Analysis of the Molecular Response of Pseudomonas putida

Ausarbeitung Biotechnologie Seminar; Anna Gebler
Analysis of the Molecular Response of Pseudomonas putida
KT2440 to the Next-generation Biofuel n-Butanol
Simon et al. Journal of Proteomics 2015
1. Einleitung
n-Butanol stellt eine wichtige Bulk-Chemikalie dar, die in der plastikverarbeitenden
Industrie, als industrielles Lösungsmittel, als Kraftstoffzusatz oder als kompletter
Benzinersatz verwendet wird. n-Butanol wird hauptsächlich durch chemische
Synthese aus Reinbenzin gewonnen, kann aber auch durch mikrobiologische
Fermentation hergestellt werden. Die biotechnologische Herstellung mithilfe von
Clostridium erzielt jedoch schlechte Ausbeuten. Eine Limitierung stellen dabei die
Sporenbildung,
der
Verlust
der
Plasmide,
die
die
essentiellen
lösungsmittelbildenden Gene tragen, und die Degradation der Stämme durch
Ansammlung von toxischen organischen Verbindungen dar. Das größte Problem
stellt die Cytotoxizität von Butanol dar. Butanol und seine Nebenprodukte
interferieren mit der Zellmembran und erhöhen dadurch die Membranfluidität,
wodurch der Ionengradient an der Zellmembran schlecht aufrecht erhalten werden
kann, was wiederum Zellschädigung zur Folge hat. Die Butanolproduktion mit
Clostridien ist auf 13 g/l begrenzt. Ein alternativer Wirt für die Butanolproduktion
muss folgende Eigenschaften mitbringen: hohe intrinsische Toleranz gegenüber
Butanol, leichte Zugänglichkeit für Metabolic Engineering, Verwendung von
Lignozellulose als Substrat, um die Kosten für Rohstoffe möglichst gering zu halten.
2. Pseudomonas als potentieller Wirt für die n-Butanol Produktion
Pseudomonas Spezies sind Gram-negative Bakterien. Die meisten oben genannten
Voraussetzungen für die Butanolproduktion werden von Pseudomonas erfüllt, sie
sind metabolisch wandelbar und zeigen eine gute Toleranz gegenüber einem
breiten Spektrum von aromatischen und aliphatischen Verbindungen. Im Rahmen
dieser Studie wurde der Referenzstamm P. putida KT2440 ausgewählt um die
Auswirkungen von n-Butanol auf das Proteom zu untersuchen. Im Zuge dessen
wurde der Abbau von n-Butanol untersucht um die Stoffwechselwege zu
rekonstruieren, die involviert sind. Dabei können Schlüsselenzyme identifiziert
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werden, die in weiteren Studien zur Butanolproduktion verwendet werden können.
Voraussetzung für die erfolgreiche Produktion von n-Butanol ist zunächst die
Kenntnis über den Abbau, um diesen zu vermeiden, bzw. die Nebenproduktbildung
einzugrenzen. Wachstumsexperimente mit verschiedenen Butanolkonzentrationen
zeigten, dass Butanol das Wachstum von P. putida deutlich erhöht.
3. Proteomik
Um den Abbau von Butanol möglichst gut untersuchen zu können und möglichst
viele Proteine identifizieren zu können wurden drei komplementäre ProteomikAnsätze verwendet.
Abbildung 1: komplementäre Proteomik. Alle drei Ansätze wurden mit P. putida KT2440 Zellen
durchgeführt, die vor der Zugabe von Butanol und jeweils eine Stunde nach der Zugabe von 0,5
oder 3 g/l Butanol geerntet wurden.
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Im Rahmen der 2-D DIGE wurden 86 Proteinspots gefunden, die erhöhtes
Vorkommen aufwiesen, wenn Butanol zugefügt wurde. Innerhalb dieser 86
Proteinspots konnten 109 Proteine identifiziert werden. Bei dem Ansatz der LCMS/MS konnten 41 % der 524 gefundenen Proteine identifiziert werden und bei der
GeLC-MS/MS konnten 125 Proteine identifiziert werden, die mit einer veränderten
Häufigkeit auftraten. Zusammengefasst wurden 1467 Proteine identifiziert und
quantifiziert, was ca. 28 % des gesamten Genoms von P. putida KT2440 ausmacht.
4. Butanol Metabolismus
Durch die Proteomanalysen konnte ein erhöhtes Auftreten der Proteine festgestellt
werden, die zum agmR Gencluster gehören. Außerdem wurde eine erhöhte Menge
an Enzymen des Fettsäure-β-Oxidationsweges festgestellt. Hinzu kommt, dass der
Stoffwechselweg durch den Citratzyklus erhöht ist, wenn Butanol vorhanden ist. Die
Enzyme, die ein erhöhtes Vorkommen in der Anwesenheit von Butanol zeigen sind
in Abb. 2 blau markiert.
Abbildung 2: Anordnung der Gene, die im Butanolabbau in P. putida KT2440 beteiligt sind
(verändert nach Simon et al.)
Der Butanolabbau, der in dieser Studie vorgeschlagen wird ist in der folgenden
Abbildung dargestellt. Butanol wird zunächst durch die Alkoholdehydrogenasen
PedE
und
PedH
zu
Butylaldehyd
oxidiert
und
anschließend
durch
die
Aldehyddehydrogenase PedI zu Butylsäure umgewandelt. Die Butylsäure wird dann
weiter durch Enzyme des Fettsäure-β-Oxidationsweges abgebaut, bis Acetyl-CoA
entsteht, welches in den Citratzyklus eingeschleust werden kann. Dieser
Stoffwechselweg zum Abbau von Butanol wurde aufgrund des deutlich erhöhten
Vorkommens der beteiligten Enzyme bei der Zugabe von Butanol rekonstruiert.
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Abbildung 3: Stoffwechselweg des Butanolabbaus in P. putida KT2440.
5. Analyse von PedE und PedH Mutanten
Da die beiden Alkoholdehydrogenasen in der Anwesenheit von Butanol signifikant
hochreguliert waren und da sie den Anfang des Butanolabbaus darstellen wurden
Mutanten dieser Enzyme untersucht. Die erzeugten Einzelmutanten zeigten keine
signifikanten Änderungen im Wachstum, was darauf hindeutet, dass P. putida
KT2440 in der Lage ist die Enzyme PedE und PedH in redundanter Art und Weise
einzusetzen. Die Doppelmutanten hingegen zeigten ein deutlich verringertes
Wachstum. Ein weiteres Experiment mit zusätzlicher Deletion von PedI führte zu
einer weiteren Reduktion der Wachstumsrate, jedoch wurde das Wachstum nicht
komplett inhibiert. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Enzyme PedE, PedH
und PedI zumindest teilweise durch andere ersetzt werden können. Durch die
Experimente mit verschiedenen Mutanten konnte verifiziert werden, dass alle drei
Enzyme am Butanolabbau beteiligt sind.
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6. Zusammenfassung und Ausblick
Zusammenfassend wurde durch diese Studie ein erhöhtes Vorkommen folgender
Enzyme nachgewiesen: Enzyme, die am Butanolabbau beteiligt sind, Enzyme des
Citratzyklus, Quinoprotein Alkoholdehydrogenasen, Aldehyddehydrogenasen und
Enzyme des Fettsäure-β-Oxidationsweges. Diese Enzyme stellen interessante Ziele
für Metabolic Engineering dar. Weiterhin könnte die komplette Aufklärung des
Butanolabbaus ein Ziel für die anknüpfende Forschung darstellen. Auch die
Enzyme, die PedE und PedH ersetzen müssen identifiziert und im Falle einer
Butanolproduktion mit P.putida KT2440 deletiert werden.
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