen Sie
die Fraktionen nach der Anzeige des Detektors.
Nachdem Ihre Substanzen eluiert wurden, pumpen Sie noch kurz (max. 5 min) Luft
durch die Säule, um ein Großteil des Lösungsmittels zu entfernen.
Stellen Sie die gebrauchte Säule mit dem Gummistopfen verschlossen auf den Kopf
und ziehen Sie Vakuum, bis kein Eluens mehr entweicht
Halten Sie die Säule gut fest und heben Sie das Vakuum von der Pumpe her schnell
auf. Trockenes Kieselgel fällt dann in die Kugel oder in das obere Ende der Säule und
lässt sich einfach herausschütten. Verwenden Sie zum Entleeren der Säule nie
Glasstäbe oder Spatel oder andere mechanische Hilfsmittel. Die Innenseite des
Glasrohrs darf nicht verkratzt werden.
2.3 Fragen zur Säulenchromatographie:
1)
2)
3)
4)
5)
Unter der Trennsäule versteht man in der Säulenchromatographie (SC) ein Rohr,
das mit der stationären Phase (Packungsmaterial) gefüllt ist, Worauf beziehen sich
hierbei die Angaben zur Säulenlänge, Säulenquerschnitt und Säulenvolumen?
Geben Sie an, wie folgende Begriffe aus der Säulenchromatographie definiert
sind:
Durchflusszeit tM, Gesamtretentionszeit tR, Netto-Retentionszeit bzw. reduzierte
Retentionszeit t´R, Retentionsfaktor k (Hinweis: Bei der Dünnschichtchromatographie bezeichnet man den Retentionsfaktor mit RF), Trennfaktor .
In welchem Bereich soll der Retentionsfaktor k liegen, damit eine Säulenchromatographie Erfolg verspricht?
Mit Hilfe des Trennfaktors  kann abgeschätzt werden, ob für die Trennung eine
Schwerkraftsäule noch ausreichend ist, oder ob eine Blitzchromatographie nötig
ist. Bei welchen Trennfaktoren  ist die Trennung mittels Schwerkraftsäule noch
möglich, bei welchen mittels Blitzchromatographie sinnvoll?
Die Auflösung RS einer Säule kann mit der Bodenzahl N einer Säule und dem
Retentionsfaktor k durch folgende Gleichung in Beziehung gebracht werden.
Rs 
6)
7)
8)
9)
1
 1 k
N
4
 1 k
mit k 
k1  k 2
2
Um welchen Wert wird die Auflösung gesteigert, wenn die Bodenzahl N einer
Säule verdoppelt wird (z.B. durch Verdopplung der Säulenlänge)?
Wie groß sollte die Auflösung RS sein, so dass zwei Komponenten vollständig
getrennt sind?
Woran erkennt man, dass eine Säule überladen ist?
Warum darf die Durchflussgeschwindigkeit bei der Säulenchromatographie nicht
zu klein und warum nicht zu groß sein?
Kann eine Säulenchromatographie nach dem Start, z.B. durch Schließen des
Auslaufhahns, nochmals unterbrochen werden?
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10) Wie ist die Trennstufenhöhe H mit der Trennstufenzahl N (= Bodenzahl N)
verknüpft?
11) Wodurch kann man bei der Säulenchromatographie die Trennstufenhöhe H
entscheidend erniedrigen und damit eine deutliche Verbesserung der Trennleistung erreichen?
12) Welche Korngrößen des Adsorbens (Säulenfüllmaterial) werden bei der
konventionellen, drucklosen ‚Schwerkraftsäule‘ und welche bei der‚
Blitzchromatographie‘ verwendet?
13) Warum muss bei Verwendung von Adsorbens (Säulenfüllmaterial) mit kleinen
Körnungen (< 60 m) das Laufmittel mit z. T. hohem Druck auf die Säule gepumpt
werden?
14) Welche Durchflussgeschwindigkeit ist für eine Blitzchromatographie-Säulen mit
einer Füllhöhe (h) von 30 cm und einem Durchmesser () von 2.5 cm günstig?
15) Geeignete Trennbedingungen für die Säulenchromatographie lassen sich einfach
und schnell über die Dünnschichtchromatographie bestimmen. Über welche
Beziehung sind die Retentionsparameter von Dünnschichtchromatographie und
Säulenchromatographie miteinander verknüpft?
16) Beschreiben Sie stichpunktartig, wie man bei der Bestimmung der Trennbedingungen für die Säulenchromatographie aus der Dünnschichtchromatographie
vorgeht.
17) Welche Bodenzahl N besitzt eine typische gut gepackte Schwerkraftsäule mit einer
Füllhöhe (h) von 30 cm und einem Durchmesser () von 2.5 cm, und welche
Bodenzahl N besitzt eine typische Blitzchromatographiesäule mit einer Füllhöhe
(h) von 30 cm und einem Durchmesser () von 2.5 cm?
18) Lösen Sie folgende Aufgabe:
Sie sollen ein Gemisch zweier Verbindungen säulenchromatographisch trennen.
Das DC liefert Ihnen für die beiden Komponenten A und B die Rf-Werte Rf(A) = 0.3
und Rf(B) = 0.45. Berechnen Sie die Retentionsfaktoren k(A) und k(B) sowie den
Trennfaktor . Ist eine Trennung der beiden Komponenten A und B mit Hilfe einer
typischen Schwerkraftsäule möglich?
19) In welchem Bereich sollen die Rf-Werte der zu trennenden Komponenten auf dem
DC liegen, damit die Säulenchromatographie Erfolg verspricht?
20) Erfahrungsgemäß muss die Polarität des Laufmittels beim Übergang von der DC
auf die SC etwas gesenkt werden. Wie erreichen Sie dies und worauf muss dabei
geachtet werden?
21) Warum müssen Sie die Lösungsmittel für die DC-Vorproben und die Säulenchromatographie exakt gleich vorbereiten?
22) Wie müssen Sie die Lösungsmittel für die Säulenchromatographie vorbereiten?
23) In welchem Verhältnis soll bei einer Chromatographiesäule die Füllhöhe zum
Säulendurchmesser stehen?
24) Bei Schwerkraftsäulen muss am Auslauf unbedingt ein gut dichtender und regulierbarer Hahn angebracht sein (am besten aus Teflon). Worauf müssen Sie
achten, wenn der Hahn aus Teflon ist und worauf, wenn ein Glas-Schliffhahn
verwendet wird.
25) Um eine Chromatographiesäule zu füllen, gibt es im Wesentlichen zwei Methoden,
die Nassfüllung und die Trockenfüllung. Welche Vor- und Nachteile haben die
beiden Methoden?
26) Bei der Säulenchromatographie (unter Normal- oder Niederdruck) wird prinzipiell in
senkrecht stehenden Glassäulen gearbeitet. Wie wird die Säule hierbei befestigt?
27) Warum klopft man bei der Nassfüllung während sich das Adsorbens absetzt
gleichmäßig mit einem Korkring oder Gummischlauch von allen Seiten an die
Säule?
6
28) Warum sollte bei jeder Säulenchromatographie eine Massenbilanz erstellt
werden?
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2.4 Anhang 1: Herstellung des Gemisches für die säulenchromatographische Trennung
Extraktion von β-Carotin aus Blattspinat
Die Extraktion von β-Carotin aus Blattspinat wurde als Gruppenpräparat im OP2 von
Mirjam Krahfuß, Johannes Krebs, Christopher Langmann erarbeitet. Alle Versuche
wurden mit destillierten Lösungsmitteln durchgeführt.
In einem großen Mörser wurden 700 g Blattspinat in zwei Portionen mit Seesand und
etwa 10-15 g Kaliumcarbonat zerrieben. Der Inhalt des Mörsers wurde jeweils in einen
500-mL-Rundkolben überführt, mit Essigsäureethylester überschichtet und einige Male
kräftig geschüttelt. Der komplette Inhalt wurde über einen mit Zellstofftüchern
ausgelegten großen Kunststofftrichter in einen 500-mL-Scheidetrichter filtriert
(Auspressen der Zellstofftücher), die wässrige Phase abgetrennt und verworfen. Die
festen Rückstände des Spinatextraktes wurden wieder in den Rundkolben gegeben
und der Vorgang noch zweimal wiederholt. Das Filtrat der Extraktionen wurde über
eine sehr große, mit 3 cm Kieselgel und 7 cm Natriumsulfat gefüllte Glasfritte
getrocknet. An dieser Stelle wurde ein Dünnschichtchromatogramm von der erhaltenen
Lösung erstellt (Laufmittel: reiner Petrolether).
Das Lösungsmittel der organischen Phase wurde am Rotationsverdampfer destillativ
entfernt und der erhaltene Rückstand in 50 ml Petrolether gelöst.
Die grüne Lösung wurde nun säulenchromatographisch aufgereinigt. Dazu wurde eine
Säule der Bauart Eco der Firma YMC und Kieselgel der Stärke 0.040 - 0.063
verwendet. Weiterhin wurde eine Pumpe und ein Detektor angeschlossen. Zu Beginn
wurde reiner Petrolether als Laufmittel verwendet. Im weiteren Verlauf (orangene
Bande auf 2/3 der Säulenlänge) wurde ein Laufmittelgemisch aus Petrolether/Essigsäureethylester (98:2) verwendet. Die β-Carotin-Phase wurde abgetrennt, alle
nachfolgenden Farbstoffe verworfen.
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Herstellung des Gemisches für die Säulenchromatographie
Die β-Carotin-Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und in 20 mL
Petrolether aufgenommen. Zu einem Gemisch aus 500 mg (3.90 mmol) Azulen, 500
mg (2.93 mmol) Trimethylazulen und 33 mL Petrolether wurden 16 mL des
eingeengten β-Carotin-Extraktes gegeben.
Hiervon wurde ein Dünnschichtchromatogramm erstellt (Laufmittel: reiner Petrolether).
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2.5 Anhang 2: Fehlerquellen bei der säulenchromatographischen
Trennung des Gemisches aus β-Carotin, Azulen und Trimethylazulen
Säulenchromatographische Trennung des Gemisches
Das Präparat wurde auf eine mit Kieselgel (0.040 – 0.063 mm) trocken gepackte FlashSäule (10x2.5 cm) aufgetragen und säulenchromatographisch mit Petrolether als
Laufmittel aufgetrennt. Nach etwa 7 min konnte Azulen (blaue Bande) innerhalb von 5
min abgetrennt werden. Nach weiteren 4 min folgte Trimethylazulen (lila Bande).
Dieses konnte innerhalb von 20 min abgetrennt werden. Nachdem diese beiden
Banden abgetrennt waren, wurde das Laufmittel allmählich durch Zugabe von
Essigsäureethylester polarer gemacht, bis schließlich ein Gemisch aus Petrolether und
Essigsäureethylester (90:10) als Lösungsmittel verwendet wurde. Hierdurch konnte
β-Carotin innerhalb von 5 min isoliert werden.
Die säulenchromatographische Trennung kann somit innerhalb von knapp 45 min
durchgeführt werden.
Fehlerquellen
‐
Das
Lösungsmittel
muss
zuvor
destilliert
(mindestens
aber
am
Rotationsverdampfer abrotiert) sein, da sonst das Azulen teilweise zerstört wird
und eine braune Bande hinterlässt. Gleiches entsteht bei einer schlecht
konditionierten Nassfüllung, da hierbei Sauerstoff in der Säule eingeschlossen wird.
Nicht destilliertes Lösungsmittel
‐
destilliertes Lösungsmittel
Bei Spuren eines polaren Lösungsmittels ändert sich das Laufverhalten der drei
Banden. β-Carotin läuft schneller als Azulen und Trimethylazulen. Weiterhin lässt
sich das Azulengemisch nicht mehr sauber trennen. Aus diesem Grund muss die
10
Mischung möglichst wasserfrei sein und beim Packen der Säule darauf geachtet
werden, dass sich kein Wasser oder Reste anderer polarer Lösungsmittel mehr in
der Säule befinden.
Laufmittel: reiner Petrolether
‐
Petrolether/Essigsäureethylester (99:1)
Nachdem Azulen (blaue Bande) und Trimethylazulen (lila Bande) abgetrennt
wurden, wird das Laufmittel (Petrolether) durch Zugabe von Essigsäureethylester
allmählich polarer gemacht, bis schließlich ein Gemisch aus Petrolether und
Essigsäureethylester (90:10) als Lösungsmittel verwendet wird. Die Änderung der
Zusammensetzung des Laufmittels muss immer langsam erfolgen, da es sonst zu
stärkerer Wärmeentwicklung kommen kann, in deren Folge die Säule „reißen“
kann.

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