Die Entfernung von Endotoxinen, RNase, DNase und

Technologie-Nachricht 30
Die Entfernung von Endotoxinen, RNase, DNase und
Bakterien durch PURELAB® Chorus 1 mit Biofilter
Leistungsmerkmale des ELGA Biofilters in einer PURELAB Chorus 1
Spezifikationen
•Endotoxine
• RNase
• DNase
• Bacterien
<0,001 EU/ml
<0,002 ng/ml
<20 pg/ml (<0,02 pg/µl)
<10 KBE/100ml (<0,1 KBE/ml)
Das PURELAB Chorus 1-System produziert Reinstwasser direkt aus
vorbehandeltem Wasser. Wird das System darüber hinaus mit einem
speziellen Biofilter von ELGA LabWater ausgestattet, erzeugt es eine
Wasserqualität, die frei von biologisch aktiven Verunreinigungen ist.
Das aufbereitete Wasser ist dadurch für biochemische Anwendungen
wie beispielsweise Zellkulturen geeignet.
Endotoxine
Endotoxine sind Lipopolysaccharide (LPS), die aus der äußeren Zellmembran
lebensfähiger gramnegativer Bakterien abgegeben werden. Sie werden
freigesetzt, wenn die Bakterienzelle abstirbt.
Endotoxine interagieren mit Zellen und verursachen
zahlreiche schädliche Einflüsse (Lit. 1. Dawson und Lit. 2.
Nagano). Anwendungen wie In-vitro-Fertilisation (Lit. 3.
Dumoulin) und Zellkulturen (Lit. 4. Stacey) sind besonders
gefährdet.
Durch die Beseitigung von Endotoxinen werden Experimente,
die Zellteilung, Elektrophorese und weitere biochemische
Verfahren involvieren, zuverlässiger.
Endotoxine sind negativ geladen bei einem pH-Wert >2 und können durch positiv geladene Filter wie den ELGA Biofilter
wirksam entfernt werden. Geladene Filter behindern den Wasserfluss nur minimal und sind die bevorzugte Option für
den Einsatz direkt an der Entnahmestelle, wenn sie als letzte Stufe in einer Reihe von Reinigungsverfahren angewendet
werden.
Technologie-Nachricht 30
Herausforderung Endotoxine
Ein Biofilter wurde durch ständiges Zuführen hoher
Konzentrationen an Endotoxinen in das Zulaufwasser des
positiv geladenen Filters belastet. Die Konzentration der
Endotoxine im Produktwasser wurde anschließend mittels
eines Limulus-Amoebozyten-Lysat-Tests (Typ kinetischer
turbidimetrischer Assay) gemessen.
Zunächst wurden die Bakterien aus dem aufbereiteten
Wasser isoliert. Die Mikroorganismen wurden in
Peptonwasser inokuliert und anschließend bei 27 °C
inkubiert. Das Produkt wurde wiederholt autoklaviert und
mittels einer 0,45 μm Filtermembran gefiltert. So wurden
konzentrierte Endotoxine erzeugt.
Die meisten Endotoxintests sind auf gereinigte
Lipopolysaccharide (LPS) angewiesen. Das Forschungsteam
bei ELGA LabWater stellte seine eigenen LPS mit bereits
vorhandenen Bakterien aus dem aufbereiteten Wasser her.
Diese Vorgehensweise bot eine realistische Umgebung für
den Endotoxintest.
Jeder Endotoxintest dauerte 5 Minuten und hatte die unten
aufgeführten Gesamttestwerte zum Ergebnis. Selbst bei
mehr als 90 EU/ml und einer Gesamtbeladung von beinahe
800.000 EU konnten keine Endotoxine (<0,001 EU/ml) im
Produktwasser nachgewiesen werden.
Endotoxintest (EU/ml)
0,022,8314,00
48,4090,70
Gesamt-Endotoxintest (EU)
100
1425084250326250779750
Nach Biofilter (EU/ml) <0,001<0,001<0,001 <0,001
<0,001
Keimreduktionsfaktor>1,3>3,5>4,1>4,7 >5,0
Tabelle 1
In der Praxis wird die Konzentration von Endotoxinen im Zulaufwasser des Filters sehr niedrig sein (<0,1 EU/ml). Um
diese Bedingungen zu imitieren, wurde der Filter dann über einen längeren Zeitraum mit einer nominellen Einspeisung
von 1 EU/ml getestet. Nach dem Durchlauf von 800 Litern Wasser mit 1 EU/ml lag der Wert für Endotoxine unter der
Nachweisgrenze (<0,001 EU/ml).
DNase and RNase
Bedenken gab es in Bezug auf das mögliche Vorliegen
anderer biologisch aktiver Spezies wie RNase und DNase
im aufbereiteten Wasser.
Das Vorkommen dieser Spezies im Wasser kann zu
schweren Beeinträchtigungen führen. Sie werden
jedoch durch Ionenaustauschmedien und oxidierende
UV-Bestrahlung entfernt. Bei richtig konzipierten,
ordnungsgemäß desinfizierten und gewarteten
Wasseraufbereitungssystemen sind diese Moleküle nicht
nachweisbar.
Intern optimierte Versionen der Ambion® AlertTestverfahren, basierend auf spaltfähigen,
fluoreszenzmarkierten RNase- bzw. DNase-Substraten,
wurden zum Nachweis verwendet. Die Testergebnisse
zeigen Nachweisgrenzen für RNase von nicht mehr als
<0,002 ng/ml und für DNase von <20 pg/ml. Selbst bei dieser
hohen Empfindlichkeit war das von der PURELAB Chorus 1
mit Biofilter produzierte Reinstwasser effektiv RNase- und
DNase-frei (RNase <0,002 ng/ml, DNase <0,02 ng/ ml). Auf
diesem Niveau kann aufbereitetes Wasser aus einer mit
Biofilter ausgestatteten PURELAB Chorus 1 anstelle von
Wasser verwendet werden, das mit Diethylpyrocarbonat
(DEPC) behandelt wurde (die Anlage muss gemäß den
Empfehlungen von ELGA LabWater regelmäßig desinfiziert
und gewartet werden).
Für weitere Testzwecke wurde der Vorratsbehälter der
PURELAB Chorus 1 mit 1 mg/l RNase A und DNase befüllt,
um einen Faktor von > 500.000 oberhalb der Nachweisgrenze
zu erreichen. Das Produktwasser war effektiv RNase- und
DNase-frei (RNase <0,002 ng/ml, DNase <0,02 ng/ml).
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Endotoxin Level Post Biofilter
0.001
Endotoxin Level Post Biofilter
0.001
Endotoxin level below detection
point (<0.001 EU/ml)
Endotoxin level below detection
point (<0.001 EU/ml)
Herausspülen von anorganischen Stoffen und TOC
hinaus ein guter Indikator für einen sehr geringen
Am Entnahmepunkt eingesetzte Filtermodule entfernen
Kontaminationseintrag in das Produktwasser. Dies ist von
Endotoxine aus dem Produktwasser der Anlage und
entscheidender Bedeutung, da die Wasserreinheit nach
dürfen das Wasser nicht0 kontaminieren. Das schnelle
100
14250
326250
779750
kontrolliert werden
kann. Das schnelle
Herausspülen von anorganischen
(Elektrischer
Widerstand) 84250 dem Filter nicht
Challenge Total (EU)
Herausspülen anorganischer und organischer Stoffe durch
und organischen Stoffen (TOC) bei Filtern, die das erste
den ELGA Biofilter ist nachstehend dargestellt.
Mal verwendet werden, ist sehr vorteilhaft und darüber
0
20
Challenge Total (EU)
20
18
18
16
16
14
14
20
16
14
20
TOC (ppb C)
18
Elektrischer Widerstand (MΩ-cm)
14250
84250
326250
Biofilter zum
Herausspülen von
anorganischen
Stoffen und TOC779750
100
12
12
Produktwasser TOC (ppb C)
10
Produktwasser Elektrischer Widerstand (MΩ-cm)
12
18
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
16
14
12
10
10
8
0
50
100
150
Abbildung 1
6
200
250
300
350
Spülwasser (Liter)
8
6
Bakterientest
4
4
Innerhalb
des PURELAB Chorus 1-Systems wird die Bakterienkonzentration durch Umkehrosmose, anschließende
2
0.12
Rezirkulation und UV-Bestrahlung
bei 254 und 185 nm äußerst niedrig gehalten. Die Bildung eines Biofilms wird durch eine
regelmäßige
Desinfektion eingeschränkt. Letzte Spuren von Bakterien werden durch den Biofilter mit einer Porengröße von
0
0.1 einem Zulaufwasser mit 107 KBE/ml entfernt der Biofilter vollständig alle Bakterien mit einem
0,2 μm
0 entfernt. Selbst
50 bei
100
150
200
250
300
350
Keimreduktionsfaktor von 108.
2
0
Die typischen Werte (Gesamtkeimzahl - GKZ) eines PURELAB Chorus 1-Systems mit Biofilter über einen Zeitraum von 6
Monaten sind in nachstehender Abbildung 2 aufgeführt.
0.08
0.06
GKZ einer PURELAB Chorus 1 mit Biofilter
0.04
0.12
0.02
0.1
0
1
7
15
22
42
49
56
84
100
114
121
128
156
163
170
177
197
GKZ (KBE/ml)
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1
7
15
Abbildung 2
22
42
49
56
84
100
114
Zeit (Tage)
121
128
156
163
170
177
197
Technologie-Nachricht 30
Zusammenfassung
Ein PURELAB Chorus 1-System mit einem ELGA-Biofilter produziert auf sehr effektive Weise Reinstwasser, welches frei
von biologisch aktiven Verunreinigungen ist. Das System ist für Anwendungen geeignet, bei denen Endotoxinfreies
Reinstwasser, Bakterienfreies Wasser und Nukleasefreies Reinstwasser erforderlich ist.
References
Ref 1: Dawson ME (1998) LAL update. Associates of Cape Cod; Vol. 16: 1-4
Ref 2: Nagano M, Takahashi Y, Katagiri S (1999) J. Reprod. Dev.; 45: 239-242
Ref 3: Dumoulin JC, Menheere PP, Evers JL (1991) Human Reproduction; 6: 730-734
Ref 4: Stacey G (2007) in Medicines from Animal Cell Culture. Stacey G, Davis J. John Whiley & Sons, Chichester, Chapter 31
ELGA LabWater – VWS Deutschland GmbH • Tel.: +49 (0) 5141 803-0 • E-Mail: [email protected] • Website: www.elgalabwater.de
ELGA® ist die globale Laborwasser-Marke von Veolia Water Solutions & Technologies. VWS (UK) Ltd. Eingetragen in England & Wales Nr. 327847 ©Copyright 2013 ELGA LabWater/VWS (UK) Ltd. Alle Rechte
vorbehalten. Wir behalten uns als Teil unserer Philosophie der fortlaufenden Produktverbesserung das Recht zur Änderung der in dieser Technologienachricht enthaltenen Spezifikationen vor. TechnologieNachricht TN 30

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