成 膜 大 学 理 工 学 研 究 報 告 J.Fac.Sci.Tech.,SeikeiUniv. Vo1.52No.2(2015)pp.19-24 (特 別 研 究 費 に 係 る 論 文) サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に よ る カ ル レテ ィ キ ュ リ ンー 糖鎖相互作用解析 平野 真*1,戸 谷 希 一 郎*2 Interactionanalysisofcalreticulinandglycansusingthermalshiftassay MakotoHIRANO*1,KiichiroTOTANI*2 ABSTRACT:Calreticulin(CRT)hasbeendescribedasalectin-likechaperonethatrecognizes GlclMangGlcNAc2(GIM9)-glycoproteinsintheendoplasmicreticulum(ER).HoweverwhetherCRT directlyrecognizesaglycone(proteinportion)ofglycoproteinremainscontroversial.Ourpreviousstudy demonstratedthatCRTcompetitivelyinhibitedglucosidaseIIactivityagainstahydrophobicsubstratenot butthatagainstahydrophilicsubstrate,implyingthatCRTrecognizesnotonlyglycanstnlcturebutalso aglyconehydrophobicity.HeretoinvestigatethepossibilitywepreparedligandsfbrCRT:GIM9-derivatives withdifferenthydrophobicityontheaglyconeandgraduallydenaturedimmunoglobulinY(IgY),which harborsGlMgglycan,andanalyzedtheinteractionofarecombinantCRTwiththeligandsusingthermal shiftassay.TheseresultsdemonstratethatCRTstronglybindstomorehydrophobicGIM9-derivativeand moredenatUredIgY,clarifyingthatCRTmorestronglybindsmisfoldedglycoprotein,andreverselyreleases fbldedglycoproteinbydistinguishingthefbldingstatUsofglycoproteinintheERglycoproteinquality COntrOlSyStem. Keywords:calreticulin,lectin,glycoprotein,aglycone,thermalshiftassay (ReceivedSeptember30,2015) 1は じめ に され て い る(6)。 し か し な が ら 、CRTがGIM9型 ク 質 の 糖 鎖 部 分 と タ ン パ ク 質 部 分(ア タ ンパ ク 質 の 生 合 成 過 程 に お い て 、 小 胞 体 糖 タ ンパ ク グ リ コ ン)の 両方 を 認 識 す る か 、 あ る い は 、 糖 鎖 部 分 の み を認 識 す る の か 不 明 確 で あ る(7-12)。 質 品 質 管 理 機 構 は 必 要 不 可 欠 で あ る 。 特 に 、 Calnexin/Calreticulin(CNX/CRT)サ 糖 タ ンパ イ ク ル は 、そ の 中 心 機i 以 前 の 我 々 の 研 究 に お い て 、 過 剰 量 のCRT存 在 下、ア 構 と し て 、 タ ン パ ク 質 の 正 常 な 折 り畳 み に 寄 与 して い る グ リ コ ン 構 造 に 活 性 が 左 右 され な いglucosidaseII(13)が (1)。CRTは 疎 水 性 の ア グ リ コ ン を 有 す るGIM9型 、 こ の サ イ ク ル に お い て 、 折 り畳 み セ ン サ ー 基 質 よ り も親 水 性 酵 素UGGT(UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase) の ア グ リ コ ン を 有 す るGIM9型 と 共 同 し 、 新 生 糖 タ ン パ ク 質 上 のGlclMangGlcNAc2 しや す い こ と を 示 し て い る(14)。 (GIM9)型 の 基 質 を 捕 捉 し 、glucosidaseIIの 基 質 へ の ア ク セ ス を 阻 害 糖 鎖 を 認 識 し 、 タ ン パ ク 質 部 分 の 折 り畳 み を 促 進 す る機 能 が 知 ら れ て い る(2-5)。CRTは 、1つ の 糖 鎖 し て い る こ と 、 す な わ ち 、CRTは 基 質 か らGlc残 基 を 切 断 こ れ は 、CRTが 疎 水性 糖 鎖 だ け で な く、 ア グ 認 識 ドメ イ ン を 有 し 、 そ こ か ら 長 い ヘ ア ピ ン を 伸 張 し、 リ コ ン の 疎 水 性 度 を も認 識 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 プ ロ リ ン リ ッ チ な ドメ イ ン を 形 成 す る 。X線 結 晶構 造 解 折 り畳 み 過 程 で 、 タ ン パ ク 質 は 成 熟 す る に 従 い 、 疎 水 性 基が糖鎖 の ア ミ ノ酸 配 列 が 内 包 され 、 そ の 疎 水 性 度 が 低 下 す る 。 析 か ら 、GIM9型 糖 鎖 上 の グ ル コ ー ス(Glc)残 認 識 ドメ イ ン と 糖 鎖 と の 相 互 作 用 に 必 須 で あ る こ と が 示 し た が っ て 、 こ れ ら の こ と か ら 、CRTは 、未 成 熟 で 疎 水 性 度 の 高 い 糖 タ ンパ ク 質 と 強 く相 互 作 用 し 、 逆 に 、 成 熟 *1:成 膜 大学 理 工学部 物質生命 理工 学科 助教 し親 水 性 度 の 高 い 糖 タ ンパ ク 質 と の 相 互 作 用 は 弱 く な る *2:成 瞑大学 理工学部 物質生命理 工学科 准教授(ktotani@st ,seikei,ac,jp) 一19一 と推 測 され た 。 成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告 A 本稿 で は 、こ の仮 説 の立 証 を題 材 に 、糖 鎖 一レクチ ン相 互 作 用 解 析 に お け るサ ー マル シ フ トア ッセ イ(15)の Vol.52No.2(2015.12) B400 有 12000 9000 0 差 2.サ 、。。。 0 0 4 トミ⊃﹄ぱマ 用性 に つ い て議 論 す る。 一800 3000 ー マ ル シ フ トア ッ セ イ ・1200 0 25303540455055 25303540455055 サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ は 、SYPROOrangeと い う蛍 光 τノ。C Tノ 。C 物 質 と リア ル タイ ムPCRの 装 置 を用 い て 、 タ ー ゲ ッ トタ Figure1.Determinationofdenaturationtemperature(Td)of ンパ ク質 の 変性 温 度 を 測 定 し、 そ の 相 対 的 な 安 定 性 を評 calreticulin(CRT》.TheCRTsolution(20μL)inthepresenceof 価 す る こ とが で き る手 法 で あ る。 す な わ ち、 タ ンパ ク質 SYPRO⑪Orangedyewasgraduallyheatedfrom25。Cto55。C の熱 変性 の過 程 で 、 天 然 で は タ ンパ ク質 の 立 体 構 造 中 に inareal-timePCRdevice,andthefluorescenceintensitywas monitoredtoobtainmeltcurves(A).Themeltpeaks(B)revealed 内 包 され て い る疎 水 性 領 域 が 露 出 す る 。 こ の と き 、 thattheTdforCRTrangedfrom45.6。Cto45.8。C.Temperature SYPROOrangeは 、露 出 した 疎 水 性 領 域 に特 異 的 に結 合 し、 atthelocalminimumsrepresentsTd. 蛍 光 を発 す る。 この 蛍 光 強 度 の 変 化 をモ ニ タ リン グす る こ とで タ ンパ ク質 の 変 性 温 度 を測 定 す る こ とが 可 能 とな 8,12μM)と60x濃 る。 こ こで 、 タ ンパ ク質 とそ の リガ ン ド分 子 が 共 存 す る をTris-bufferedsaline(pH7.4)/10mMCaCl2(TBSCa)中 と、タ ンパ ク質 一リガ ン ド複 合 体 が形 成 され 、タ ンパ ク質 総 溶 液 量20pLで が 安 定化 され るた め 、 リガ ン ドとの 相 互 作 用 の 親 和 性 に Bio-Rad)に 依 存 して タ ンパ ク質 の 変 性 温 度 は 上 昇 す る。 この 変 性 温 が ら 、 励 起 光470㎜ 度 の 変 化(△Td)を タ リ ン グ し た 。 こ れ に よ り得 られ た 曲 線 をMeltcurveと 指 標 と して 、 タ ンパ ク質 一リガ ン ド相 度 のSYPROOrange(Original:5000x) 混 和 し、リ ア ル タ イ ムPCR装 て 、0.20C/10secで で 置(CFX96, 段 階 的 に 温 度 を 上 昇 させ な を 照 射 し 、570nmの 蛍 光 強 度 をモ ニ い 互 作 用 を 評価 す る こ とが 可 能 とな る。 これ ま で 、 サ ー マ い 、 こ の 変 曲 点 が 変 性 温 度 を 示 して い る(Fig.1A)。 ル シ フ トア ッセ イ は 、創 薬研 究 に お い て 、 比 較 的 親 和 性 に 、変 曲 点 を 明確 にす るた め 、 蛍 光 強度 を温 度 で微 分 し の 強 い タ ンパ ク質 一リガ ン ド相 互 作 用 の ス ク リー ニ ン グ た 曲 線Meltpeakを に 用 い られ て き た が 、 本研 究 で は 、 比 較 的 親 和 性 の 弱 い 求 め られ る(Fig.IB)。 レ クチ ンー 糖 鎖 の相 互 作 用 に適 用 可 能 か 検 証 す る。 ま た 、 の 変 性 温 度 は 、45.6-45.8。Cで 生 体 分 子 の 相 互 作 用 解 析 には 、 等 温 滴 定熱 量 測 定(ITC) 4μMのCRTで や 表 面 プ ラズ モ ン共 鳴 法(SPR)な どが 用 い られ て き た。 描 く と、 そ の極 小値 を変性 温 度 と して よ っ て 、 こ れ ら の 結 果 か ら 、CRT あ る こ と が 明 ら か と な り、 変 性 温 度 を評 価 で き る こ とが示 唆 され た 。 そ こ で 、 続 い て 、 疎 水 性 度 の 異 な る ア グ リ コ ン構 造 を サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ で は 、 ミ リグ ラム オ ー ダ ー の タ もつGIM9型 ンパ ク 質 が 必 要 なITC(16)と Glu-tBu;Structures,seeFig.2A;Hydrophobicities,seeFig. 比 較 し、 マ イ ク ロ グ ラム オ 糖 鎖 リガ ン ド(GIM9-oH,-Gly-NH2,-Gly- ー ダ ー の タ ンパ ク 質 で 相 互 作 用 を解 析 で き る。ま た 、SPR 2B)を で は 、 た とえ 生 体 内 で は 可 溶 性 の タ ンパ ク質 と して 存 在 セ イ に て 評 価 し た 。 こ こ で は 、CRT(4μM)と して い る タ ンパ ク質 で も 固 定 化 が 必 須 で あ る(17)が 鎖 リ ガ ン ド(12μM)をTBSCa中 、 さら 合 成 し 、CRTと の 相 互 作 用 を サ ー マ ル シ フ トア ッ 各GIM9糖 で 混 和 し 、4QCで1時 間 サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ で は 、 固 定 化 の 必 要 は な く、 溶 プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、SYPROOrangeを60x濃 液 状 態 で 相 互 作 用 を解 析 す る こ とが で き る とい うメ リッ 度 で 添 加 し 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 供 し た 。 得 ら れ トが あ る。そ こで 、本研 究 で は 、これ らの 利 点 を活 か し、 たMeltpeakか 生 体 内 で は 可 溶 性 タ ンパ ク質 と して 存 在 す るCRTと 変 性 温 度 を 算 出 し た(Fig.2c)。 様 々 な ア グ リコ ン構 造 を もつ 合 成GIM9リ くは 、 変性GIM9型 、 ガ ン ド、 も し ら 、 そ れ ぞ れ の リ ガ ン ド共 存 下 で のCRTの そ の 結 果 、 リガ ン ド非 存 在 下 に 比 べ 、GIM9-oH,-Gly-NH2,-Gly-Glu-tBuの 糖 タ ンパ ク質 との 相 互 作 用 をサ ー マ 度 は そ れ ぞ れ 、0.6,1.0,2.OOC上 ル シ フ トア ッセ イ に て評 価 し、 そ の 有 用性 を 検 証 した 。 ら 、CRTと 変性 温 昇 した。 これ らの 結 果 か リガ ン ド と の 相 互 作 用 は ア グ リ コ ン の 疎 水 性 度 に従 っ て 強 くな る こ とが示 され た。 ま た 、 比 較 的親 和 3.CRTと 合 成 リ ガ ン ドと の 相 互 作 用 性 の 弱 い レ ク チ ン 糖 鎖 相 互 作 用 に も 、サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ を 適 用 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 され た 。 CRTと に 、CRT単 リガ ン ドと の 相 互 作 用 を 評 価 す る た め 、 は じめ 体 で の 変 性 温 度 を サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 導 き 出 し た 。 こ こ で は 、 リ コ ン ビ ナ ン トの ヒ トCRT(4, 一20一 Vol.52No.2(2015.12) 成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告 A爺 謬 熱 処 理 し 、変 性 度 の 異 な るlgYの 調 製 を 試 み た 。変 性 度 は SYPROOrangeの ・ 唱 課 蛍 光 強 度 に よ り測 定 し た(Fig.3C)。 結 果 か ら 、IgYは70。Cで 中程 度 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ で 算 出 し た 変 性 温 度 を 超 え た75。Cで 盤熱 改 諜 ざ曝 汽6蛾8 この 完 全 に変 性 した ト モ もの を 調 製 で き る こ とが 示 され た。 した が っ て 次 項 の 鞠轡 触算 ・ 相 互 作 用 解 析 で は 、 未 処 理 のIgYを 70。C,750Cで 熱 処 理 し たlgYを 天 然型 、 そ れ ぞ れ 部 分 変性 型 、完 全 変 性 型 と して評 価 す る こ と と した。 R・1-・ CRTとIgYの HO 室/N・rへ 馳NH・ ズ ・N▽ へ ・・/\/"ピNH2 0HCoofBu O GIM9・OHGIM9・Gly・NH2 GIM9・Gly・Glu/Bu B A B1、C tNPG[ycans LlgandTd[C} -noIigand 200 ,458 ・GlM9-Ofl 0 §12 、464 6 0 0 2 冒 ﹂﹂︾ 、⊃﹂匡η, 8 2000 ,468 ・400 1長 0 乞謹 ・2。00 lll .11 4 2 三 8 =8 。。o﹂〇三﹂) 価ρo昼 o﹂9 = 一'邑 饗 鵬 野 -一 一 ・GIM9-Gly・NH2 書 塁10 4000 tromrgYGUddes GIM9 ← ← 等 0 ・600 ・4000 _1協 ・6000 21JM.714、1 -一 一・4μM ,714、, 一 一8μM ,712t --16pM ,710 ・8000 3540455055 一 〇H-Gly-NH2-Gly-Glu-fBu 了1。C PNG。,JF 一、。。 20 ・600 0 Dataareexpressedasthemean±standarddeviation(nニ3). ,な ミ 卍'2。o琴 40 intensityofthederivativesinthepresenceofSYPRO(R)Orange. 、 一 〉 \ 0 60 hydrophobicitywasevaluatedbymeasuringthefluorescence 200 80 TheaglyconehydrophobicitiesofGIM9-derivatives.The 00 ( 會 ω=2ε 8 5 器20⊇﹂︺ 盆 〇三〇言 oも盈 8 薯 3ω AglyconestructuresofthesynthesizedGIM9-derivatives.(B) D400 20 C Figure2.lnteractionofCRTwithGIM9・derivatives.(A) _-lgY`!{)C)、462 ・800 47075 τ「eatedtemperatureTノ 35 。C preincubation,themixturesofCRT(4μM)andGIM9- Figure3.lnteractionofCRTwithaGIM9・glycoprotein, derivatives(121」M)weresubjectedtoTSA(35。Cto55。C). immunoglobulinY(lgY》.(A)Analysisof〈1-glycansonIgY.〈1- Curvesrepresenttypicalmeltpeaks. GlycancontentoflgYwasanalyzedusingfluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis.TheN-glycansreleasedfromlgY 糖 タ ンパ ク 質 の 作 製 werelabeledwithANDSthroughareductiveaminationand SDS-PAGEd.Bandswereanalyzedusinganimageanalyzer. 次 に 、 実 際 の 糖 タ ン パ ク 質 とCRTと Theguides,GlM9andM9glycans.(B)DeterminationofTdof の相 互 作 用 をサ ー lgYTbmonitorthechangesinthefoldingstatusoflgYduring マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 検 証 す る た め 、 変 性 状 態 の 異 な heatdenaturation,lgYwassubjectedtoTSA(25。Cto95。C). るGIM9型 GIM9型 糖 タ ンパ ク質 の 調 製 を試 み た 。 モ デ ル とな る ImmunoglobulinY(lgY)を にGIM9型 ThecurvesrepresenttypicalmeltpeaksoflgY(C)Heat 糖 タ ン パ ク 質 に は 、 ニ ワ ト リ 由 来 の regulationofthedenaturationstateoflgY.Tbpreparedif「erent 用 い た 。 本 研 究 で 用 い たlgY上 foldingformsoflgY,lgY(4μM)washeatedattheindicated 糖 鎖 が 存 在 す る こ と は 、Fluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis(FACE)シ て 確 認 した(Fig.3A)。 ス テ ム(18)を temperaturesfor2min.SYPRO⑪Orangewasaddedtothe 用い solutionandthesurfacehydrophobicitywasevaluatedby measuringthefluorescenceintensity.Dataareexpressedasthe ま た 、IgYを 種 々 の 濃 度 で サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 供 し 、IgYの mean±standarddeviation(n=3).Forsubsequentanalysesof 変 性 温 度 が71.0-71.4QC の 範 囲 に あ る こ と が 示 さ れ た(Fig.3B)。 この 結 果 か ら、 theinteractionofCRTwithlgY,lgYsunheatedandheatedto 70。Cand75。Cwereusedasnative,partiallydenatured,and IgYとCRTの 変 性 温 度 は 大 き く 異 な っ て お り、サ ー マ ル シ completelydenaturedforms,respectively.(D)lnteractionofCRT フ トア ッ セ イ に て 、 こ れ ら の タ ン パ ク 質 が 共 存 して い て withlgY.Aftera12-hpreincubationofCRT(4μM)andlgY(8 もCRTの 変 性 温 度 の 変 化 を測 定 可能 で あ る こ とが 示 唆 さ μM)withorwithoutheatdenaturation,themixturewassubjected れ た 。 さ ら に 、IgYの 変 性 度 が65。C付 し て い る こ と か ら 、IgYを70、 近 か ら大 き く上 昇 も し く は 、75。Cで2分 toTSA(35。Cto80。C).Curvesrepresenttypicalmeltpeaks 間 rangingfrom35。Cto55。C. 一21一 ご 、=.認 》 三縣灘 乱、 、1 (C)InteractionofCRTwithGIM9-derivatives.Afteranhour 性GIM9型 思[ぜ、 惣 2J「3545556J「758595 Tノ 。C 4.変 一・ 憩 こ1づ 40 ,ll, 50 55 成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告 5.CRTと 参考文献 変 性lgYと の 相 互 作 用 1 最 後 に 、CRTとGIM9型 糖 タ ン パ ク 質 モ デ ル と して 、 天 然 型 、部 分 変 性 型 、完 全 変 性 型lgYと diseases,Physiol.Rev.87(2007)1377-1408. 2 に て 混 和 し 、12時 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、SYPROOrangeを サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ に 供 し た(Fig.3D)。 degradation,BiochemJ.348(2000)1-13. そ の結 果 、 存 下 で は 、CRTの 変 性 温 度 に 変 化 が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、CRTは 天 然 型lgYと A.J.Parodi,RoleofN-oligosaccharideendoplasmic reticulumprocessingreactionsinglycoproteinfbldingand 添 加 し、 3 天 然 型lgY共 D.NHebert,M.Molinari,InandoutoftheER:protein folding,qualitycontrol,degradation,andrelatedhuman の 相 互 作 用 をサ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 解 析 し た 。こ こ で は 、CRT(4μM) と そ れ ぞ れ のIgY(8μM)をTBSCa中 Vol.52No.2(2015.12) D.N.Hebert,B.Foellmer,A.Helenius,Calnexinand calreticulinpromotefblding,delayoligomerizationand は ほ とん ど相 互 作 用 し な い こ と が 示 さ れ た 。一 方 で 、部 分 変 性 型 で は0.2。C suppressdegradationofinfluenzahemagglutininin 上 昇 し 、完 全 変 性 型 で は0.40Cの microsomes,EMBOJ.15(1996)2961-2968. 上 昇 が 認 め られ た 。 よ っ 4 て 、 タ ン パ ク 質 部 分 の 変 性 度 が 上 昇 す る に 従 っ て 、CRT LA.Rutkevich,D.B.Williams,Participationoflectin とlgYと の 親 和 性 が 高 ま る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、タ ン パ chaperonesandthioloxidoreductasesinproteinfblding ク 質 同 士 の 相 互 作 用 に つ い て も、 各 々 の 変 性 温 度 が 異 な withintheendoplasmicreticulum,Curr.OpinCellbiol.23 れ ば 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 評 価 す る こ と が 可 能 (2011)157-166. 5 で あ る こ とが 示 唆 され た。 し か しな が ら、CRTと K.Totani,YIhara,T.Tsujimoto,1.Matsuo,YIto,The recognitionmotifoftheglycoprotein-fbldingsensor 合 成 リガ ン ドとの サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 比 べ て 、 変 性 温 度 の 変 化 は 小 さ か っ た 。 こ enzymeUDP-Glc:glycoproteinglucosyltransferase, れ に は 、IgYの 濃 度 、GIM9型 Biochemistry48(2009)2933-2940. 糖 鎖 の含 有 量 、ま た そ れ ら 6 の バ ラ ンス の 問題 が 挙 げ られ る。 す な わ ち、 本 研 究 で 用 い たlgYに はGIM9型 糖 鎖 は12%程 い 。 そ の た め 、CRTの G.Kozlov,C.L.Pocanschi,A.Rosenauer,S.BastosAristizabal,A.Gorelik,D.B.Williams,K.Gehring, 度 しか 含 ま れ て い な Structuralbasisofcarbohydraterecognitionby リ ガ ン ド と な り得 るGIM9型IgYの calreticulin,J.Biol.Chem.285(2010)38612-38620. 含 有 量 が 極 め て 低 い と い う問 題 点 が あ る 。 こ れ を 解 決 す 7 る た め 、サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ に お い て 、IgYの モ ル 数 A.R.Rodan,J.ESimons,E.S.Trombetta,A.Helenius, を 増 加 し た が 、CRTのMeltpeakがlgYのMeltpeakに N-linkedoligosaccharidesarenecessaryandsufficientfor て し ま い 、CRTの た(datanotshown)。 埋没 し associationofglycosylatedfbrmsofbovineRNasewith 変 性 温 度 を測 定す る こ とが で きな か っ そ の た め 、 よ り明 確 にCRTの calnexinandcalreticulin,EMBOJ.15(1996)6921-6930. リガ ン 糖 タ ンパ ク質 と の 差 を 検 証 す る た め に は 、 よ りGIM9型 糖 鎖 を有 す る 8 ド認 識 に つ い て 、 天 然 型 と 変 性 型GIM9型 S.Allen,N.J.Bulleid,Calnexinandcalreticulinbindto enzymicallyactivetissue-typeplasminogenactivator duringbiosynthesisandarenotrequiredfbrfbldingtothe タ ンパ ク 質 の含 有 量 を 高 め る必 要 が あ る と考 え られ る。 nativeconformation,Biochem.J.328(1997)ll3-119. 9 6.結 論 A.Zapun,S.M.Petrescu,PM.Rudd,R.A.Dwek,D.Y Thomas,J.J.Bergeron,Calnexinandcalreticulinbindto 以 上 の こ とか ら、タ ンパ ク質 を リガ ン ドとす る 際 に は 、 enzymicallyactivetissue-typeplasminogenactivator タ ー ゲ ッ トとな る糖 鎖 を もつ タ ンパ ク質 の 含 有 量 な ど を duringbiosynthesisandarenotrequiredfbrfbldingtothe 考 慮 す る必 要 は あ るが 、比 較 的 親 和 性 の 弱 い レ クチ ンー 糖 nativeconformation,Cell88(1997)29-38. 鎖 相 互 作 用 の解 析 に サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ を適 用 す る 10.B.DiJeso,L.Ulianich,EPacifico,A.Leonardi,P.Vito, こ とが 可 能 で あ り、 本研 究 を通 じて 、CRTはGIM9型 糖 E.Consiglio,S.Formisano,P.Arvan,Foldingof タ ンパ ク 質 との 相 互 作 用 に お い て 、 糖 鎖 部 分 だ けで は な thyroglobulininthecalnexin/calreticulinpathwayandits く、 ア グ リコ ン部 分 の 疎 水 性 度 を識 別 す る こ とが 示 され alterationbylossofCa2+fromtheendoplasmicreticulum, た。 Biochem.J.370(2003)449-458. 本研 究 に よ り、CRTとGIM9型 11.L.Mancino,S.M.Rizvi,PELapinski,M.Raghavan, 糖 タ ンパ ク質 との 相 互 作 用 に お け るア グ リコ ン認 識 に つ い て 新 た な 知 見 を加 え CalreticulinrecognizesmisfbldedHLA-A2heavychains, る こ とが で き た。 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(2002)5931-5936. 一22一 成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告 12.YSaito,YIhara,M.R.Leach,M.F.Cohen-Doyle,D.B. Williams,Calreticulinfunctionsinvitroasamolecular chaperonef()rbothglycosylatedandnon-glycosylated proteins,EMBOJ.18(1999)6718-6729. 13.M.F.Pelletier,A.Marcil,G.Sevigny,C.A.Jakob,D.C. Tessier,EChevet,R.Menard,J.J.Bergeron,D.Y Thomas,TheheterodimericstructureofglucosidaseIIis requiredfbritsactivity,solubility,andlocalizationinvivo, Glycobiology10(2000)815-827. 14.K.Totani,YIhara,1.Matsuo,YIto,Substratespecificity analysisofendoplasmicreticulumglucosidaseIIusing synthetichighmannose-typeglycans,J.Biol.Chem.281 (2006)31502-31508. 15.U.B.Ericsson,B.M.Hallberg,G.T.Detitta,N.Dekker, P.Nordlund,Thermofluor-basedhigh-throughputstability optimizationofproteinsf()rstructuralstudies,AnaL Biochem.357(2006)289-298. 16.YLiang,Applicationofisothe㎜altitrationcalorimetry inproteinscience,ActaBiochim.Biophys.Sin.40(2008) 565-576. 17.P.LKastritis,A.M.J.J.Bonvin,Onthebindingaffinity ofmacromolecularinteractions:daringtoaskwhy proteinsinteract,J.R.Soc.Interface10(2013)20120835. 18.N.Gao,M.A.Lehrman,Altemativeandsourcesof reagentsandsupPliesoff【uorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis(FACE),Glycobiologyl3 (2003)lG-3G. 一23一 Vol.52No.2(2015.12)
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