Real-Time-PCR • Durch die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten Sonde wird die Vervielfältigung der DNA direkt und kontinuierlich per Computer aufgezeichnet. • Hohe Reproduzierbarkeit zu Beginn der exponentiellen Phase. PCR: Endpunktbestimmung Real-Time-PCR: Exponentielle Phase = Quantifizierung Real-Time-PCR Vorteile: • verlässliche, exakte Quantifizierung von Bakterienzahlen ¾ hohe Reproduzierbarkeit zu Beginn der exponentiellen Phase • hohe Spezifität ¾ Verwendung einer dritte Sonde • hohe Sensitivität PCR: Endpunktbestimmung ¾ untere Nachweisgrenze = 100 Bakterien • hohe Objektivität ¾ automatisierter Prozess Real-Time-PCR: Exponentielle Phase = Quantifizierung Real-Time-PCR Real-Time-PCR = verbesserte, modifizierte PCR • Zusätzliche Verwendung einer artspezifischen Sonde in der PCR. • Die Sonde ist markiert mit: R = Reporter = setzt ein Fluoreszenzsignal frei Q = Quencher = neutralisiert das Fluoreszenzsignal des Reporters, wenn sich beide Moleküle - Reporter und Quencher in einem definierten Abstand zueinander befinden Dieser Zustand ist gewährleistet, wenn die Sonde intakt ist! Real-Time-PCR • Die mit Reporter und Quencher markierte Sonde bindet an dem gesuchten DNAEinzelstrang. • Die Sonde ist intakt, das Signal wird nicht freigesetzt. • Anschließend binden die Primer und der Strang wird verlängert. • Die fluoreszenzmarkierte Sonde wird vom Einzelstrang abgespalten und zerstört. Real-Time-PCR • Durch die Zerstörung der Sonde wird der definierte Abstand zwischen Reporter und Quencher aufgehoben. • Das Fluoreszenzsignal wird freigesetzt und per Computer aufgezeichnet. • Das Fluoreszenzsignal bleibt nach Fertigstellung der Doppelstränge bestehen. Real-Time-PCR • Je mehr DNA kopiert wird, d.h. je mehr Doppelstränge entstehen, desto stärker wird das Signal. Real-Time-PCR • Der Reaktionsverlauf der DNAVervielfältigung wird aufgezeichnet. • Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse am Endpunkt ist sehr gering. (Mehrfache Wiederholung eines Versuches zeigt breite Fehlerstreuung am Endpunkt.) • Die Real-Time-PCR ermöglicht die Aufzeichnung des Reaktionsverlaufes: Dadurch muss nicht (wie bei herkömmlicher PCR) der Endpunkt bestimmt werden. • Mit der Bestimmung zu Beginn der exponentiellen Phase (die Kurven liegen noch sehr dicht beieinander) ist die exakte Quantifizierung der Bakterienzahlen in der Ausgangsprobe möglich. PCR: Endpunktbestimmung Real-Time-PCR: Exponentielle Phase = Quantifizierung Exponentielle Phase = Quantifizierung
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