Sandwich-ELISA zur Identifizierung von Fischallergen

Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmitteltechnologie
Studiengang Bioprodukttechnologie
Sandwich-ELISA zur Identifizierung von
Fischallergen
Bachelorarbeit
Vorgelegt von:
Juliane Schleinstein
Betreuer:
Prof. Dr. rer. nat. Christine Wittmann
M.Eng. Manuela Henke
Neubrandenburg, den 05.03.2012
URN:
urn:nbn:de:gbv:519-thesis2012-0024-1
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Abstract
The main target of the work “Sandwich-ELISA for the identification of fish allergen”
comprehends the discovery of a combination of monoclonal antibodies in a SandwichELISA-technique to detect the fish allergen Parvalbumin in different fish species.
Reference material comes from the fish species codfish, herring, Alaska coalfish, redfish,
tuna and tilapia. The Sandwich-ELISA was operated with primary and secondary
monoclonal antibodies. The secondary antibodies were labeled with horse radish
peroxidase to uncover the antigen-antibody-reaction. The activity of this antigen-antibody
complex was tested with different HRP-labeled secondary antibodies and different
concentrations of fish species.
An efficient antibody combination could be found, which detected five of six assayed fish
antigens. Thereby this antibody combination is multireactive, because it could
substantiate the similar Parvalbumine of different fish species. It had the qualitative
detection at an antigen concentration of 100 ng/ml. Therefore, more assays have to be
performed.
3
Abstract ..........................................................................................................................................2
Verzeichnis verwendeter Abkürzungen .......................................................................................4
1 Einleitung ....................................................................................................................................5
1.1 Fisch als Allergen- Parvalbumin ......................................................................................6
1.2 Allergenkennzeichnung auf verpackten Lebensmitteln ...................................................7
1.3 Nachweisverfahren von Allergenen .................................................................................8
1.3.1 Nachweismethode ELISA ...................................................................................8
2 Material und Methoden ........................................................................................................... 11
2.1 Material .......................................................................................................................... 11
2.1.1 Allgemeine Chemikalien ................................................................................... 11
2.1.2 Puffer und Lösungen..........................................................................................12
2.1.3 Monoklonale Antikörper von Biometec GmbH ................................................13
2.1.4 Antigen- Fischextrakte .......................................................................................13
2.1.5 Messgeräte .........................................................................................................14
2.2 Methoden .......................................................................................................................14
2.2.1 HRP-Labeling ....................................................................................................14
2.2.2 Sandwich-ELISA ...............................................................................................16
3 Ergebnisse .................................................................................................................................18
3.1 HRP-Labeling ................................................................................................................18
3.2 Sandwich-ELISA ...........................................................................................................20
3.2.1 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G11als Referenz .............................20
3.2.2 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G7...................................................21
3.2.3 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak E9 ...................................................22
3.2.4 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak D12.................................................23
3.2.5 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak C9 ...................................................24
4 Diskussion ..................................................................................................................................25
5 Ausblick .....................................................................................................................................28
6 Zusammenfassung ....................................................................................................................29
7 Verzeichnisse .............................................................................................................................30
7.1 Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................30
7.2 Tabellenverzeichnis ........................................................................................................30
7.3 Literaturverzeichnis........................................................................................................30
8 Anhang .......................................................................................................................................32
Anhang 1 ..............................................................................................................................32
Anhang 2 ..............................................................................................................................33
Anhang 3 ..............................................................................................................................34
Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit .....................................................36
4
Verzeichnis verwendeter Abkürzungen
Abkürzung
bzw. Symbol
Bezeichnung
ELISA
Enzym linked immuno sorbent assay (Enzymgekoppelter
Immunadsorbtionstest)
PCR
Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
HRP
Horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
TMB
Tetramethylbenzidin
BSA
Bolvine serum albumin (Rinderserumalbumin)
PBS
Phosphat buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)
DNA
Desoxyribonuclein acid (Desoxyribonukleinsäure)
RT
Raumtemperatur
Ak
Antikörper
K
Kabeljau
H
Hering
R
Rotbarsch
A.S.
Alaska Seelachs
Th
Thunfisch
T
Tilapia
D5
Wi 11 3G 9D5
G7
Wi 11 3D12G7
E9
Wi 11 3G4F9
D12
Wi 115H1D12
5
1 Einleitung
Fisch ist ein wertvolles Lebensmittel. Laut eines 2001 veröffentlichten Rückblicks zum
Thema „Berufsbezogene Fisch- und Meeresfrüchteallergien“ aus der Zeitung Occuptional
and Environmental Medicine werden ca. 72 Prozent des weltweiten Fischfangs zu
Lebensmitteln verarbeitet. Die Nachfrage nach Fisch aller Art ist groß und führt häufig in
der Fischerindustrie zu Überfischung wertvoller Fische und damit zu Lieferengpässen.
Fischarten wie Seezunge oder Rotzunge sind davon betroffen und werden oft in
komplexen Produkten mit minderwertigen Fischen anderer Art mit ähnlichen
sensorischen Qualitäten ersetzt. Steigende Komplexität der Lebensmittelprodukte und
stetig wachsende Produktpaletten erfordern hohe Produktsicherheit und ständige
Überwachung.
Besonders
Lebensmittelzutaten
von
für
Allergiker
großer
ist
Bedeutung.
eine
Nicht
genaue
selten
Deklaration
sind
aller
versteckte
Fischkomponenten, besonders oft in importieren Waren, enthalten, die nicht deklariert
werden. Es besteht dann beim Verzehr dieser Produkte für Fisch-Allergiker ein großes
Gesundheitsrisiko. Selbst Spuren von Fisch in Lebensmitteln können bei Allergikern zu
allergischen Reaktionen wie Hautrötungen, Asthma oder Nesselsucht führen, bis hin zu
gastrointestinalen Symptomen wie Diarrhö, Übelkeit, Erbrechen oder einem anaphylaktischen Schock.
Hauptverursacher dieser allergischen Reaktionen von Fisch ist größtenteils ein Protein –
das Parvalbumin. Es ist ein niedermolekulares Muskelprotein vieler Fische, dessen
allergieauslösende Konzentration laut der Veröffentlichung „Berufsbezogene Fisch- und
Meeresfrüchteallergien“ im Bereich von 0,001 bis 5,061 μg/m3 Luft liegt. Analytisch
lassen sich diese Proteine mit dem immunologischen ELISA-Verfahren (Enzym Linked
Immuno Sorbent Assay-Verfahren) nachweisen. Mit diesem Verfahren lassen sich selbst
Spuren von Allergenen qualitativ wie auch quantitativ bestimmen. In dieser Arbeit soll
ein solches Verfahren für den Nachweis von Parvalbumin in verschiedenen Fischarten
optimiert werden. (Lehrer;Lopata,A,2009); (Jeebhay; Robins; Lehrer.; Lopata, 2001);
(Heinrich, 2009); (Swoboda, 2011)
6
1.1 Fisch als Allergen-Parvalbumin
Fisch ist ein großer Eiweißlieferant und Träger vieler essentieller Aminosäuren und gilt
daher als wichtiger Bestandteil in der menschlichen Ernährung. Zudem enthält Fisch
wichtige Mineralstoffe wie Jod, Selen und Vitamine. Aufgrund des hohen Eiweißgehaltes
zählt Fisch neben Getreide und Hülsenfrüchte jedoch zu den häufigsten Auslösern von
Lebensmittelallergien.
Unter
Lebensmittelallergien
versteht
man
unkontrollierte
Überreaktionen des Körpers auf bestimmte Zutaten von Lebensmitteln. Vom
körpereigenen Immunsystem werden diese normalerweise unschädlichen Substanzen als
Eindringlinge betrachtet und wirken dadurch als Auslöser von Abwehrreaktionen. (Max
Rubner Institut, 2011)
Allergien gegen Fisch kommen vor allem in Ländern mit hohem Fischkonsum vor. Als
Hauptallergen bei Fischen gilt das Fischprotein Parvalbumin. Dieses Protein kommt
sowohl bei niederen Wirbeltieren, wie bei Fischen als Muskelprotein, als auch in höheren
Wirbeltieren im Zentralnervensystem vor. Dabei ist die Parvalbuminkonzentration in
weißem Muskelfleisch höher als im dunklen Muskelfleisch. Das weiße Muskelfleisch
wirkt daher stärker allergen. Parvalbumin ist niedermolekular, kalziumbindend und
besitzt eine hohe Hitzeresistenz. Aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber
hohen Temperaturen, sauren Agenzien und proteolytischen Enzymen gilt dieses Protein
bei 95 % der Fischallergiker als ein hoch potent sensibilisierendes Molekül. Parvalbumin
zählt
zu
den
EF-Hand-Proteinen,
welche
durch
sogenannte
EF-Hand-Motive
charakterisiert sind. Diese Motive sind bestimmte Aminosäurestrukturen in Proteinen,
welche durch die Form Helix-Loop-Helix gekennzeichnet sind. Ein Loop besteht dabei
aus zwölf Aminosäuren, der räumlich zu einer Schleife geformt ist, in dessen Mitte
Moleküle eingelagert und gebunden werden können. In der folgenden Abbildung 1 ist
beispielhaft ein EF-Hand-Motive des Parvalbumin dargestellt.
Abb. 1: EF-Hand-Motiv eines Parvalbumins
Fisch enthält eine Vielzahl an Proteinen, wovon bisher wenige als Allergene identifiziert
wurden, wie beispielsweise das Allergen Gad c1. Dieses als erstes isolierte und als
Parvalbumin identifizierte Fischallergen stammt von der Fischart Kabeljau ab. Bisher
wurden von weiteren Fischarten Allergene identifiziert, die ähnliche Aminosäuren-
7
sequenzen wie das Gad c1 aufweisen. Diese sind in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet.
Tab. 1: Beispiele identifizierter Parvalbumine verschiedener Fischarten
Fischart
Fischallergenbezeichnung
Kabeljau
Gad c1, Gad m1
Lachs
Sal s1
Karpfen
Cyp c1
Markrele
Sco j1, Sco a1, Sco s1
Auf Grund der Ähnlichkeiten der genannten Parvalbumine sind hohe Kreuzsensibilisierungen vorhanden, wodurch Fischallergiker meist nicht nur gegen eine Fischart
sondern gegen mehrere Fischarten allergisch reagieren. (Iron, 2009); (Swoboda, 2011);
(Gajewski; Hsieh, 2009)
1.2 Allergenkennzeichnung auf verpackten Lebensmitteln
Aus verbraucherrechtlichen Gründen ist es von großer Bedeutung, in Lebensmitteln
enthaltene Allergene zu deklarieren, auch wenn diese nur in sehr geringen Mengen oder
gar in Spuren enthalten sein können. Fisch und Fischerzeugnisse gehören zu den 14
„allergenen“ Zutaten, die bei sensibilisierten Menschen Lebensmittelallergien oder
Lebensmittelunverträglichkeiten verursachen können. Aus diesem Grund unterliegen
diese 14 Allergene laut der RL 2000/13/EG (Anhang IIIa) der Allergenkennzeichnungspflicht. Die Wiberg GmbH schrieb dazu: „Allergene müssen in der Zutatenliste
aufgeführt werden, sofern sie in einem Lebensmittel als Zutat vorhanden sind, es sich um
technologische Hilfsstoffe handelt oder auch wenn es sich um die Zutat einer
zusammengesetzten Zutat oder um sogenannte ‚carry-over-Zutaten‘ aus Vorstufen
handelt“.
Das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BEMLV)
veröffentlichte:“ Seit dem 25. November 2005 müssen grundsätzlich alle Zutaten, die in
einer zusammengesetzten Zutat, wie etwa Fruchtfüllungen in Backwaren, enthalten sind,
angegeben werden“. Es gibt jedoch Ausnahmen, bei denen die Kennzeichnungspflicht
nicht gilt. Dies ist der Fall bei Stoffen, die durch die Verarbeitung oder den
Herstellungsprozess ihr allergenes Potential verlieren. Zu diesen Ausnahmen gehört
beispielsweise Fischgelatine als Träger bei Vitaminzubereitungen oder als Klärhilfsmittel.
In einer neuen Verordnung, die EU-Verordnung Nr. 1169/2011, welche ab 2014 in Kraft
8
tritt, sollen kennzeichnungspflichtige allergen-wirkende Zutaten in dem Zutatenverzeichnis besonders hervorgehoben werden. Zudem sollen zusätzlich unverpackte
Lebensmitteln, wie beispielsweise Speisen aus der Kantine oder unverpackte
Fleischerzeugnisse in der Fleischteke, gekennzeichnet werden, sofern diese Allergene
enthalten. (BMELV), (Wiberg GmbH, 2007)
1.3 Nachweisverfahren von Allergenen
Die Identifizierung von Proteinen bzw. Allergenen erfolgt zum größten Teil über
proteinchemische Tests. Zur Proteinbestimmung eignen sich elektrophoretische Testverfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und immunologische Testverfahren wie
Enzym- oder Radioimmunoassays (ELISA). Das PCR-Verfahren basiert auf der
Unterscheidung verschiedener Proteine auf der Grundlage der DNA. Für die Selektion
von Fischallergen sind bereits PCR-Methoden im Einsatz. Aus (Schülz, 2009) geht
hervor, dass der Nachweis von Parvalbumin aus Makrelen mit Hilfe eines PCRVerfahrens möglich ist. Dieser Test kann qualitativ und quantitativ für den Nachweis von
Fischallergenen eingesetzt werden. PCR-Verfahren sind aufwendige und zeitintensive
Untersuchungsverfahren, die spezifisch Parvalbumine bestimmen. Es gibt jedoch eine
Vielzahl an Fischarten mit unterschiedlichen Parvalbuminen, die alle Allergien auslösen
können. Daher wäre ein unspezifisches Nachweisverfahren für alle Fischparvalbumine
von Vorteil. Die Methode des Sandwich-ELISAs bietet die Möglichkeit diese
Fischantigene unspezifisch zu erkennen. Bei der Analyse von biologischem Material
mittels immunologischen Verfahren wird die Selektivität der Antikörper-AntigenReaktion zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen genutzt. Das
Prinzip der ELISA-Methode wird im folgenden Kapitel näher erläutert.
Beispiele für ältere Methoden zur Identifizierung von Proteinen sind unter anderem die
isoelektrische Fokussierung von Fischproteine, d. h. die Identifizierung der Proteine über
den charakteristischen isoelektrischen Punktes, oder photometrische Bestimmungen.
(Heinrich,2009); (Heinrich,2011); (Korte, 2004); (Schülz, 2009)
1.3.1 Nachweismethode ELISA
ELISA (Enzym linked immuno sorbent assay) bedeutet übersetzt enzymgekoppelter
Immunadsorptionstest. Dieses Nachweisverfahren basiert auf einer enzymkatalysierten
Farbreaktion einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Als Antigene können verschiedene
Substanzen wie Proteine, Viren, Hormone und Toxine wirken. In dieser Arbeit werden
9
Fischextraktproben als Antigene eingesetzt. Gegen diese Antigene richten sich
spezifische Abwehrzellen, die Antikörper. Diese Antikröper erkennen über eine
bestimmte Bindungsstelle (Paratop) spezifisch das gesuchte Epitop am Antigen. Mit dem
Einsatz von Markerenzymen kann die spezifische Antigen-Antikörper-Kopplung durch
eine Farbumsetzung sichtbar gemacht und photometrisch gemessen werden. Dieses
Nachweisverfahren findet in vielen Bereichen Anwendung, z. B. in der Lebensmittelindustrie, der Medizin und Pharmazie.
Es gibt verschiedene ELISA-Techniken. Hauptsächlich unterscheidet man zwischen
indirekter, kompetitiver ELISA und Sandwich-ELISA. Bei einem kompetitiven ELISA
sind Antigenreferenzmaterialien mit Enzymen gekoppelt, die mit freiem Antigen aus der
Probe um die freien Bindungsstellen an den Antikörpern konkurrieren. Hier ist die
enzymkatalysierte Farbstoffkonzentration umgekehrt proportional zur Menge des
Antigens. Im Gegensatz dazu dient der Sandwich-ELISA dem Nachweis hochmolekularer Verbindungen, bei der das Substrat-Enzym an einen sekundären Antikörper
gekoppelt ist. Das Antigen besitzt zwei Bindungsstellen und wird, bildlich gesehen, in
einem Sandwich von zwei Antikörpern umgeben (Abb.2). Ist dies der Fall, erfolgt nach
einer Substratzugabe eine enzymkatalysierte Farbstoffumsetzung, die direkt proportional
der Menge des Antigens ist.
Abb. 2: Prinzip eines Sandwich-ELISA
(http://www.cellsignal.com/ddt/elisa_line.html)
Bei diesem Sandwich-ELISA-Verfahren ist es wichtig, dass man spezifische Antikörper
einsetzt, sogenannte monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, an einer spezifischen
Bindungsstelle (Epitop) am Antigen zu binden. Diese monoklonalen Antikörper stammen
10
aus geklonten Zelllinien von B-Lymphozyten eines Versuchstieres. Diese spezifischen
monoklonalen Antikörper werden an ein Trägermaterial (96-well Mikrotiterplatten)
gebunden und das zu untersuchende Antigen wird dazu gegeben. Anschließend wird ein
weiterer enzymmarkierter monoklonaler Antikörper hinzugegeben, welcher die gleiche
Affinität gegen das gesuchte Antigen besitzt. Als Enzym findet häufig die
Meerrettichperoxidase (HRP) Anwendung, welche zu der Klasse der Peroxidasen gehört.
Diese Enzyme sind in der Lage Peroxide zu radikalisieren, so kann z. B. als Substrat
Wasserstoffperoxid eingesetzt und durch den Einsatz von HRP in zwei Hydroxy-Radikale
gespalten werden. Diese Radikalisierung kann durch den Einsatz von Indikatorfarbstoffen
sichtbar gemacht werden. Diese Farbstoffe werden durch die Hydroxy-Radikale
protoniert, indem ihnen ein Elektron entzogen wird. Dadurch kommt es zu einer
Blaufärbung. Als Farbstoff kann beispielsweise Tetramethylbenzidin (TMB) eingesetzt
werden. Nach Zugabe einer Stopplösung, meist mittels einer Mineralsäure, wird das
Enzym denaturiert und der Farbstoff erfährt eine weitere Protonierung, was zum
Farbumschlag nach Gelb führt. Im Wellenlängenbereich von 450 nm kann die Farbkonzentration
des
protonierten
Farbstoffes
photometrisch
bestimmt
werden.
(Schleinstein, 2011); (Baltes,1995); (Holtzhauer 1996)
Ziel dieser Bachelorarbeit ist es, unterschiedliche Antikörperkombinationen zu
untersuchen, welche unspezifisch der Fischart gegenüber spezifisch Fisch- Parvalbumin
erkennen. Dabei gilt vorerst ein rein qualitativer Nachweis dieses Allergens. Die
Multireaktivität der Antikörperkombinationen wird mit den Fischantigenen der Fischarten
Kabeljau, Hering, Alaska Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und Tilapia getestet. Dabei
handelt es sich um reine Fischextrakte.
11
2 Material und Methoden
2.1 Material
Im Folgendem sind die verwendeten Materialien aufgeführt.
2.1.1 Allgemeine Chemikalien
Substanz
Summenformel,
Bezeichnung
Hersteller
di-Natriumcarbonat
Na2CO3
Merck KGaA
Natriumhydrogencarbonat
NaHCO3
Merck KGaA
Dimethylsulfoxid
C2H6OS
Merck KGaA
NatriumdihydrogenphosphatDihydrat
NaH2PO4 × 2H2O
Carl Roth GmbH&
Co. KG
di-NatriumhydrogenphosphatDihydrat
Na2HPO4 × 2H2O
Carl Roth GmbH&
Co. KG
Polyoxyethylen-sorbitanmonolaurat
(Tween 20)
C58H114O26
Sigma-Aldrich Co
Bovine Albumin Serum (BSA)
-
Sigma-Aldrich Co
Tetramethylbenzidin
C16H20N2
Sigma-Aldrich Co
Natriumacetatpuffer
CH3COONa
Sigma-Aldrich Co
Ethanol p.a.
C2H5OH
Merck KGaA
Natriumchlorid p.a.
NaCl
Merck KGaA
Milchpulver
-
Merck KGaA
Wasserstoffperoxid 1%ig p.a.
H2O2
Merck KGaA
Schwefelsäure c = 2 mol/l (4N) p.a.
H2SO4
Merck KGaA
Salzsäure (Tris HCL) p.a.
C4H11NO3HCL
Merck KGaA
Merrettichperoxidase p.a.
EZ-link Plus Activated
Peroxidase
Merck KGaA
Sodium Cyanoborohydride p.a.
-
AppliChem GmbH
Reinst-Wasser
H2 O
12
2.1.2 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden mit destilliertem Wasser hergestellt.
Puffer für HRP-Labeling
Substratpuffer-PBS, 80 mmol/l, pH 7,6
Rezeptur: 1,43 g des NaH2PO4 × 2H2O wird mit 13,46 g Na2HPO4 × 2H2O und
8,5 g NaCl vermengt und mit Reinst-Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die fertige
Lösung wird bei 4 °C gelagert.
Quenching Puffer: 3 M Ethanolalamin, pH 9
Rezeptur: Dieser Puffer wird nach p.a. hergestellt.
Reagenzien für HRP-Labeling
Merrerttichperoxidase: Diese ist 1 mg „lyophilized EZ-link Plus Activated Peroxidase“,
welche die Firma Piercenet als p.a. geschickt hat.
Reduktionsmittel - Sodium Cyanoborohydride, ebenfalls p.a.
Puffer für Sandwich-ELISA
Substratpuffer
Rezeptur: 25 ml 0,1 mol/l Natriumacetatpuffer, mit 10%iger Zitronensäure auf pH
5,5 eingestellt, mit 400 μl Tetramethylbenzidin (TMB) und 100 μl 1%ige H2O2
vermengt.
Stopplösung 4 N H2SO4, nach p.a.
Coatpuffer: Natriumkarbonat-Puffer, 50 mmol/l, pH 9,6
Rezeptur: 1,70 g Na2CO3 mit 2,86 g NaHCO3 vermengen und mit dest. Wasser
auf 1 l auffüllen.
Assaypuffer: PBS (phosphat buffered saline), 80 mmol/L, pH 7,6
Rezeptur: Gleiche Herstellung, wie Substratpuffer der HRP-Labeling.
Waschpuffer: PBS, 80 mmol/l, pH 7,6 + 0,05% Tween 20
Rezeptur: 199,9 ml PBS-Puffer (Assaypuffer) mit 0,1 ml Tween vermischen und
mit 1,8 l dest. Wasser auf 2 l auffüllen.
13
2.1.3 Monoklonale Antikörper von Biometec GmbH
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgt durch eine Immunisierung von
Versuchstieren. Dabei wird dem Versuchstier ein Antigen injiziert, um dagegen
spezifische Antikörper zu produzieren. Die Bildung der monoklonalen Antikörper erfolgt
nicht wie bei den polyklonalen Antikörpern im Blut, sondern in den sogenannten BLymphozyten der Milz. Über Entnahme der B-Zellen, deren Fusionierung mit
Tumorzellen und die Kultivierungen auf bestimmten Nährlösungen können gezielte
Antikörper produziert und über Klonierungen vervielfältigt werden. Diese Antikörper
sind dann für ELISA-Techniken einsetzbar. (Avondet,Hofmann,Landolt)
Für diese Bachelorarbeit wurden die benötigten monoklonalen Antikörper tiefgefroren als
eine unbehandelte Stammlösung von der Firma Biometec GmbH aus Greifswald der
Hochschule Neubrandenburg zur Verfügung gestellt. Für den Einsatz der Antikörper in
einem immunologischen Testverfahren als Sandwich-Komplex mussten diese noch
mittels einer Affinitätschromatographie vorbereitet werden. Die in der Tabelle 2
aufgelisteten aufgereinigten Antikörper wurden verwendet, wobei der Antikörper Wi
113G9 D5 bei allen Versuchen als primärer Antikörper eingesetzt wurde.
Tab. 2: Liste über verwendete Antikörper
Antikörper
Wi 113G 9 D5
Wi 113D12 G7
Wi 113G4 E9
Wi 115H1 D12
Wi 114B10 C9
Proteinkonzentration (mg/ml)
2,8
3,6
3,5
1,8
1,8
Klassifizierung
Synonym
primärer Ak
sekundärer Ak
sekundärer Ak
sekundärer Ak
sekundärer Ak
D5
G7
E9
D12
C9
2.1.4 Antigen- Fischextrakte
Tab. 3: Liste über verwendete Fischextrakte als Antigene
Fischextrakte
Kabeljau
Hering
Alaska Seelachs
Rotbarsch
Thunfisch
Tilapia
Probenkonzentration
in mg/ml
2,09
2,27
1,71
3,56
18,50
10,30
Synonym Fischantigen
K
H
A.S.
R
Th
T
Die Tabelle 3 listet die verwendeten Fischproben auf. Hierbei handelt es sich um die
Fischrohextrakte von Kabeljau, Hering, Alaska Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und
14
Tilapia. Die Gewinnung der Proteinextrakte kann entweder mittels Kochen des
zerkleinerten Fisches mit einem Auftragepuffer erfolgen oder durch Extrahieren der
Probe mit Hilfe eines Lysepuffers. Die in dieser Arbeit verwendeten Fischproben wurden
im Dezember 2009 über eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration
aufgereinigt. Die Rohextrakte des Kabeljau, sowie vom Rotbarsch und Tilapia wurden im
Februar 2010 hergestellt. Der Rohextrakt des Thunfisches wurde aus der Reinigung von
Januar 2010 genommen. Die ausgefallenen Proteine wurden bei –20 °C eingefroren und
wurden für den Einsatz im ELISA im aufgetauten Zustand eingesetzt. Die in den
Versuchen
eingesetzten
Ausgangskonzentration
Antigenkonzentrationen
1:1000,
1:10.000
und
wurden
1:100.000
in
PBS-Puffer
verdünnt,
um
als
eine
konzentrationsabhängige Komplexreaktion zwischen den Antikörpern und den Antigen
bestimmen zu können.
2.1.5 Messgeräte
•
•
•
•
Mikrotiterplatten-Reader Modle „Sunrise“ von Tecan (Computerprogramm
„Magellan“)
UV-Vis Spektralphotometer „Specord S100“ (Carl Zeiss Technologie) von Analytik
Jena
Mikrotiterplatten-Waschautomat „SLT-lab Instrument A-5082 Astria“ Typ Columbus
Reinst-Wasser-Gerät „SGReinstwasser-System von SG Wasseraufbereitung und
Regenerierstation GmbH
2.2 Methoden
Es wurden das HRP-Labeling und der Sandwich-ELISA angewandt, welche in den
folgenden Kapiteln näher beschrieben werden.
2.2.1 HRP-Labeling
Unter Labeling versteht man das Verknüpfen eines Enzyms an Antikörper. Das
Konjugieren der Enzyme an Antikörper ist für den Einsatz von Immunosensoren mit
Antikörper-Sandwich-Komplex essentiell. Beim Labeln von Antikörpern speziell mit
Horse Radish Peroxidase (HRP) wird mit Hilfe eines Natriumperiodat (in diesem Fall
Sodium Cyanoborohydrid) der Kohlenhydratanteil des Enzyms zu Aldehydgruppen
oxidiert. Diese Aldehydgruppen verbinden sich mit den radikalen Aminogruppen des
Antikörpers unter Bildung Schiffscher Basen, was in der Abbildung 3 allgemein
chemisch dargestellt wird. Damit ist der Antikörper mit dem Enzym HRP gelabelt.
(Schleinstein, 2011); (Kemeny,1994)
15
Abb. 3: Schematische Darstellung der chemischen Kopplung von Meerrettichperoxidase
(http://www.piercenet.com/products/browse.cfn?fldiD=01030202)
Durchführung des Labeling
Vor dem HRP-Labeling wurden die Konzentrationen der einzelnen Antikörper auf 1
mg/ml mit PBS-Puffer verdünnt. Gelabelt wurde mit 1 mg EZ-link Plus Activated
Peroxidase, welches in 100 μl Reinst-Wasser aufgelöst wurde. Nach der Zugabe der
gereinigten Antikörper und 10 μl Sodium Cyanoborohydrid musste das Gemisch 1 h
unter der Abzugshaube inkubieren. Anschließend wurden 20 μl Quenching-Puffer,
bestehend aus Ethanolalamin mit pH 9, zugegeben und für weitere 15 min inkubiert. Die
Antikörper sind jetzt HRP-gelabelt. Die Dialyse zur Reinigung der HRP-gelabelten
Antikörper wurde in einer Entsalzungssäule durchgeführt. Dieser Reinigungsschritt dient
der Trennung des gebildeten Konjugat von ungebundenen Enzymen bzw. Antikörpern.
Dabei wurde eine D-SaltTM-Dextran-Entsalzungssäule von Pierce verwendet. Von der
Funktionsweise her ist diese Entsalzungssäule eine Chromatographiesäule. Das
enthaltene Gel in der Säule bildet dabei die stationäre Phase und die Konjugatlösung die
mobile Phase. Die gelabelten Antikörper besitzen eine größere Molekülgröße und werden
in der Säule stärker zurückgehalten, sodass einzelne Enzyme bzw. nicht gelabelte
Antikörper die Säule schneller verlassen. Zum Lösen der Moleküle von der Säulenmatrix
wird das Eluatmittel PBS-Puffer verwendet und die gereinigten gelabelten Antikörper in
Fraktionen aufgefangen. Zur Durchführung wurde zuerst das enthaltene Ethanol aus der
Säule mit 20 ml PBS-Puffer ausgespült und die Menge des gelabelten Antikörper auf die
Säule aufgebracht und mit 15 ml PBS-Puffer nachgespült. Danach wurden die gereinigten
Ak in einzelne Fraktionen je 1,5 ml Eppendorfgefäße aufgefangen und die Konzentration
der einzelnen Fraktionen photometrisch gemessen. Dabei wurden die Antikörper bei λ =
280 nm gegen PBS-Puffer als Nullprobe und die HRP-Konzentration bei λ = 424 nm
gemessen.
Anschließend wurde die Substratumsetzung der einzelnen Fraktionen der gelabelten Ak
mit den höchsten Extinktionswerten auf der Mikrotiterplatte gemessen, um somit
qualitativ bestimmen zu können, ob das HRP-Labeling funktioniert hat. Dazu wurden die
Ak mit Coating-Puffer (pH-Wert 9,6) 1:2000 verdünnt und davon 200 μl auf die
16
Kunststoffplatte aufgetragen. Nach der Inkubationszeit von 1 h bei 4 °C folgte ein
Waschvorgang zur Entfernung nicht gebundener Antikörper. Anschließend wurden 200 μl
der Substratlösung, zusammengesetzt aus 1%igem Wasserstoffperoxid und TMB in
Natriumacetatpuffer, aufgetragen und nach 5 min Inkubationszeit mit 50 μl Schwefelsäure gestoppt. Die Farbumsetzung wurde photometrisch mittels dem UV-Mikrotiterplatten- Reader Modle „Sunrise“ von Tecan bei λ = 450 nm kontrolliert.
2.2.2 Sandwich-ELISA
Der Sandwich-ELISA wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
•
•
•
•
•
•
Fixierung der Antikörper an Mikrotiterplatte
Blockieren
Auftragen des Antigens
zweite Antikörperfraktion
Substratzugabe
Konzentrationsbestimmung
Fixierung der Antikörper an Mikrotiterplatte
Zuerst wurden primäre Antikörper auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Zur
Immobilisierung wurden die Antikörper mit Coating-Puffer 1:1000 verdünnt und je 150
μl auf die Mikrotiterplatte pipettiert und 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Aufgrund von
elektrostatischen Anziehungskräften zwischen den Antikörpern und der Kunststoffplatte
ist das Fixieren möglich. Zur Entfernung überschüssiger Antikörper wurde ein
Waschvorgang durchgeführt.
Waschvorgang
Die Mikrotiterplatte wurde mittels eines SLT-lab Instrument A-5082 Astria Typ
Columbus Waschautomaten gespült. Dabei wurde die Platte 5-mal periodisch mit 300 μl
pro Well Waschpuffer, zusammengesetzt aus PBS-Puffer mit Tween 20, ausgewaschen.
Blockieren
Aufgrund der elektrostatischen Anziehungskräfte der Kunststoffplatten könnten freie Bindungspositionen durch Nichtantikörperbindungen eingenommen werden. Diese sorgen
für Kreuzreaktionen, welche das Ergebnis verfälschen könnten. Diese freien Bindungen
wurden mit 1%iger Milchpulver-Lösung (in PBS gelöst) blockiert und für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Überschuss des Blockmittels wieder
17
in einem erneuten Waschvorgang entfernt.
Auftragen des Antigens
Die Antigene wurden in jeweils 3 Konzentrationsstufen (in PBS-Puffer) hergestellt und
auf die mit Antikörper fixierte Mikrotiterplatte aufgetragen. In Form einer 3-fachBestimmung wurden jeweils 150 μl des Antigens pipettiert und nach einer Einwirkzeit
von 1h bei Raumtemperatur folgte erneut ein Waschvorgang.
Zweite Antikörperfraktion
Die sekundären Antikörper wurden 1:2000 in PBS-Puffer verdünnt. Anschließend wurden
150 μl dieser gelabelten Antikörper pro Well auf die Antigene gegeben und für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte erneut ein Waschschritt.
Substratzugabe
200 μl Substratlösung wurden zu dem Antigen-Antikörper-Komplex gegeben, um über
eine enzymkatalysierte Farbreaktion die Konzentration der gebundenen Antigene sichtbar
zu machen. Die Reaktionszeit wurde auf 5 min bei Raumtemperatur festgelegt. Nach der
Einwirkzeit wurde die Farbreaktion mit der Zugabe von 50 μl Schwefelsäure beendet.
Konzentrationsbestimmung
Die gelbe Farbkonzentration wurde bei 450 nm photometrisch bestimmt.
Durchführung Sandwich-ELISA
Als primärer Antikörper wurde in allen Versuchen der Ak Wi 113G9 D5 eingesetzt.
Dieser Antikörper wurde in (Blank, 2012) als optimalen primären Ak für die untersuchten
Fischarten K, H, A.S., R, Th und T ermittelt. Es wurden vier unterschiedlich sekundär
HRP-gelabelte Antikörper eingesetzt und deren Reaktionsvermögen zu einem
Referenzpaar verglichen. Die eingesetzten sekundären Antikörper sind in Tab. 2
aufgelistet. Die Durchführung der Sandwich-ELISA erfolgte jeweils nach demselben
Versuchsablauf.
18
3 Ergebnisse
Im Folgenden werden die ermittelten Ergebnisse dargestellt und erläutert.
3.1 HRP-Labeling
Nach dem Labeln der Antikörper und der anschließend durchgeführten Dialyse mit einer
Salzsäule wurden die Konzentrationen der Antikörper-Lösungen in den einzelnen
Fraktionen bestimmt. Über eine Standardreihe mit BSA-Standard-Lösung (Bolvine serum
albumin) ließ sich eine Geradengleichung ermitteln. Die Tabelle 4 zeigt die ermittelten
Extinktions-Werte der jeweiligen Konzentration der untersuchten BSA-Standard-Lösung.
Tab. 4: Konzentration BSA Standards und deren Extinktionen
BSA Standardkonzentration (mg/ml)
0,25
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Extinktion
0,155
0,397
0,827
1,173
1,492
1,788
Aus diesen Werten ergab sich eine lineare Abhängigkeit zwischen Absorption und BSAKonzentration (Abb.4), die über die Geradengleichung y = 0.721 x + 0.039 definiert
wurde.
Abb.4: Kalibriergerade BSA
19
Durch Umstellen der Geradengleichung nach x ergibt sich x =
y − 0.039
. Die ermittelten
0.721
Konzentrationen der HRP-gelabelten Antikörper sind im Anhang 1 und 2 aufgelistet.
Bei dem HRP-Labeling des G7 konnten insgesamt 17 Fraktionen mit einer mittleren
Konzentration von c = 0,09 mg/ml gewonnen werden. Um qualitativ das Markieren
bestimmen zu können, wurden Stichprobenartig die Fraktionen auf die Funktionalität der
sekundären Ak getestet. Die Extinktionswerte einer photometrischen Messung sollten
zwischen 0,3 und 2 liegen, da dort nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz ein sicherer
linearer Zusammenhang zwischen Absorption und Stoffkonzentration besteht. Sollten die
Extinktionswerte über diesem Bereich liegen, müssen die Proben verdünnt werden.
Aufgrund der hohen Konzentration der Antikörper in den Fraktionen ist eine mindestens
1:2000 Verdünnung erforderlich. Daher wurden die verwendeten Ak-Fraktionen stets
1:2000 verdünnt. Die Fraktion mit der höchsten Konzentration wurde für den
nachfolgenden Sandwich-ELISA zum Vergleich verwendet. Die Fraktion 2 hatte bei dem
Ak G7 die höchste Antikörperkonzentration und wurde in den Sandwich-ELISA
eingesetzt.
Bei dem Markieren des E9-gelabelten Ak konnten 18 Fraktionen aufgefangen werden mit
einer mittleren Konzentration von c = 0,095 mg/ml. Die Fraktion 1 erzielte die höchste
photometrisch gemessene Proteinkonzentration, aber keine Substratumsetzung. Eine
solch hohe gemessene Proteinkonzentration deutet auf das Auffangen von ungelabelten
Ak, Enzymen bzw. Verunreinigungen hin, welche für einen ELISA in dieser Form nicht
anwendbar sind. Im Vergleich dazu erwies Fraktion 3 zwar eine etwas geringere
photometrisch gemessene Extinktion, aber die höchste gemessene Substratumsetzung.
Fraktion 3 wurde dementsprechend für nachfolgende Versuche eingesetzt.
Wie auch bei Ak E9 wurde bei der Vorbehandlung des D12-gelabelten Ak ebenfalls 18
Fraktionen gewonnen. Ebenso erzielte auch hier Fraktion 3 die höchste Substratumsetzung. Dasselbe konnte bei dem C9-gelabelte Ak erzielt werden.
20
3.2 Sandwich-ELISA
Alle Ergebnisse der durchgeführten Sandwich-ELISA-Versuche sind im Anhang 3
tabellarisch aufgeführt.
3.2.1 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G11als Referenz
Durch eine Komplexbildung von Antigen und gelabelten Antikörpern kommt es zu einer
Substratumsetzung, welche photometrisch messbar ist. Die dadurch ermittelten
Extinktionswerte spiegeln die Umsetzungsrate wieder und damit die Funktionalität der
Ak-Kombinationen. Die Kombination der Antikörper D5 als primären Ak und G11 als
sekundären Ak wurde (Blank, 2012) bereits untersucht. Als Vergleichsreferenz wurden
die sechs Fischantigene mit diesem Ak-Paar getestet (Abb. 5).
Abb. 5: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G11
In Vorversuchen erwies sich diese Ak-Kombination bereits als multireaktiv für die
untersuchten Fischantigene. Selbst in niedrigen Proteinkonzentrationen konnten diese
nachgewiesen werden, sodass ein Antigenkonzentrationsbereich von 10 – 1000 ng/ml
festgelegt wurde. Bei allen durchgeführten Versuchen wurde stets PBS-Puffer als
Nullprobe eingesetzt und in den Graphiken als schwarz-gestrichelte Linie dargestellt.
Aus der Abb. 5 ist zu entnehmen, dass alle untersuchten Fischantigene, mit Ausnahme
21
von Thunfisch, mit dieser Ak-Kombination nachgewiesen wurden. Dies gilt ab einer
Konzentrationsstufe von ca. 200 ng/ml. Unterhalb dieser Proteinkonzentration ist die
Bestimmung dieser 6 Antigene nicht mehr signifikant nachgewiesen worden.
3.2.2 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G7
Untersucht wurde die Kombination des Antikörper-Paares D5 als primären Antikörper
und G7 als sekundärer Antikörper. In der Abb. 6 sind die Ergebnisse der untersuchten
Fischantigene graphisch dargestellt.
Abb. 6: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G7
Das Antigen Kabeljau erzielte im Vergleich zu den anderen Antigenen die höchste
Absorption mit dieser Antikörperkombination. Hierbei wurde eine Extinktion von E =
0,436 bei einer Antigenkonzentration von 2090 ng/ml gemessen. Es besteht eine
Abhängigkeit zwischen der Fischkonzentration und der optischen Dichte. Je stärker das
Antigen konzentriert ist, umso höher wird im Allgemeinen eine Extinktion gemessen. So
ist die Substratumsetzung bei einer Antigenkonzentration von 209 ng/ml bei E = 0,124
und bei 20,9 ng/ml liegt der Extinktionswert im sehr niedrigen Bereich bei E = 0,01.
Neben Kabeljau wurden auch die Antigene der Fischarten Hering, Alaska Seelachs,
Rotbarsch und Tilapia detektiert. Die Fischprobe Thunfisch konnte bei keiner Konzentrationsstufe nachgewiesen werden.
22
3.2.3 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak E9
Unter gleichen Bedingungen wie in dem Versuch mit dem Ak G7 wurde das
Reaktionsverhalten des sekundären HRP-gelabelten Ak E9 untersucht. Wie in Abb.7
abgebildet, konnten die Antigene Hering und Rotbarsch selektiv detektiert werden.
Abb. 7: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-E9
Diese beiden Fischantigene wurden von diesem Ak ab einer Probenkonzentration von ca.
200 ng/ml nachweislich gebunden. Der Nachweis von Heringantigen ist im höheren
Konzentrationsbereich bei diesem Ak besser als beim Rotbarschantigen. Unter 100 ng/ml
Probenkonzentration konnten die beiden Fischantigene nicht mehr nachgewiesen werden.
Alle Extinktionswerte der übrigen untersuchten Fischproben erzielten die gleichen Werte
wie die PBS-Kontrolle. Damit konnten diese Fischantigene von dieser Antikörperkombination nicht detektiert werden.
23
3.2.4 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak D12
In diesem Versuch wurde als sekundärer Ak der D12 eingesetzt. Im Unterschied zu den
ersten Versuchen erzielte die Kontroll-Probe einen geringfügig veränderten Extinktionswert, wie in Abb. 8 zu erkennen.
Abb. 8: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-D12
Die Verschiebung der Kontrolle ist auf die Herstellung einer neuen PBS-Kontrolllösung
zurück zu führen. Wie aus der Graphik hervorgeht, liegen ca. 80 % der Datenwerte
unterhalb der Kontrolllinie. Dennoch konnte diese Antikörperkombination das Antigen
Rotbarsch im Konzentrationsbereich ab 300 ng/ml detektieren. Die Antigene Tilapia und
Thunfisch liegen ab einer Proteinkonzentration von ca. 100 ng/ml im sehr niedrigen
Bereich über dem Nullwert der Kontrolle. Bei den Probenantigenen Kabeljau, Hering und
Alaska Seelachs liegen die Extinktionen aller untersuchten Konzentrationsstufen im
Bereich der Kontrolle und wurden demnach von dieser Antikörperkombination nicht
nachgewiesen.
24
3.2.5 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak C9
Die folgende Grafik (Abb. 9) zeigt die Nachweisfähigkeit des sekundären Antikörpers
C9.
Abb. 9: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-C9
Wie auch im Versuch zuvor liegen einige Messwerte unterhalb der Kontrolllinie. In den
vorherigen Versuchen wurden in der niedrigsten Proteinkonzentrationsstufe keine
auswertbaren Messwerte ermittelt. Aufgrund dessen wurde in dieser Untersuchung in
einem um eine Zehnerpotenz höheren Konzentrationsbereich gearbeitet. Es konnten vier
der sechs Fischantigene nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Ak D12 wurden
zusätzlich zu dem Antigen Rotbarsch in dieser Antikörperkombination auch Kabeljau,
Hering und Alaska Seelachs nachgewiesen. Diese Ak-Kombination weist deutlicher
Kabeljau und Hering nach als die anderen detektierten Fischantigene.
25
4 Diskussion
Als primärer Antikörper wurde der D5 verwendet. In Voruntersuchungen sowie in (Blank,
2012) erzielte dieser Antikörper bei allen hier untersuchten Fischantigenen positive
Ergebnisse im Sandwich-ELISA-Verfahren. Es ist von großer Bedeutung, dass der
primäre Antikörper in der Lage ist, alle zu testenden Fischantigene zu binden. Kann
dieser Antikörper ein Antigen nicht koppeln, wird das ungebundene Antigen im
Waschprozess entfernt. Damit kann dieses Antigen im Test nicht mehr erfasst werden.
Aus Zeit- und Kostengründen konnte dieser Antikörper nicht mehr als sekundärer
Antikörper untersucht werden.
Beim Vergleich der vier gegeneinander getesteten HRP-gelabelten sekundären Antikörper
G7, E9, D12 und C9 mit dem sekundären Ak G11 als Referenzantikörper konnte ermittelt
werden, dass drei dieser vier Antikörper multireaktiv sind. Als multireaktiv gilt ein
Antikörper, wenn dieser in der Lage ist mindestens zwei Antigene aus verschiedenen
Fischarten zuerkennen.
Wie in den Voruntersuchungen von C. Blank und in einem durchgeführten Wiederholungsversuch wurde der Referenzantikörper G11 als multireaktiv gegen die
Fischantigene K, H, A.S., R und T positiv getestet. Die Fischprobe Th konnte in den hier
untersuchten Antigenkonzentrationen in beiden Versuchen mit dem Ak G11 keine
auswertbaren Extinktionen erzielen. Thunfisch hat einen hohen Anteil an dunklem
Muskelfleisch. Dunkles Muskelfleisch besitzt im Gegensatz zum weißen Muskelfleisch
eine geringere Konzentration an Allergen auslösendem Parvalbumin. (Gajewski; Hsieh,
2009) Daher ergab der Test mit Thunfischantigen selbst bei den hier höchsten
eingesetzten Konzentrationen keine positiven Ergebnisse. Aufgrund der geringeren
Parvalbuminkonzentration in dem Muskelfleisch dieser Fischart, müssten höhere
Antigenkonzentrationen eingesetzt werden, um positive Ergebnisse zu erzielen. Neben
dem Referenzantikörper wies der untersuchte Ak G7 ebenfalls selektiv die Fischantigene
K, H, A.S., R und T nach und gehört somit zu den multireaktiven monoklonalen
Antikörpern. Auch hier wurde das Antigen Th nicht detektiert. Der Ak C9 konnte vier
von sechs Fischantigenen nachweisen und kann ebenfalls als multireaktiv betrachtet
werden. Dieser Ak detektierte K, H, A.S. und R. Der Ak E9 ist für den Nachweis der
Fischproben Rotbarsch und Hering selektiv. Dieser Ak ist als weniger multireaktiv zu
betrachten und daher für unspezifische Fischantigenuntersuchungen eher ungeeignet. Der
Ak D12 konnte selektiv den Nachweis des Antigens aus Rotbarsch deutlich erbringen.
Das Fischantigen aus Tilapia wurde über den gesamten Konzentrationsbereich in
26
geringem Maße erkannt, sodass eine Untersuchung sogar unterhalb einer Konzentration
von 10 ng/ml erfolgen könnte. Die restlichen untersuchten Fischantigene konnten bei
diesem HRP-gelabelten Ak keine messbaren Ergebnisse erzielen, sodass diese AkKombination für unspezifische Allergenuntersuchungen ebenfalls ungeeignet wäre.
Beim
Vergleich
der
fünf
untersuchten
Antikörper
ist
auffällig,
dass
der
Referenzantikörper deutlich höhere Extinktionen erzielte, als die vier getesten Ak. Der
Referenzantikörper G11 stammte aus einer Fraktion mit einer gelabelten Ak-Konzentration von ca. 0,4 mg/ml und wurde in einer 1:2000 Verdünnung in PBS-Puffer getestet.
Die untersuchten gelabelten Ak G7, E9, D12 und C9 hatten eine Ausgangskonzentration
von ca. 0,2 mg/ml in den einzelnen Fraktionen und wurden ebenfalls in einer 1:2000
Verdünnung für den Einsatz im Sandwich-ELISA eingesetzt. Die Differenz der
eingesetzten Antikörper-Konzentrationen zwischen dem G11 und den vier neu gelabelten
Antikörpern ergab vermutlich den Unterschied in der Substratumsetzung. In dieser Arbeit
ist das Ziel unspezifisch Fischantigene qualitativ nachzuweisen und nicht quantitativ.
Daher ist es unerheblich, wie hoch die eingesetzte Antikörperkonzentration der
sekundären Ak ist. Sobald ein Antikörper ein Antigen koppelt und es zur
Substratumsetzung kommt, gilt der Allergennachweis als positiv. Im direkten Vergleich
der Ergebnisse des Referenzantikörpers G11 aus der (Blank, 2012) und aus dem hier
durchgeführten
Wiederholungsversuch
ist
weiterhin
ein
Unterschied
in
den
Extinktionswerten trotz identisch eingesetzter Ak-Konzentrationen festgestellt worden.
Allgemein liegen die Messwerte von (Blank, 2012) höher als die Werte aus dem
Wiederholungsversuch. Für den Wiederholungsversuch wurden zwar die gleichen
Fischantigene verwendet, jedoch entstammen diese nicht demselben Herstellungsdatum.
Darin könnte dieser Messwertunterschied unter anderem begründet sein. Zusätzlich
könnte ein abweichend verwendetes Volumen der sekundären Ak-Lösungen die Differenz
erzeugt haben. In (Blank, 2012) wurde ein Volumen von 200 μl G11-Antikörperlösung
pro Well verwendet. Im Wiederholungsversuch hingegen wurden nach vorgeschriebenem
Versuchsplan 150 μl G11-Ak-Lösung eingesetzt. Dies könnte ebenfalls zu den
abweichenden Ergebnissen beider Arbeiten geführt haben. Durch einen zu geringeren
Einsatz an gelabelten Antikörpern könnten frei vorhandene Antigenepitope nicht im
ausreichenden Maße durch die sekundären Ak gebunden werden, sodass diese Antigene
im Test nicht nachweisbar sind. Wie bereits erwähnt spielt jedoch die Konzentration der
sekundären Ak keine wesentliche Rolle, da ausschließlich der Fund eines Antigens
ausreicht, um einen positiven Antigennachweis zu erhalten. Da ebenfalls bei allen vier
27
untersuchten Antikörpern die gleiche Menge an Antikörperlösungen eingesetzt wurde,
sind die Ergebnisse im Vergleich untereinander durchaus repräsentativ. In der
Studienarbeit von C. Blank sind im Antigenkonzentrationsbereich von ca. 1 ng/ml
auswertbare Extinktionswerte erreicht worden. Blank schrieb: „In dieser Arbeit konnten
mit dem Antikörperpaar 3G9 und 1G3 bei S, R und H Proteinkonzentrationen im
einstelligen ng/ml-Bereich erkannt werden. Das sind zum Beispiel für A. Seelachs 1,28
ng Parvalbumin pro ml Lösung“. In den Untersuchungen dieser Arbeit konnte ein
Antigennachweis bis zu einem Konzentrationsbereich von ca. 100 ng/ml sicher
nachgewiesen werden. Das sekundäre Ak D12 konnte das Fischantigen aus Tilapia sogar
bis 10 ng/ml detektieren. Es lässt sich vermuten, dass auch in geringeren Konzentrationen
dieses Antigen in der Ak-Kombination mit D12 nachweisbar wäre.
Die Nachweismethode Sandwich-ELISA dient dem qualitativen und quantitativen
Nachweis von Antigenen im Spurenbereich (ppm-Bereich). Die Untersuchungen wurden
dementsprechend in hohen Verdünnungsstufen durchgeführt, die bei solch kostbaren und
geringen Probemengen eine hohe Fehlerquote verursachen. Genaues Pipettieren und
intensives Homogenisieren von solch geringen Mengen sind daher von großer
Bedeutung. Ein sicheres und genaues Arbeiten kann durch eine Standardabweichung
überprüft werden. Die Standardabweichungen der Mehrfachuntersuchungen lagen stets
unterhalb von 5% und bestätigen damit ein sauberes Arbeiten und eine sichere
Untersuchungsmethode (Anhang 3).
In (Gajewski; Hsieh, 2009) wurden zwei Antikörper gegen Parvalbumin in einem
indirekten ELISA gegeneinander getestet. Dabei wurden neben 26 Fischarten, inklusive
der in dieser Bachelorarbeit getesteten Fischantigene K, A.S., R, Th und T, auch weitere
Tierarten untersucht. Der Antikörper Mab PARV-19, gegen Parvalbumin eines Frosches,
erkennt dabei unabhängig der Tierarten Parvalbumin. Der Antikörper Mab 3E1 gegen das
Katzenhai-Parvalbumin hingegen, ist in den Untersuchungen als rein Fischspezifischer
Parvalbumin-Antikörper ermittelt worden (Gajewski; Hsieh, 2009). Wie auch in dieser
Bachelorarbeit sind solche Antikörper bedeutsam für den Nachweis von Fischallergenen
in komplexen Lebensmitteln. Schnelltests für Fischallergiker sollten ausschließlich
positiv auf Fisch-Parvalbumin reagieren und damit dem Verbraucher Schutz vor
versteckten Fisch-Allergenen im Lebensmittel bieten. Wie in der Publikation sind auch
die in dieser Arbeit untersuchten Antikörper rein Fischspezifisch. Ziel war es, eine
Antikörperkombination zu finden, die zwar allgemein Fischallergene erkennt, aber
unspezifisch in der Fischart positive Ergebnisse erzielt. Im Vergleich zu dem
28
Referenzantikörperpaar D5-G11 erwies sich die Kombination D5-G7 ebenfalls als
tauglich im Nachweis von Fischartunabhängigem Parvalbumin. Der hier aus Zeitgründen
nicht getestete sekundäre Ak D5, der immer als primärer Ak aufgrund seiner Fischartübergreifenden Erkennung verwendet wurde, sollte in weiteren Tests untersucht werden.
Vermutlich erzielt diese Kombination der gleichen Ak-Gruppe bessere Ergebnisse.
5 Ausblick
Der Konzentrationsbereich der verwendeten Antigene sollte für die hier untersuchten AkKombinationen weiter ausgeweitet werden. Einerseits könnten einige Ak-Kombinationen
erst in größeren Antigenkonzentrationen wirksam sein. Andererseits kann der hier
festgestellte Negativ-Nachweis bestimmter Fischartparvalbumine auch in höheren
Konzentrationen bestätigt werden. Ebenso gilt es zu überprüfen, ob die Kombination von
D5-D12 die Fischart Tilapia im Spurenbereich unter 10 ng/ml noch positiv nachweisen
kann. Allgemein sollten weitere Kombinationsmöglichkeiten der Ak getestet werden. Das
aus Zeit- und Kostengründen hier nicht als sekundärer Antkörper getestete Antikörper D5
sollte in Untersuchungen als Kombination D5-D5 erprobt werden, weil dieses Antikörper
alle sechs Fischarten-Antigene erkennen kann. Das funktionale Ak-Paar D5-G7 und das
Referenz-Ak-Paar D5-G11 sollten über weitere Fischarten wie in der Publikation bereits
beschrieben, getestet und in komplexen Lebensmitteln wie z. B. Suppen erprobt werden.
Die Funktionalität des Sandwich-ELISA-Verfahrens wird unterschiedlich zwischen
reinen Fischextrakten und realen Lebensmitteln ausfallen. Dennoch ist die Wirksamkeit
des Verfahrens in realen Lebensmitteln entscheidend und sollte abschließend auch dort im
großen Umfang untersucht werden.
29
6 Zusammenfassung
Zu Beginn der Versuchsreihe wurde eine schon zuvor untersuchte Antikörperkombination
von
monoklonalen
Antikörpern
auf
dessen
Funktionalität
in
einem
Antigenkonzentrationsbereich von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml untersucht. Dieses
Antikörperpaar Wi 11 3G9 D5 als primären Antikörper und Wi 111G3 G11 als
sekundären Antikörper galt in dieser Arbeit als Referenz-Antikörperpaar. Im Vergleich
zur Referenz-Kombination wurden vier weitere sekundäre Antikörper mit jeweils
demselben primären Antikörper auf ihre Funktionalität untersucht. Die Funktionalität der
Antikörperkombinationen wurden mit den Antigenen aus Kabeljau, Hering, Alaska
Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und Tilapia getestet. Die Kombination 11 3G9 D5 als
Fängerantikörper und Wi 113D12 G7 als sekundärer gelabelter Antikörper konnte fünf
der sechs untersuchten Fischantigene nachweisen und ist damit ebenso multireaktiv wie
die Referenz-Kombination D5-G11. Mit der Kombination Wi 113G9 D5 und Wi 114B10
C9 als sekundärer gelabelter Antikörper wurden vier Antigene nachgewiesen. Mit dem
sekundären Antikörper Wi 113G4 E9 bei gleichen primären Antikörper wurden zwei
Antigene nachgewiesen (Hering und Rotbarsch) und der Antikörper Wi 115H1 D12
konnte nur das Antigen aus Rotbarsch deutlich nachweisen. Anhand der ermittelten
Ergebnisse gelten die Antikörperkombinationen D5-G7 und D5-G11 als ausreichend
multireaktiv für den qualitativen Nachweis des Fischallergens Parvalbumin und sollten
daher in weiteren Untersuchungen intensiver verfolgt werden.
30
7 Verzeichnisse
7.1 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: EF-Hand-Motiv eines Parvalbumins ...................................................................... 6
Abb. 2: Prinzip eines Sandwich-ELISA .............................................................................. 9
Abb. 3: Schematische Darstellung der chem. Kopplung von Meerrettichperoxidase ....... 15
Abb.4: Kalibriergerade BSA ............................................................................................. 18
Abb. 5: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G11 ...... 20
Abb. 6: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G7 ........ 21
Abb. 7: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-E9 ........ 22
Abb. 8: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-D12 ...... 23
Abb. 9: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-C9 ........ 24
7.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Bisher identifizierte Parvalbumine verschiedener Fischarten ................................. 7
Tab. 2: Liste über verwendete Antikörper ......................................................................... 13
Tab. 3: Liste über verwendete Fischextrakte als Antigene ................................................ 13
Tab. 4: Konzentration BSA Standards und deren Extinktionen ........................................ 18
Tab. 5: Ext.- und Konzentrationswerte Ak G7 und Ak E9 nach dem HRP-Labeling ...... 32
Tab. 6: Ext.- und Konzentrationswerte Ak D12 und Ak C9 nach dem HRP-Labeling .... 33
Tab. 7: Extinktionswerte, MW und Standardabweichung der untersuchten sek. Ak ........ 34
7.3 Literaturverzeichnis
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Auflage. Hamburg: Behr‘s Verlag, 1995
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Rabner Institut.2011
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http://www.bmelv.de/SharedDocs/Standardartikel/Ernaehrung/SichereLebensmittel/Kenn
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http://www.wiberg.eu/gastronomie/service/lebensmittelrecht/allergenkennzeichnung.htm.
2007; 05.01.2012
32
8 Anhang
Anhang 1
Tab. 5: Extinktions- und Konzentrationswerte des Ak G7 und Ak E9 nach dem HRPLabeling
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Die Fraktion ohne Substratumsetzung im qualitativen Nachweis der Funktionalität der
HRP-gelabelten Ak wurde rot markiert.
Formel für die Mittelwertbestimmung:
Arithmetische Mittel: x = ¦ x / n
x = Summe aller Messwert
n
= Anzahl der Messwerte
33
Anhang 2
Tab. 6 : Extinktions- und Konzentrationswerte des Ak D12 und Ak C9 nach dem HRPLabeling
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Formel für die Standardabweichung:
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Xi = Messwert
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34
Anhang 3
Tab. 7: Extinktionswerte, MW und Standardabweichung der untersuchten sekundären Ak
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36
Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit
Hiermit versichere ich, Juliane Schleinstein, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig
angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt
habe.
Ort, Datum
Unterschrift

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