Bioaktive Pilzinhaltsstoffe

Bioaktive Inhaltsstoffe aus Pilzen
Norbert Arnold
Leibniz -Institut für Pflanzenbiochemie | 12/12/2015
1
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
 Evolutionär sehr alte Organismen
 Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
 Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
2
Pilzfruchtkörper

Pilze: Großteil des Lebenskreislaufes unter der Oberfläche (Mycelium)

Pilzfruchtkörper (reproduktives Organ): ~ 1 Monat über der Oberfläche

Mycel: Armillaria bulbosa: 1 500 Jahre alt, über 10 000 kg, 15 ha
Armillaria ostoyae: 2 400 Jahre alt, 900 ha
3
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
 Evolutionär sehr alte Organismen
 Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
 Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
 Lebensweise: Mykorrhiza, Saprophyten
4
Lebensweise
Saprophytische Pilze
 Ernähren sich von
totem organischen
Material
 geringe strukturelle
Diversität der Inhaltsstoffe
 hohe Anzahl von
Fruchtkörpern pro Myzel
 abbauenden Enzyme ↑
Mycorrhizapilze
 Ernährung durch den
Mylorrhizpartner (Bäume)
 hohe strukturelle
Diversität der Inhaltsstoffe
 geringe Anzahl von
Fruchtkörpern pro Myzel
 abbauenden Enzyme ↓
5
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
 Evolutionär sehr alte Organismen
 Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
 Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
 Hohe Spezialisierung: z.B. Mykorrhiza
 Hohe biologische Diversität = hohe chemische Diversität
neue bioaktive Naturstoffe zu erwarten
6
Feldbeobachtung
 Warum sind die Fruchtkörper einiger Pilzgattungen (hier: Mykorrhizapilze) attraktiv für
„pilzliche Parasiten“, andere hingegen nicht?
 Verhindern Abwehrsubstanzen einen parasitischen Befall ?
7
Gattung Hygrophorus
 Tricholomataceae (Ritterlingsartige)
 ~ 60 Arten in Europa
 Symbiose (Mykorrhiza) mit Bäumen:
Fichte, Tanne, Eiche, Buche, Weide
 essbar bis ungenießbar, aber nie giftig.
 Name:
Hygro - phorus
griechisch: ὑγρω - φορειν
feucht – tragen(d)
Schnecklinge : Pilzfruchtkörper mit schleimigen Überzug

z. T. Farbreaktion des Stieles und Hutes mit KOH

selten von parasitischen Pilzen befallen
8
Gattung Hygrophorus
Sect. Hygrophorus – Subsect. Chrysodonti
H. chrysodon
Sect. Pudorini – Subsect. Pudorini
H. poetarum
GelbzahnSchneckling
Isabellrötlicher
Schneckling
Sect. Hygrophorus – Subsect. Pallidini
H. penarius
H. nemoreus
Wald-Schneckling
H. pudorinus
Orange-Schneckling
Trockener
Schneckling
Sect. Hygrophorus – Subsect. Hygrophorus
H. eburneus
Sect. Discoidei
H. discoideus
ElfenbeinSchneckling
Verfärbender
Schneckling
H. hedrychii
H. gliocyclus
Birkenschneckling
Schleimberingter
Schneckling
H. carpini
H. chrysaspis
HainbuchenSchneckling
Sect. Pudorini – Subsect. Erubescentes
H. erubescens
Rasiger
Purpurschneckling
H. capreolarius
Weinroter
Schneckling
H. unicolor
H. cossus
Braunscheibiger
Schneckling
Orangefalber
Schneckling
H. lucorum
H. hypothejus
LärchenSchneckling
Frostschneckling
Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Olivaceoumbrini
H. olivaceoalbus
Natterstieliger
Schneckling
H. persoonii
Olivgestiefelter
Schneckling
H. latitabundus
H. russula
Purpurschneckling
Großer KiefernSchneckling
Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Tephroleuci
H. pustulatus
Schwarzpunktierter
Schneckling
H. agathosmus
Mehliger
Schneckling
9
Bioaktivitäts-geleitete Isolierung der Inhaltsstoffe
Extraktion
Probenvorbereitung
In vitro Bioaktivitätsuntersuchungen
aktiv
Isolierung und
Strukturaufklärung
Synthese
Derivatisierung
Leitstruktur
aktiv
In vitro / in vivo
Tests
Reinsubstanz
pharmakokinetische Studien
Biosyntheseuntersuchungen
10
Biotests auf fungizide Wirkung
Botrytis cinerea
 Graufäule, Grauschimmel
 Erdbeeren, Weinrebe
Septoria tritici
 Blattdürre
 Weizen, Roggen
Phytophthora infestans
 Kraut- und Knollenfäule
 Kartoffel, Tomate
11
Biotest auf fungizide Wirkung – direkte Bioautographie
Cladosporium cucumerinum
 Gurkenkrätze
 Gurke, Kürbis
12
Aufbringen der Extrakte/Substanzen auf DC-Platten
13
Besprühen mit Sporen von Cladosporium cucumerinum
14
Keimung und Myzelwachstum (2 Tage, 25°C)
15
Auswertung und Dokumentation
16
Direkte Bioautographie
EtOAc Rohextrakt
50 µg
100 µg
200 µg
400 µg
EtOAc Rohextrakt nach DC-Entwicklung
Tageslicht
365 nm
254 nm
Nach Inkubation
17
Strukturaufklärung
Massenspektrometrie: Summenformel
NMR-Spektoskopie: 1H, 13C
Optische Spektroskopie: UV, CD
Hygrophorus eburneus
O
O
HO
HO
O
O
O
O
HO
HO
O
O
O
O
HO
HO
O
O
4-Oxo-2-alken Fettsäuren
O
HO
O
(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid
O
HO
O
(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid
O
HO
O
(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid
20
4-Oxo-2-alken Fettsäuren
O
O
HO
HO
O
(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid (1)
O
(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid (5)
O
O
HO
HO
O
O
(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11,17-trienoic acid (2)
(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid (6)
O
O
HO
HO
O
(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9,17-trienoic acid (3)
O
(E)-4-oxooctadeca-2,17-dienoic acid (7)
O
O
HO
HO
O
(E)-4-oxohexadeca-2-enoic acid (4)
O
(E)-4-oxooctadeca-2-enoic acid (8)
21
Synthese
a
O
b
O
O
H
O
1
O
O
c
2
d
HO
O
3
NaO
O
4
Gewächshaustests
Feldversuche
Solanum tuberosum infiziert mit Phytophthora infestans
Hygrophorone
O
O R3
n
OR2
OR1
500
ng
2'500
ng
1'000
ng
4'000
ng
1'500
ng
6'000
ng
2'000
ng
8'000
ng
25
Hygrophorone
O
O R3
OR2
OR1
O
5
4
OR3
3
O
O
R
C
H
O
R
1
O
R
CnH2n+1
6
6n
2
n
+
1
5
2
4
2
OR
OR1
1: R1 = Ac
2: R1 = Ac
3: R1 = H
4: R1 = Ac
5: R1 = Ac
6: R1 = H
7: R1 = H
8: R1 = Ac
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = Ac
n
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
n = 12
n = 12
n = 12
n = 14
n = 14
n = 14
n = 12
n = 12_
1
2
3
_
9
:
R
=
H
R
=
H
R
=
H
n
=
1
4
1
2
3
1
0
:
R
=
H
R
=
H
R
=
H
n
=
1
6
1
2
3
1
1
:
R
=
A
c
R
=
H
R
=
H
n
=
1
4
1
2
3
1
2
:
R
=
H
R
=
H
R
=
A
c
n
=
1
4
1
2
3
1
3
:
R
=
A
c
R
=
H
R
=
A
c
n
=
1
4
1
2
3
_
1
4
:
R
=
A
c
R
=
A
c
R
=
A
c
n
=
1
4
O
5
4
O
O
6
OH
OR
17: R = Ac
18: R = H
C 12 H 25
O
5
4
6
OH
OR
C n H 2n+1
19: R = Ac n = 12
20: R = H n = 12
21: R = Ac n = 14
26
Neue Hygrophoron-artige Verbindungen aus H. abieticola
3
OO
R
n
2
O
R
1
Hygrophorone
O
R
O
OH
OH
Pseudohygrophoron A12
OH
O
OH
OH
Pseudohygrophoron B12
OH
27
Biosyntheseuntersuchungen
13 C-NMR Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance, Kernresonanzspektrometrie)
Verfütterungsexperimente mit 13C markierten Substanzen
28
Mögliche Biosynthese von Hygrophoron B12
O
OH
A
O
H 3C
HO
O
OH
COOH
HO
pyruvic acid
?
5
acetyl-CoA
3
O
4
6
OH
OH
7
17
hygrophorone B 12
OH
anhydrofructose
18
1
B
HO
OH
2
SCoA
OH
D-glucose
O
O
H3C
glucan
metabolism
O
glycolysis
OH
OH
?
OH
OH
pentenomycin
29
Verfütterungsexperimente
1. Dokumentation
30
Verfütterungsexperimente
31
Verfütterungsexperimente
2. Vorbereitung
32
Verfütterungsexperimente
3. Probenvorbereitung
33
Verfütterungsexperimente
4. Verimpfung
34
Verfütterungsexperimente
35
Verfütterungsexperimente
5. Dokumentation
36
Beobachtetes Isotopenmuster
O
[U-13C6]-glucose
SCoA
O
1
OH
16
18
5
2
3
8
[2-13C]-acetate
6
4
7
OH
OH
17
hygrophoroneB12
37
Beobachtetes Isotopenmuster
O
[U-13C6]-glucose
SCoA
O
1
5
2
3
O
C12H25
O
6
4
O
C12H25
O
O
O
O
O
OH
1
C12H25
O
H
8
16
H
18
5
2
6
3
[2-13C]-acetate
4
OH
OH
7
17
Hygrophorone B12
38
Biosynthese von Hygrophoron B12
O
SCoA
O
(E)
1
4
HO
17
6
5
18
O
4-oxooctadec-2-enoic acid
E/Z isomerization
hydroxylation at C-6
O
1
OH
(Z)
17
4
5
O
6
18
OH
intramolecular condensation
oxidation to carbonyl group (C-6)
O
O
18
1
5
2
6
17
3
4
O chrysotrione B homologue
reduction to hydroxyl group (C-4 & C-6)
hydroxylation at C-5
O
5
2
3
OH
18
1
4
6
OH
OH
17
hygrophorone B12
39
Hygrophorus hyacinthinus Quel.
daylight
uv light (365 nm)
40
DC-Vergleich mit Cortinarius brunneus
Cortinarius brunneus
H. hyacinthinus
TLC: BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1
41
β-Carbolin-Alkaloide in Hygrophorus spp.
N
N
H
9H-pyrrido[3,4-b]indole
Norharman
N
N
H
uv 254 nm
uv 365 nm
Me
1-Methyl-9-H-carboline
Harman
42
Algizide Aktivität von Harman and Norharman
100 µg
10 µg
1 µg
0.1 µg
100 µg
10 µg
1 µg
0.1 µg
Norharman
Harman
Spirulina laxissima
Scenedesmus rubescens
N CH3
Cl
N
H
Nostocarbolin
I
N
N
H
R
R = H: Norharman
R = CH3: Harman
43
β-Carbolin-Alkaloide aus Cortinarius brunneus
COOH
N
HO
N
H
CH3
Brunnein A
COOH
NH
HO
N
H
CH3
Brunnein B
COOH
NH
HO
Brunnein C
N
H
N
HO
N
H
COOH
3-(7-Hydroxy-9H- -carboline-1-yl)propanoic acid
44
Bioaktivität – Hemmung der Acetylcholinesterase
COOH
N
HO
N
H
Brunnein A
CH3
versus
N CH3
Cl
N
H
I
Nostocarboline *
in vitro Assay zur AChE-Hemmung (Methode nach Ellman)
* Paul G. Becher, Julien Beuchat, Karl Gademann, Friedrich Jüttner (2005) - Nostocarboline: Isolation and Synthesis of a New Cholinesterase Inhibitor fromNostoc 78-12A, J. Nat. Prod., 68, 1793-1795.
45
Vorkommen der β-Carbolinalkaloide in Hygrophorus spp.
Harman und Norharman kommen ubiquitär
innerhalb von Hygrophorus vor
= chemotaxonomischer Marker
der Gattung Hygrophorus
Brunnein A wurde ausschliesslich in Arten
der Sektion Olivaceoumbrini gefunden
= chemotaxonomischer Marker der
Sektion Olivaceoumbrini
46
N-Glukosyl-Indol-Derivative aus Cortinarius brunneus
9
O
O
8
4
8
4
3
5
3
5
2
6
2
6
N
7
O
5'
6'
HO
N
7
1'
OH
2'
6'
HO
5'
3'
4'
1'
O
OH
2'
3'
4'
HO
OH
HO
OH
O
O
8
8
9
4
3
5
2
6
N
7
O
HO
6'
5'
HO
OH
2
6
O
10
N
7
O
OH
2'
9
3
5
1'
3'
4'
OH
4
6'
HO
5'
1'
OH
2'
3'
4'
HO
OH
47
Bioaktivität von N-Glucosyl-(1H-indol-3-yl)-essigsäure
O
O
OH
OH
N
N
H
O
Indol-3-yl-essigsäure (IES)
OH
HO

in Pflanzen natürlich vorkommendes
Phytohormon aus der Gruppe der Auxine

wirkt schon in kleinsten Mengen

stimuliert in geringen Konzentrationen
HO
OH
Wachstum von Pflanzen/Wurzeln

inhibiert in hohen Konzentrationen Wachstum von
Pflanzen/Wurzeln
48
Auxinassay - A. thaliana Wurzelspitzenwachstum (10 d)
O
OH
N
H
O
OH
N
O
HO
HO
OH
OH
49
Cortinarius subtortus - infractus
Molekulare Analyse: 2 Sektionen
Morphologie: 1 Sektion
Sekt. Amarescentes:
C. infractus
C. subtortus
Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.
Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.
Unterschiede im Sekundärmetabolitenmuster?
50
(Iso)-Chinolin-Alkakloide aus Cortinarius subtortus
HO
N
COOH
6-Hydroxyquinoline-8-carboxylic acid
NH2
HO
N
COOH
4-Amino-6-hydroxyquinoline-8-carboxylic acid
COOH
NH
HO
O
7-Hydroxy-1-oxo-1,2-dihydroisoquinoline-5-carboxylic acid
51
Hemmung des Mycelwachstums von Colletotrichum coccodes
Myzelwachstumsinhibierungsassay - Co. coccodes (6 dpi)
100
+
80
OH
SO4-
N
H
2
Inhibierung [%]
HO
60
N
COOH
64
65
40
156
COOH
NH2
20
HO
N
COOH
0
NH
HO
O
-20
0,001
0,01
0,1
Konz. [µM]
1
63
1
10
100
(Iso)-Chinolin-Alkaloide als Antiseptika
H
O
N
C
O
O
H
8-Hydroxyquinoline-6-carboxylic acid
+
SO4-
N
OH
2
8-Quinolinol hemisulfate
1
Cortinarius infractus (Pers.) Fr.
Cl
N+
N
O
Infractopicrin
HO
N+
Cl-
N
O
10-hydroxy-infractopicrin
54
Bioaktivität – Hemmung der Cholinesterase
55
Cortinarius subtortus - infractus
Molekulare Analyse: 2 Sectionen
Morphologie: 1 Section
Sect. Amarescentes:
C. infractus
C. subtortus
Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.
Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.
Sektion Subtorti*
C. subtortus
(Iso-)Chinolin-Alkaloide
HO
N
COOH
NH2
HO
N
COOH
COOH
NH
HO
O
Sektion Infracti*
C. infractus
Indol-Alkaloide**
A. Otto
Dr. A. Porzel (NMR)
E. Bette
Dr. J. Schmidt (Massenspektrometrie)
T. Dräger
Dr. W. Brandt (CD Berechnungen)
A. Laub
Prof. Dr. B. Westermann (Synthese)
Dr. T. Teichert
Prof. Dr. L. Wessjohann (Synthese)
Dr. L. Lübken
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
Leibniz-Institut für Pflanzenbiochmie | Norbert Arnold | 12/12/2015
57
References
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