1. Proteinnachweis mit Bradford

1. Proteinnachweis mit Bradford-Farbreagenz
Man benötigt:
96-well-Platte
Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml)
Pipetten (10, 20 und 200 µl)
Pipettenspitzen
Proteinvorratslösung (1 mg/ml Albumin in destillierten Wasser)
Destilliertes Wasser
Bradford Farbreagenz (vorher 1:5 verdünnt)
Aufgaben:
Eichgerade erstellen, zeichnen und auswerten.
Die Konzentration der Proteine in der unbekannten Probe bestimmen.
Durchführung:
 Fünf Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften.
 In das erste Gefäß 0 µl der Proteinvorratslösung geben.
 In das zweite Gefäß 5 µl der Proteinvorratslösung geben.
 In das dritte Gefäß 10 µl der Proteinvorratslösung geben.
 In das vierte Gefäß 15 µl der Proteinvorratslösung geben.
 In das fünfte Gefäß 20 µl der Proteinvorratslösung geben.
 Jedes der Gefäße mit destillierten Wasser auf 40 µl auffüllen und gut mischen.
 Jeweils 20 µl der Standardreihe in je ein well einer 96-well-Platte pipettieren.
 20 µl der unbekannten Probe in zwei wells pipettieren.
 Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl der Bradford Farbreagenz zugeben (alle
zugleich!).
 Die Platte für 15 Minuten auf Raumtemperatur inkubieren.
 Die Platte im Photometer (Platereader) bei 595 nm vermessen.
 Eichgerade zeichnen und auswerten (x-Achse = mg/ml Protein; y-Achse = Extinktion).
 Mithilfe der Eichgerade die Konzentration der unbekannten Probe bestimmen (in mg/ml Protein).
Beispiel einer Eichgerade
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2. Blutzuckermessung
Man benötigt:
Blutzuckermessgerät
Blutzuckermesstreifen
Lanzetten
Stechhilfe
Aufgabe:
Bestimmung des Glucosegehaltes des Bluts (vor und nach dem Essen)
Durchführung:
 Hände gründlich waschen
 Messstreifen in Messgerät stecken
 Warten bis das Gerät einen blinkenden Blutstropfen anzeigt
 Lanzette in die Stechhilfe einspannen und Schutz entfernen
 Mithilfe der Stechhilfe in die Fingerkuppe stechen
 Einen Blutstropfen auf die Spitze des Messstreifens geben
 Warten bis das Gerät den Messwert anzeigt (in mg/dl)
 Lanzette und Messstreifen in verschließbaren Behälter entsorgen (Verletzungsgefahr!)
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3. Triglyceridnachweis aus Plasma
Man benötigt:
96-well-Platte
Lanzetten
Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml)
Pipetten (10µl, 200µl, 1000µl)
Pipettenspitzen
Box mit Eis
0,5 M EDTA
0,9% NaCl-Lösung
Triglycerid-Reagenz (Infinity Triglycerides)
4mM Glycerin
Aufgaben:
Gewinnung von Plasma aus einer Blutprobe
Die Konzentration der Triglyceride im Blutplasma bestimmen.
Durchführung:
 In ein Regiergefäß 5 µl der 0,5 M EDTA-Lösung geben.
 Mit Lanzette in Fingerkuppe stechen und Blut in das Reagiergefäß rinnen lassen (ca. 50 µl).
 Reagiergefäß gut mischen und auf Eis stellen.
 Blutprobe bei 3500 rpm für 10 Minuten abzentrifugieren.
 Die klare Flüssigkeit (= Plasma) vorsichtig abpipettieren und in neues Reagiergefäß geben.
 Plasmaprobe auf Eis stellen, der Rest kann entsorgt werden.
 Sechs Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften.
 In das erste Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben.
 In das zweite Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.
 In das dritte Gefäß werden 5µl aus dem zweiten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.
 In das vierte Gefäß werden 5µl aus dem dritten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.
 In das fünfte Gefäß werden 5µl aus dem vierten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.
 In das sechste Gefäß werden 5µl der 0,9% NaCl-Lösung gegeben (Nullwert).
 Jeweils 2 µl der Standardreihe in ein well einer 96-well-Platte pipettieren (auf Eis!).
 2 µl vom Blutplasma in ein well pipettieren.
 Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl des Triglycerid-Reagenz geben (alle zugleich!!!).
 Die Platte für 10 Minuten auf 37°C inkubieren.
 Die Platte im Photometer (Platereader) bei 500 nm vermessen.
 Eichgerade zeichnen und auswerten (x-Achse = mg/ml Glycerin; y-Achse = Extinktion).
 Mithilfe der Eichgerade die Konzentration des Blutplasmas bestimmen (in mg/ml Glycerin).
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4. pH-Wert einer Urinprobe bestimmen
Man benötigt:
Spritzflasche mit destillierten Wasser
Urinprobe
Kalibrierlösungen für pH-Meter (pH 4,01; 7,00 und 10,01)
Aufgaben:
Kalibrieren des pH-Meters
Bestimmung des pH-Werts einer Urinprobe
Durchführung:
 pH-Messgerät einschalten.
 Zur Kalibrierung auf „CAL“ drücken.
 Geeigneten Puffer auswählen und „CAL“ drücken, nicht verwendete Puffer ausschalten.
 Elektrode aus dem Lagerpuffer holen und gründlich mit destillierten Wasser spülen.
 Elektrode in die zu messende Pufferlösung tauchen.
 Auf dem Bildschirm „Kalibrier“ auswählen und „CAL“ drücken.
 Den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen.
 Nach dem Kalibrieren die Elektrode gründlich mit destillierten Wasser spülen.
 Elektrode in die Probelösung tauchen und Messwert vom Bildschirm ablesen.
 Nach dem Gebrauch Elektrode nochmals gründlich mit destillierten Wasser spülen.
 Elektrode zurück in den Lagerpuffer geben.
 pH-Messgerät ausschalten.
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5. SDS-Page mit Proteinen
Man benötigt:
Pipetten (10 µl, 100µl und 1000 µl)
Messzylinder (1000 ml)
Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml)
Stripetten (25 ml)
Pipettierhilfe
Proteinprobe
Petrischale
20x MOPS Running Buffer
Gel für die Elektrophorese (4-12% Bis-Tris-Gel mit 15 wells)
4x LDS Sample Buffer
Proteinstandard
0,5 M DTE
Antioxidans-Lösung
Simply Blue Safe Stain (Coomassie dye)
Aufgaben:
Auftrennen einer Proteinprobe über Gelelektrophorese.
Sichtbarmachen der Proteinbanden am Gel.
Durchführung:
 In ein Reagiergefäß werden die gewünschte Menge an Protein + 7,5 µl 4x LDS Sample Buffer
+ 1 µl 0,5 M DTE gegeben und mit destillierten Wasser auf 25 µl aufgefüllt.
 Den Ansatz für 10 Minuten auf 70°C inkubieren.
 In einem Reagiergefäß den Proteinstandard vorbereiten: 15 µl destilliertes Wasser + 10 µl
Protein Standard + 5 µl 4x LDS Sample Buffer.
 30 ml vom 20x MOPS Running Buffer in den 1000 ml Messzylinder geben und mit destillierten Wasser auf 600 ml auffüllen.
 Das Gel aus der Verpackung nehmen, mit Wasser spülen und vorsichtig den Kamm sowie den
weißen Streifen entfernen.
 Gele mit der Schrift nach außen in die Elektrophoresekammer einspannen (darauf achten das
sie sich auch richtig schließen lässt!).
 Den MOPS-Buffer in den Zwischenraum zwischen den zwei Gelen schütten (bis über die Slots
des Geles; es muss dicht sein!) und 500 µl der Antioxidans-Lösung dazugeben.
 Den restlichen Buffer in die Elektrophoresekammer schütten.
 Die Slots der Gele mit der Bufferlösung durchspülen (mit Pipette auf- und abpipettieren).
 Den Standard und die Proteinproben vorsichtig und langsam in die Gelslots pipettieren (darf
nicht in ein anderen Slot gelangen!). In leerbleibende Slots 15µl destilliertes Wasser + 5 µl 4x
LDS Sample Buffer pipettieren.
 Elektrophoresekammer verschließen und die Elektrophorese für 1 Stunde bei 175 Volt laufen
lassen.
 Nach der Gelelektrophorese das Plastik um das Proteingel vorsichtig öffnen und das Gel in
eine Petrischale legen.
 Ca. 20 ml des Simply Blue Safe Stains zum Gel geben.
 Das Gel für 1 Stunde auf einem Schüttler mit geringen rpm geben.
 Nach der Stunde sind die Proteinbanden am Gel sichtbar.
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6. DNA-Isolation aus Bakterienzellen
Man benötigt:
Pipetten (100µl und 1000 µl)
Pipettenspitzen
Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml)
Becherglas
Destilliertes Wasser
P1 Buffer (50mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 100µg/ml RNase A)
TENS Buffer (50 mM NaOH; 5 mM HCL; 0,5% SDS)
3 M Natriumacetat pH 5,2
100% Ethanol
70% Ethanol
Aufgaben:
Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen
Durchführung:
 1,5 ml der Bakterienkultur werden in ein Reagiergefäß gegeben und bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert.
 Der Überstand wird abgeschüttet oder abpipettiert (vorsichtig damit das Pellet nicht mitentsorgt wird)
 Das Pellet wird in 50 µl des P1 Buffers gelöst (auf- und abpipettieren)
 Zur Lösung werden 300 µl des TENS Buffers gegeben und wird durch fünfmaliges invertieren
des Reagiergefäßes durchmischt.
 Danach werden 100 µl des 3 M Natriumacetatlösung zur Probe gegeben und erneut gemischt.
 Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren.
 Der Überstand wird in ein neues Reagiergefäß überführt (vorsichtig pipettieren).
 Zum Überstand wird 1 ml eiskalter 100% Ethanol gegeben.
 Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren.
 Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet wird mit 0,5 ml 70% Ethanols gewaschen
(vorsichtig invertieren).
 Das Ethanol wird nach dem Waschen vorsichtig abpipettiert (es muss sämtliche Flüssigkeit
entfernt werden) und das Pellet wird für 10 Minuten bei geöffneten Reagiergefäß luftgetrocknet.
 Das luftgetrocknete Pellet wird in 30 µl destillierten Wassers gelöst (auf- und abpipettieren).
 Bei dem gelösten Pellet handelt es sich um die Plasmid-DNA (Ansatz A).
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7. Schneiden von Plasmiden mit Enzymen
Man benötigt:
Pipetten (2µl und 20 µl)
Pipettenspitzen (mit Filter)
Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml)
Box mit Eis
Plasmid-DNA
Restriktionsenzyme
Buffer für die Enzyme (CutSmart Buffer und NEBuffer 3.1)
Aufgaben:
Schneiden des HisMax C Plasmids mit zwei Restriktionsenzymen.
Durchführung:
 Jeweils 1 µg der Plasmid-DNA in zwei Reagiergefäß (Ansätze B und C) pipettieren und auf 16
µl mit destillierten Wasser auffüllen.
 2 µl vom Enzymbuffer sowie zum Ansatz B 1µl eines Restriktionsenzyms und zum Ansatz C
jeweils 1 µl von zwei Restriktionsenzymen dazu pipettieren (Enzyme mit Filterspitzen langsam „einrühren“).
 Ansätze bei 37°C in ein Wasserbad für 30 Minuten inkubieren.
 Nach den 30 Minuten ist die Plasmid-DNA geschnitten und kann auf ein Agarosegel aufgetragen werden.
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8. Gelelektrophorese mit DNA
Man benötigt:
Pipetten (10 µl und 100 µl)
Pipettenspitzen
Erlmeyerkolben
Messzylinder
DNA-Probe
1x TAE-Buffer
Agarose
6x Loading Dye
DNA-Farbstoff
DNA-Standard (GeneRuler Laddermix)
Aufgaben:
Auftrennung und Sichtbarmachung von DNA.
Durchführung:
 Die Gelkammern sowie die Gussform für das vorbereiten.
 Für ein 140 ml 1%iges Agarosegel mit 20 Slots werden 1,4 g Agarose eingewogen.
 Die Agarose wird in einen Erlmeyerkolben gegeben und es werden 140 ml 1x TAE-Buffer dazugegeben.
 Der Buffer wird nun bis zum Aufkochen erhitzt (die Lösung muss klar sein).
 Danach werden 12 µl des DNA-Farbstoffes zur Agaroselösung gegeben.
 Die Lösung in die Gussform schütten und sichergehen das keine großen Luftblasen vorhanden sind.
 Die „Kämme“ für die Slots im Gel einsetzen.
 Das Gel aushärten lassen (dauert circa 30 Minuten)
 In der Zwischenzeit zu der vorher im Punkt 6 gewonnenen DNA (Ansatz A) 5 µl des 6x Loading
Dye geben. Zu der in Punkt 7 geschnittenen Plasmid-DNA (Ansätze B und C) jeweils 3,3 µl des
6x Loading Dye geben. Zusätzlich als Kontrolle 1 µg des ungeschnittenen Plasmids aus Punkt
7 in neues Reagiergefäß pipettieren und auf 20 µl mit destillierten Wasser auffüllen (Ansatz
D). Zum Ansatz D ebenfalls 3,3 µl des 6x Loading Dye geben.
 Nachdem das Gel ausgehärtet ist, vorsichtig die Kämme entfernen und es in die Elektrophoresekammer geben.
 Die Elektrophoresekammer mit 1x TAE-Buffer auffüllen bis das Gel komplett in der Flüssigkeit
eingetaucht ist.
 Vorsichtig den DNA-Standard sowie die DNA-Proben (Ansätze A, B, C und D) in die Slots pipettieren (darf nicht in die anderen Slots gelangen).
 Das Gel für 45 Minuten bei 110 Volt laufen lassen.
 Danach kann man unter UV-Licht (Augen schützen!) die DNA-Banden erkennen.
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