thesis - ian jones - ETH E

DISS. ETH NO. 22906
OPTICAL AND ELECTRICAL
STIMULATION OF RETINAL
GANGLION CELLS ON A CMOS
MICROELECTRODE ARRAY
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
IAN LLOYD JONES
M.A. Medical Sciences, Boston University School of Medicine, USA
born on 09.04.1979
citizen of
United States of America
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Andreas Hierlemann
Prof. Dr. Botond Roska
Dr. Karl Farrow
2015
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Abstract
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This thesis presents the implementation of two complementary metal–oxide–
semiconductor (CMOS) high-density microelectrode array (HD-MEA) chip
devices in order to interface with the ex-vivo retina for the following objectives:
1.
2.
3.
Identification of retinal ganglion cell populations based on their light
responses to projected optical stimuli.
Establishment of a method for semi-automated classification of
ganglion cells by recording extracellular light responses to a series of
optical stimuli.
Characterization of the response of the ganglion cell to voltage pulse
stimuli across a cell-centered micro region, and focal electrical
stimulation of targeted cells.
The retina is a part of the brain that performs complex signal processing of
optical input, the result of which is a spatiotemporal pattern of electrical pulses.
These pulses are generated by the neural output layer – the ganglion cell layer –
and sent to higher brains centers to be interpreted as vision. The HD-MEAs,
featured in this thesis, provide a direct two-way interface to the ganglion cells at
high spatial and temporal resolution, which makes it possible to study the cells at
a novel and higher level of detail.
There were two generations of CMOS HD-MEA systems used in this project: for
the optical stimulation work, an HD-MEA featuring 11,011 electrodes, 18 μm
electrode pitch (hexagonal electrode arrangement), and 126 rapidly-configurable
recording channels was used; for the electrical stimulation part, the subsequent
generation in this of HD-MEAs was used, which featured 26,400 electrodes (grid
arrangement), 17.5 μm electrode pitch, and 1024 recording channels.
In an initial methods step, we recorded from mouse ganglion cells while
stimulating the cells with bright moving bars that were projected onto the
photoreceptor layer through an upright microscope. We were able to successfully
identify direction selective ON-OFF ganglion cells by analyzing their responses
to the moving bars.
In order to perform the classification of hamster retinal ganglion cell types,
which have not previously been characterized, a series of optical stimuli were
used. The optical stimuli, which had a total run time of 3.5 hours, consisted of
flashing squares and moving bars of varying widths, lengths, orientations and
speeds of movement. The stimuli were designed to present a range of visual
features in order to elicit responses from the widest variety of ganglion cell types
possible. 262 ganglion cells were recorded in seven experiments. Spike sorting
and action potential template matching were performed on the data in order to
obtain the spike trains of each cell. Seven normalized parameters were extracted
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Abstract
from the light responses of the processed cells, five parameters of which were
clustered using k-means. Ultimately, we identified seven ganglion cell types that
correlate with types found in other species.
To assess electrical stimulation response characteristics of ganglion cells, voltage
stimulation thresholds were first found. Biphasic pulse voltage sweeps on single
electrodes (up to 300 mV in 27mV steps, pulse phase width 200 μs) were applied
to the peak regions of the spike-triggered average extracellular action potential
(STA-EAP) of each cell. Cell responses were read out at the axonal region,
hundreds of microns from the stimulation site in order to avoid stimulus artifacts.
In an attempt to reduce stimulation thresholds, we also applied monophasic
pulses on single electrodes, as well as monophasic and biphasic pulses on pairs
of electrodes at various electrode-to-electrode spacings; there was however no
significant difference found between the stimulation configurations. We found
that OFF cells had a lower threshold than ON cells using biphasic pulses.
We determined the sensitivity of ganglion cells to biphasic voltage pulse
stimulation on multiple electrodes (in series) over a 105 × 105 μm2 micro-region
that was centered on the STA-EAP. We found that the cells were most easily
stimulated in the vicinity of the STA-EAP peak or the action potential origin.
The stimulation threshold was linearly correlated to the action potential distance
traveled and latency, and inversely correlated to the STA-EAP amplitude.
Finally, we recorded from all 24,600 electrodes using multiple electrode
configuration blocks, while stimulating selected cells with biphasic pulses. We
were successfully able to stimulate 4 out of 4 ganglion cells selectively.
The use of the CMOS HD-MEA as an interface to the retina provided us with a
unique opportunity to examine features and characteristics of retinal ganglion
cells, including extracellular subcellular-resolution activity, type-specific
responses to optical stimuli, and sensitivity to extracellularly applied electrical
stimuli.
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Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung zweier hochintegrierter
Mikroelektroden-Array Chips (HD-MEAs) auf der Basis komplementärer
Metall-Oxid-Halbleiter-Technologie (CMOS) zur elektrischen ex-vivo
Ankoppelung an die Retina, zur Erreichung folgender Ziele:
1.
2.
3.
Identifizierung retinaler Ganglionzellpopulationen anhand deren
Antwortverhalten auf spezifische optische Stimulationsmuster.
Entwicklung einer Methode zur halbautomatischen Klassifikation von
Ganglionzellen
anhand
deren
Signale
auf
verschiedene
Lichtstimulationen.
Charakterisierung der ortsabhängigen Reaktion von Ganglionzellen auf
elektrische Stimulation, sowie fokussierte, elektrische Stimulation
ausgewählter Zellen.
Die Retina verabeitet optische Signale in ein räumlich-zeitliches Muster
elektrischer Pulse. Diese Pulse werden von einer neuralen Ausgabeschicht – der
Ganglionzellschicht – erzeugt, und in die höheren Hirnzentren weitergeleitet,
wo sie interpretiert werden. Die in dieser Arbeit eingesetzten HD-MEAs
erlauben eine direkte bidirektionale elektrische Ankoppelung an die
Ganglionzellen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung, welche es
ermöglicht, die Zellen sehr detailliert zu studieren.
In diesem Projekt wurden zwei Generationen von CMOS HD-MEA-Systemen
eingesetzt: Für die Arbeit mittels optischer Stimulation wurde ein HD-MEA mit
11‘011 Elektroden, 18 μm Elektrodenraster (hexagonale Anordnung der
Elektroden), sowie 126 schnell-konfigurierbaren Aufzeichnungskanälen
eingesetzt; für die Anwendung elektrischer Stimulation wurde die nächste
Generation dieses HD-MEAs verwendet, welches über 26‘400 Elektroden (in
Gitter-Anordnung), 17.5 μm Elektrodenraster und 1‘024 Aufzeichnungskanäle
verfügt.
In einem ersten Experiment zeichneten wir die Signale von Mausganglionzellen
auf, während die Zellen mit Lichtbalken stimuliert wurden, welche über ein
Mikroskop auf die Fotorezeptoren-Schicht projiziert wurden. Durch die Analyse
der Zellsignale auf die sich bewegenden Lichtbalken konnten wir
richtungsempfindliche ON-OFF Ganglionzellen identifizieren.
Um die Klassifikation bisher nicht charakterisierter Hamsterganglionzellen
durchzuführen, wurde einer Serie verschiedener optischer Stimulationsmuster
verwendet. Die optischen Stimulationen, welche über eine Gesamtdauer von 3.5
Stunden durchgeführt wurden, umfassten blinkende Quadrate, bewegte Balken
variabler Weite, Länge, Winkel und Laufgeschwindigkeit. Bei der Entwicklung
der Stimulationsmuster wurde Wert darauf gelegt, Antworten aus einer
grösstmöglichen Variation an Ganglionzelltypen gewinnen zu können. In sieben
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Zusammenfassung
Experimenten wurden Signal von 262 Ganglionzellen aufgezeichnet. Die
aufgezeichneten Daten wurden einem Spike-Sorting sowie einem Action
Potential Template Matching unterzogen, um die Pulsfolge jeder Zelle zu
erhalten. Aus den lichtspezifischen Reaktionen der Zellen wurden sieben
normalisierte Parameter extrahiert, von welchen fünf Parameter unter der
Verwendung eines K-means Algorithmus gruppiert wurden. Schlussendlich
konnten wir sieben Typen von Ganglionzellen identifizieren, welche mit
entsprechenden Typen anderer Spezies korrelieren.
Um die Antwortcharakteristik von Ganglionzellen auf elektrische Stimulationen
bemessen zu können, wurden zuerst deren Schwellwerte bestimmt. Biphasische
Pulsspannungssweeps (bis zu 300 mV in 27 mV Schritten, Pulslänge 200 μs)
wurden an einzelnen Elektroden in den Peak-Gebieten des Spike-Triggered
Average Extracellular Action Potential (STA-EAP) jeder Zelle angelegt. Die
Antworten der Zellen wurden hunderte Mikrometer entfernt von der
Stimulationsstelle in axonalen Zonen aufgezeichnet, um Stimulationsartefakte
zu vermeiden. In einem Versuch, die Stimulationsschwellwerte zu reduzieren,
legten wir zudem einphasige Spannungspulse an einzelne Elektroden, sowie
einphasige und biphasische Pulse an Elektrodenpaare – mit variierenden
Elektrodenabständen – an; jedoch konnten wir keinen signifikanten Unterschied
zwischen den Stimulations-Konfigurationen feststellen. Bei Verwendung
biphasischer Pulse konnten wir beobachten, dass OFF-Zellen einen tieferen
Schwellwert aufweisen, als ON-Zellen.
Innerhalb einer Mikroregion von 105 x 105 μm2, welche auf das STA-EAP
zentriert war, bestimmten wir die Sensitivität von Ganglionzellen auf
biphasische Spannungspulsstimulation auf verschiedenen Elektroden (in Serie).
Wir beobachteten, dass die Zellen am einfachsten in der Nähe des STA-EAP
Peak oder im Ursprung des Aktionspotentials stimuliert werden konnten. Der
Stimulationsschwellwert korrelierte linear mit der zurückgelegten Distanz des
Aktionspotentials und der Latenzzeit, und war umgekehrt proportional zur
Amplitude
des
STA-EAP.
Unter
der
Verwendung
mehrerer
Elektrodenkonfigurationen zeichneten wir abschliessend Signale von allen
24‘600 Elektroden auf, während selektierte Zellen mit biphasischen Pulses
stimuliert wurden. Es gelang uns, vier von vier Ganglionzellen selektiv zu
stimulieren.
Die Anwendung des CMOS HD-MEAs als Schnittstelle zur Retina ermöglichte
uns die Eigenschaften und Charakteristiken der retinalen Ganglionzellen zu
untersuchen, inklusive deren extrazellulären Aktivität. Die Messungen wurden
mit subzellulärer Auflösung durchgeführt, die typenspezifischen Antwortsignale
auf optische Stimulationen, und extrazelluläre elektrische Stimulationen wurden
charakterisiert.
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