Sören Strohmenger

Sören Sibo Strohmenger
(Compton 2015)
RISE weltweit 2015
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Sören Sibo Strohmenger
RISE weltweit 2015
Allgemeiner Teil
Mein Praktikum habe ich im Labor von Professor Pamme am Fachbereich Chemie der
University of Hull in England absolviert. Da Großbritannien EU-Mitglied ist, musste ich kein
Visum beantragen. Mit dem Flugzeug ging es von Frankfurt nach Manchester, dem größten
Flughafen in Nordengland, zu dem auch Direktflüge aus Deutschland angeboten werden. Von
dort aus war es noch eine zweistündige Zugfahrt durch die Landschaft des Pennines-Gebirges
bis nach Hull.
Hull (eigentlich Kingston-upon-Hull) liegt an der sehr breiten Flussmündung des Humbers in
die Nordsee im Nordosten Englands. Die Stadt mit rund 250.000 Einwohnern hatte früher einen
großen Fischereihafen, der mittlerweile an Bedeutung verloren hat. Dennoch gibt es noch einen
sehr schönen Yachthafen sowie Fährverbindungen nach Rotterdam und Seebrügge.
Auch sonst hat Hull einiges zu bieten und ist alles andere als „dull“, wie manchmal behauptet
wird: Hull ist Kulturhauptstadt des Vereinigten Königreichs 2017 und das merkt man auch. Als
ich dort war, gab es alle zwei Wochen ein großes Fest in der Innenstadt mit Livemusik,
kostenlosen Tanz- und Theateraufführungen und dergleichen. Ansonsten gibt es neben der
Altstadt am Hafen das große Aquarium „the Deep“, das auch architektonisch eindrucksvoll ist.
Gerade das Viertel in der Nähe der Uni, das sogenannte Newland, bietet durch zahlreiche Pubs,
Bars und Restaurants mit studentischen Preisen gute Möglichkeiten zum Weggehen.
Gewohnt habe ich zunächst in einem von der Universität verwalteten WG-Haus, an das ich
durch Nachfrage beim dortigen Studentenwerk gekommen bin. Das Verfahren war sehr
unkompliziert, allerdings musste ich bis drei Wochen vor Praktikumsbeginn auf eine endgültige
Zusage warten. Das typisch englische, viktorianische Reihenhaus direkt neben der Uni habe ich
mir mit fünf Leuten geteilt, meine Mitbewohner waren zum größten Teil Studenten mit
Ferienjobs, es gab aber auch andere ausländische Praktikanten.
In dem Haus konnte ich leider nur für die Hälfte meines Praktikums bleiben, da die Uni die
Zimmer bei Semesterbeginn ab Anfang September für die neuen Studenten benötigt. Schon vor
meiner Ankunft habe ich deshalb private Vermieter angeschrieben und Besichtigungstermine
für meine erste Woche in Hull vereinbart. Es war nicht leicht, etwas für den kurzen
Praktikumszeitraum zu finden, da die Mindestmietdauer in England normalerweise bei sechs
Monaten liegt.
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Mit etwas Glück habe ich aber ein Zimmer in einer WG gefunden, die leider etwas weiter von
der Arbeit entfernt war. Das war aber kein Problem, da ich mir an der Uni kostenlos ein Fahrrad
leihen konnte und von da an jeden Tag 20 Minuten zur Arbeit geradelt bin, lediglich an den
Linksverkehr musste ich mich erstmal gewöhnen.
Während des Praktikums hat mich meine Freundin aus Deutschland für eine Woche besucht,
zusammen sind wir dann für ein Wochenende mit dem Zug nach Edinburgh während des
Edinburgh International Festivals gefahren, was sehr zu empfehlen ist. Benutzt haben wir dafür
ein in Deutschland gekauftes Interrailticket für Großbritannien, mit dem man sehr flexibel ist
und weite Strecken wie nach Edinburgh auch günstiger sind. Zu beachten ist aber, dass jeder,
der in England sein Zugticket online kauft, kostenlos eine Reservierung dazubekommt.
Dadurch kann es schon mal vorkommen, dass wirklich jeder Platz in einem Zug reserviert ist
und man darauf hoffen muss, dass Leute ihre Reservierung nicht wahrnehmen.
Für kurze Strecken wie für Wochenendausflüge nach York, Bridlington (an der Nordsee) und
die Nationalparks in North Yorkshire, oder aber wenn man lange im Voraus bucht auch für
weite Strecken (London, Liverpool), bietet die „Advance Ticket“ Option der National Rail eine
günstige Alternative.
Sehr hilfreich dafür, wie auch bei anderen Gelegenheiten, ist eine Kreditkarte. Für Bargeld kann
man seine deutsche EC-Karte an so gut wie jedem Geldautomaten verwenden. Meine Bank
verlangt allerdings pro Vorgang 5€, so dass sich nur gelohnt hat, große Mengen auf einmal
abzuheben, das kann sich aber von Bank zu Bank unterscheiden.
Zum Telefonieren und für mobiles Internet kann man sich vor Ort Prepaid-Simkarten kaufen,
ich habe mich für den Billiganbieter Lebara entschieden, der jedoch nur begrenzt zu empfehlen
ist: der Tarif ist zwar sehr günstig, das mobile Internet musste jedoch sehr umständlich manuell
installiert werden und hatte dann teilweise nervige Aussetzer.
Ansonsten findet sich in England alles was man benötigt, durch die Verbreitung von Aldi und
Lidl auch einiges an heimischem Essen, lediglich richtiges Brot gibt es so gut wie gar nicht. In
einem polnischen Supermarkt, von denen es in Hull sehr viele gibt, bin ich dann aber doch
fündig geworden.
Insgesamt war das Praktikum eine sehr gute Erfahrung, sowohl was die Arbeit im Labor angeht
als auch die neuen kulturellen Eindrücke und die vielen interessanten Leute, die ich dort
kennengelernt habe. Danke dafür an den DAAD und die Betreuer an der University of Hull.
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Fachlicher Teil
Tissue-on-a-chip Plattform für die personalisierte Tumortherapie
Einführung
Personalisierte Medizin in der Krebstherapie wird heutzutage hauptsächlich durch
immunhistochemische und genomische Untersuchungen von Tumorbiopsien durchgeführt. So
können die dem Tumorwachstum zugrundeliegenden Mutationen ausfindig gemacht und
entsprechende Medikamente zur Therapie ausgewählt werden (Compton 2015).
Die Verwendung einer tissue-on-a-chip Plattform („Chip“) bietet hierzu eine Alternative, bei
der die direkte Wirkung der Chemotherapeutika auf Tumorgewebe beobachtet werden kann.
Hierfür werden Gewebsschnitte (precision cut tissue slices, PCTS) aus Tumorbiopsien auf einer
mikrofluidischen Plattform kultiviert, verschiedenen Medikamenten ausgesetzt und
anschließend untersucht.
Die tissue-on-a-chip Plattform erlaubt es zudem, Leberschnitte (precision cut liver slices,
PCLS) dem Tumorgewebe vorzuschalten und so den individuellen Metabolismus der
Therapeutika zu berücksichtigen (LeCluyse et al. 2012).
Bevor die Plattform für die Untersuchung von menschlichem Tumorgewebe verwendet werden
kann, müssen zunächst die längerfristige Kultivierung von Gewebe sichergestellt und
Untersuchungsmethoden auf dem Chip etabliert werden. Dies geschah unter Verwendung von
Leber- und Tumorschnitten aus Mäusen.
Tissue-on-a-chip Plattform
Die Grundstruktur der tissue-on-a-chip Plattform besteht aus zwei Glasplatten. In die obere
Platte wurde mithilfe einer CNC-Maschine automatisiert nach einer Vorlage ein Kanalsystem
mit Zugangsstellen gefräst. Die Glasplatten wurden unter Druck und Hitze fest miteinander
verbunden. Verbindungsstellen für Schläuche und die Zugangsstelle für Gewebsschnitte
wurden auf die Glasplattform geklebt.
Zum Untersuchen des Flüssigkeitsstroms und zum Prüfen auf mögliche Leckstellen wurden
zwei Spritzen mit Farbstoffen an die zwei Einlassstellen des Chips angeschlossen. Über eine
Spritzenpumpe wurde die Durchflussrate gezielt eingestellt, bei niedrigen Raten von
10-100 µl/min zeigte sich eine laminare Strömung: die zwei Farbstoffe fließen nebeneinander
her und es findet nur eine leichte Durchmischung durch Diffusion an der Grenzfläche statt. Erst
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nach dem Passieren der Gewebekammer waren die beiden Farbstoffe vollständig durchmischt
(Abbildung 1).
a
b
c
Abbildung 1: Tissue-on-a-chip Plattform
a Schemazeichnung
b zusammengebauter Chip mit Zugangsstellen
c Test auf laminare Strömung im Bereich des Einlasses mit zwei Farbstoffen (gelb/blau) (Lichtmikroskop)
Herstellen der Gewebeschnitte
Für die Gewebsschnitte wurden frisch entnommene Leber- bzw. Tumorproben mit dem
Vibratom bei einer Schnittdicke von 150 µm geschnitten. Für die Verwendung im Chip konnten
aus den größeren Schnitten mithilfe einer Biopsiestanze gleich große, kreisförmige Stücke
ausgeschnitten werden. Diese konnten dann über die Zugangsstelle in die tissue-on-a-chip
Plattform eingesetzt werden und mit Williams Medium E, einem Zellkulturmedium, umspült
werden (de Graaf et al. 2010).
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Bestimmung der Schnittdicke
Um zu überprüfen ob die Gewebsschnitte die im Vibratom eingestellte Schnittdicke von
150 µm aufweisen, wurden Gewebsschnitte eines kolorektalen Tumors in Paraffin eingebettet
und senkrecht zur vorherigen Schnittrichtung mit dem Mikrotom geschnitten. Die Proben
wurden anschließend einer Hämatoxylin-Eosin Färbung unterzogen und unter dem
Lichtmikroskop
untersucht.
Ergebnisse
von
drei
Gewebsschnitten
ergaben
eine
durchschnittliche Dicke von 146 ± 8 µm.
Konfokalmikroskopie
Innerhalb eines 150 µm dicken Gewebeschnitts zeigen sich Unterschiede in Bezug auf die
Lebensfähigkeit der Zellen und die Antwort auf Medikamente zwischen den inneren, von
Gewebe umgebenen Schichten und den äußeren Schichten, die direkt in Kontakt zum Medium
stehen (van Midwoud et al. 2011).
Die Konfokalmikroskopie erlaubt es, in die inneren Schichten der Gewebsschnitte zu schauen.
Verwendet wurde dafür ein live/dead staining kit, bei dem lebende Zellen mit Calcein-AM grün
und tote Zellen mit Ethidium Homodimer-1 rot fluoreszenzmarkiert werden.
Untersuchungen mit frischen Tumor- und Leberschnitten ergaben, dass bis zu einer Tiefe von
70 µm im Gewebe der Nachweis von toten und lebenden Zellen möglich ist (Abbildung 2).
Abbildung 2: Konfokalmikroskopische Aufnahme eines kolorektalen
Tumorgewebsschnittes
grün: lebende Zellen (Calcein)
rot: tote Zellen (Ethidium Homodimer-1)
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Untersuchungen des 7-Ethoxycoumarin Metabolismus mittels HPLC
Der Metabolismus von 7-Ethoxycoumarin kann als Modell für den Stoffwechsel von
Medikamenten in der Leber betrachtet werden. 7-Ethoxycoumarin wird zunächst vom
Cytochrom P450 System des Phase I Metabolismus zu 7-Hydroxycoumarin deethyliert.
Anschließend wird es von Enzymen des Phase II Metabolismus zu 7-Hydroxycoumaringlucuronid und 7-Hydroxycoumarinsulfat umgewandelt (Abbildung 3).
Abbildung 3: Stoffwechselweg von 7-Ethoxycoumarin (van Midwoud et al. 2010)
Diese Metabolite sollten mithilfe von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
nachgewiesen und quantifiziert werden, wofür zunächst eine Methode zur Auftrennung der zu
untersuchenden Stoffe und Mediumkomponenten entwickelt werden musste (van Midwoud et
al. 2011).
Dazu wurde eine Lösung der vier 7-Ethoxycoumarin Metabolite (je 15 µM) in Williams
Medium E auf eine C18-Säule aufgetragen. Als mobile Phase wurde dafür eine Mischung aus
65 % Lösung A (3 % Acetonitril, 1 % Eisessig und 5 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat
in Wasser) und 35 % Lösung B (50 % Acetonitril, 1 % Eisessig und 5 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat in Wasser) verwendet. Zur Gradientenelution wurde der Anteil von
Lösung B über 1 min auf 70 % erhöht. In einem zweiten Gradienten wurde anschließend über
5 min ein Anteil von 100 % Lösung B erreicht. Vor der Injektion einer weiteren Probe wurde
die Säule für 5 min in 65 % Lösung A und 35 % Lösung B equilibriert. Durch Untersuchung
mit einem Diodenarraydetektor bei 320 nm konnte so eine erfolgreiche Trennung der
untersuchten Komponenten innerhalb von 10 min erzielt werden (Abbildung 4).
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Abbildung 4: Chromatogramm der HPLC-Untersuchung von 7-Ethoxycoumarin Metaboliten.
1: 7-Hydroxycoumaringlucuronid
2: 7-Hydroxycoumarin
3: Mediumkomponente 1 (Penicillin)
4: Mediumkomponente 2 (Phenolrot)
5: 7-Hydroxycoumarinsulfat
6: 7-Ethoxycoumarin
Elektrochemische Bestimmung der Sauerstoffkonzentration
Der Sauerstoffverbrauch von Gewebsschnitten in der tissue-on-a-chip Plattform erlaubt
Rückschlüsse auf den Zustand des Gewebes und mögliche Reaktionen auf Medikamente.
Messbar ist dieser durch die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration im Medium nach dem
Passieren des Gewebes. Zu diesem Zweck wurde ein spezieller Deckel für die Gewebekammer
gebaut, in den drei Elektroden eingefügt sind: zwei Platinelektroden und eine Silberelektrode,
an deren Oberfläche sich im Chlorid-haltigen Medium Silberchlorid bildet.
Mithilfe von Chronoamperometrie (Winlove et al. 1984) konnte so unter Verwendung einer
Eichkurve bekannter Konzentrationen der Sauerstoffgehalt im Medium bestimmt werden.
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Literaturverzeichnis
Compton, C. (2015). "Getting to personalized cancer medicine." Cancer 110(8): 1641-1643.
de Graaf, I. A. M., P. Olinga, M. H. de Jager, M. T. Merema, R. de Kanter, E. G. van de Kerkhof and G.
M. M. Groothuis (2010). "Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for
application in drug metabolism and toxicity studies." Nature Protocols 5: 1540-1551.
LeCluyse, E. L., R. P. Witek, M. E. Andersen and M. J. Powers (2012). "Organotypic liver culture models:
meeting current challenges in toxicity testing." Crit Rev Toxicol 42(6): 501-548.
van Midwoud, P. M., G. M. Groothuis, M.T. Merema and E. Verpoorte (2010). "Microfluidic biochip for
the perifusion of precision-cut rat liver slices for metabolism and toxicology studies." Biotechnol
Bioeng 105(1): 184-194.
van Midwoud, P. M., J. Janssen, M. T. Merema, I. A. de Graaf, G. M. Groothuis and E. Verpoorte (2011).
"On-line HPLC analysis system for metabolism and inhibition studies in precision-cut liver slices." Anal
Chem 83(1): 84-91.
van Midwoud, P. M., M. T. Merema, N. Verweij, G. M. Groothuis and E. Verpoorte (2011). "Hydrogel
embedding of precision-cut liver slices in a microfluidic device improves drug metabolic activity."
Biotechnol Bioeng 108(6): 1404-1412.
Winlove, C. P., K. H. Parker and R. K. C. Oxenham (1984). "The measurement of oxygen diffusivity and
concentration by chronoamperometry using microelectrodes." Journal of Electroanalytical Chemistry
and Interfacial Electrochemistry 170(Issues 1–2): 293–304.
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