エクスプレス プラスミド プラス キット FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit TM 用途：ハイコピー／ローコピープラスミド DNA の精製 （トランスフェクショングレード） FG-90102P（2 preps） FG-90202P（10 preps） FG-90302P（25 preps） 保管条件：室温 (15-25℃) で保管してください。 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit は、研究目的での使用に限られます。 2015 FEB/Rev.00.2 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 目次 安全にご使用いただくために ................................................................................................................ 2 コンポーネント ........................................................................................................................................ 3 保管と準備 ............................................................................................................................................... 3 概要 .......................................................................................................................................................... 4 キットの仕様 ............................................................................................................................................ 4 参考文献 ................................................................................................................................................... 4 プロトコル ........................................................................................................................................ 5−7 トラブルシューティング .................................................................................................................. 8−9 ご注文情報 ............................................................................................................................................. 10 お問い合わせ ........................................................................................................................................ 10 安全にご使用いただくために Ⅰ）取扱い上の注意 • • • • • 本製品は研究用です。診断用・治療用にはご使用にならないでください。 本キットの使用に際しては、実験に適した白衣、使い捨てグローブ、保護ゴーグルを着用してください。 使用期限の過ぎたキットは使わないでください。 バッファーやカラムなど、複数のロットを組み合わせて使用しないでください。 溶解バッファーPX2には、水酸化ナトリウム等が含まれています。これらのバッファーが皮膚、眼、粘膜に付着 しないようご注意ください。万一付着した場合には、すぐに大量の水で洗い流して医療機関で適切な処置を 受けてください。また、試薬をこぼした場合には、水で薄めてから拭き取ってください。 FastGene TM Xpress Plasmid PLUS Kitの以下のコンポーネントには、下記の物質が含まれております。 溶解バッファーPX2 水酸化ナトリウムを含みます：刺激物 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含みます：刺激物 RNase A リボヌクレアーゼを含みます：刺激物 Ⅱ）実験室での操作方法 • すべてのサンプル及び廃棄物は感染性のあるものとして、研究室の安全対策に沿って取り扱ってください。取 り扱う方は溶解バッファー処理により病原性の不活性化を最大限に行い、各自治体が定める安全規制に従い 適切な措置をとってください。日本ジェネティクス株式会社は、溶解バッファーで処理されたサンプルが完全 に不活性及び非感染性であることを保証致しません。感染性の疑いのあるサンプルを取り扱った場合は、サ ンプルの処理が完了後、使い捨てプラスチック器具をすべてオートクレーブ滅菌して廃棄してください。 • 実験室の作業区域での飲食や喫煙は避けてください。 • サンプルや試薬を扱う際は、使い捨ての保護手袋、白衣、ゴーグルを着用してください。 • バクテリア、ウイルス、リボヌクレアーゼを試薬に混入させないでください。試薬ボトルから試薬を分注する 際は、DNase/RNaseフリー、パイロジェン/エンドトキシンフリーの使い捨てピペットとチップを使用して ください。 • 文献に記載されている一般的な注意事項に従ってください。 • サンプルや試薬の使用後は、手を十分洗ってください。 2 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit コンポーネント FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit デブリ除去フィルター入りXPカラム FG-90102P 2 preps/kit FG-90202P 10 preps/kit FG-90302P 25 preps/kit 2本 10本 25本 再懸濁バッファーPX1 25ml×1 110ml×1 140ml×2 溶解バッファーPX2 25ml×1 110ml×1 140ml×2 中和バッファーPX3 25ml×1 110ml×1 140ml×2 平衡化バッファーPEQ 65ml×1 200ml×1 130ml×1 200ml×4 洗浄バッファーPW 35ml×1 200ml×1 210ml×2 溶出バッファーPE 25ml×1 110ml×1 140ml×2 ※ 14mg×1 14mg×2 RNaseA（凍結乾燥） ※「2preps」キットでは、RNaseA は溶液 50μl（100mg/ml）でのご提供となります。 キットに含まれないアイテム 試 薬 イソプロパノール（室温） 70 % エタノール（室温） DNA の再溶解用バッファー（TE バッファー、滅菌蒸留水等） 消耗品 50ml 遠心チューブ ディスポーザブルピペットチップ 保管と準備 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit は、室温 (15-25℃) にて湿気を避けて保管してく ださい。この条件でキットを保管した場合、最長 12 カ月間は性能と品質が落ちることなく安 定性が保たれます。 • 1ml の再懸濁バッファー PX1 を RNaseA（凍結乾燥）のバイアルに添加し、RNaseA を完 全に溶解してください。 RNaseA を溶解した 1ml のバッファー PX1 を、再びバッファー PX1 のボトルに全量移して（戻 して）、十分に撹拌してください。 ＊FG-90102（2prep 入りキット）では、RNase A 溶液を再懸濁バッファー PX1 のボトル にそのまま添加してください。 RNaseA添加済みの再懸濁バッファーPX1は、必ず4℃で保存してください。 （約 6 か月間はご使用いただけます。） • バッファーを使用する前には、沈殿の有無を確認し、必要に応じて 37℃で再溶解してください。 （使用時は室温に戻してください。） 3 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 概要 本キットは、プレパック陰イオン交換樹脂カラムを用いて 100 ∼ 500ml の大腸菌培養液サンプ ルから高純度プラスミド DNA を精製するためのキットです。まず、RNaseA を含む改変アルカ リ溶菌法に基づく処理により、ゲノム DNA と RNA が極力混入しないようなバクテリアの菌体溶 解液（ライセート）を調製します。プラスミド DNA をカラムに結合させて、洗浄バッファーで不 純物を洗い流します。最後に、高塩濃度バッファーを添加して精製プラスミド DNA を溶出し、さ らにイソプロパノール沈殿を行って濃縮とバッファー交換します。約 80 分で完了するこの一連 の操作により、トランスフェクション、シークエンシング反応、PCR、in vitro 転写などの用途に 適した高純度プラスミド DNA を抽出できます。 キットの仕様 フォーマット 陰イオン交換カラム カラム結合容量 約1000μｇ（ハイコピープラスミド, pEGFP / DH5α） 標準サンプル量 ハイコピープラスミド：培養液150∼250ml（LB培地, ODV400） ローコピープラスミド：培養液300∼500ml（LB培地, ODV800） 標準操作時間 約70∼80分間 (ODV400, pEGFP / DH5α) 一般的な収量 ハイコピープラスミド：500∼1000μｇ （LB培地, 400 ODV, pEGFP / DH5α) ローコピープラスミド：30∼100μｇ （LB培地, 800 ODV, pBR322 / HB101) ※カッコ内は検証条件 参考文献 1. Birnboim,H.C.,andDoly,J.(1979)Nucleic AcidsRes.7,1513. 4 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit プロトコル 推奨される培養液容量 本キットは、大きな結合容量を特長としますため、その性能を最大限に引き出すためには、 下記の推奨培養液量でご使用いただくことをお勧めします。 推奨培養液量（ml）＝推奨ODV（下記参照）÷OD600値 推奨 ODV OD600 = 1.6の場合 OD600 = 2の場合 ハイコピー 400 250 ml 200 ml ローコピー * 800** 500 ml 400 ml ＊ ローコピープラスミド用プロトコルは、別途、追加バッファーが必要です。 10ページの「ご注文情報」をご確認ください。 ＊＊ 50mlチューブ2本に分けて、ODV400ｘ2として、半量ずつの溶菌操作（ステップ7まで）を 実施すると便利です。 この場合、溶菌操作時のバッファー量は“ハイコピー”×2チューブでご使用ください。 2本に分けたライセートは、同一のデブリ除去フィルター付きカラムにロードしてください （ステップ8 ∼ 9）。 集菌 1. バクテリア培養液を 6,000 xg、4℃で 15 分間遠心分離し、集菌します。上清をすべて 除去します。上清を除去したら、ボルテックスによりペレットをほぐしておきます。 再懸濁（再懸濁バッファー PX1） 2. RNase A を加えた再懸濁バッファー PX1 を添加し、ボルテックスにかけるかピペッティ ングにより、細胞ペレットを再懸濁します。ライト等で透かしてペレットの塊がなくなるま で懸濁してください。 ハイコピー 10ml ローコピー 20ml 溶菌（溶解バッファー PX2） 3. 溶解バッファーPX2を添加し、チューブを6∼10回反転させて溶液が均一になるように静 かに混ぜ合わせます。プラスミドDNAのせん断やゲノムDNAの混入を防ぐため、ボルテッ クスにはかけないでください。 4. 室温で5分間、ライセートが透明になるまで静置します。5分間以上の静置はしないでくだ さい。 ハイコピー 10ml ローコピー 20ml 5 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 平衡化（平衡化バッファー PEQ） 5. XPカラムをラック（別売品：10ページ参照）又は50 ml遠心管（本製品には含まれません） にのせます。 6. 平衡化バッファー PEQをフィルターの端から全体に 染み渡るように加えてXPカラムを平衡化し、XPカラ ムが自然に空になるのを待ちます。 ハイコピー 20ml ローコピー 20ml 中和（中和バッファー PX3） 7. 中和バッファー PX3を添加し、すぐにチューブを6 ∼ 10回反転させて混ぜ合わせます。 ボルテックスにはかけないでください。室温で5分間インキュベートします。 ハイコピー 10ml ローコピー 20ml 清澄化及びロード（DNA 結合） 8. フィルターの目詰まりを防ぐため、チューブを3回反転させてライセートのデブリの塊を細 かくしてから、平衡化済みのデブリ除去フィルターにロードします。 9. ライセートはデブリ除去フィルターで清澄化されると同時にXPカラムにロードされます。 カラムフィルターとカラムの洗浄（平衡化バッファー PEQ） 10. ライセートが全てXPカラムを流れ出たら、平衡化バッファー PEQ（注：バッファー PWで はありません）でデブリ除去フィルターとXPカラムを洗浄してください。 注）平衡化バッファー PEQ をフィルターの端から全 体に加え、フィルター内に残ったライセートを洗 浄してください。 ハイコピー 10ml ローコピー 10ml デブリ除去フィルターの廃棄 11. 平衡化バッファー PEQがXPカラムを流れ出たら、フィルターを除去し、廃棄してください。 カラムから流れ出たバッファーも廃棄してください。 ＊純度低下を防ぐため、必ずフィルターを外してから洗浄バッファー PWを加えてください。 XP カラムの洗浄（洗浄バッファー PW） 12. XPカラムに洗浄バッファー PWを加えて洗浄し、XPカラムから洗浄バッファー PWが自 然に流れ出るのを待ちます。 カラムから流れ出たバッファーを廃棄してください。 ハイコピー 15ml 6 ローコピー 15ml FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 溶出（溶出バッファー PE） 13. XPカラムを新しい50 ml遠心管（本製品には含まれません）にセットします。溶出バッ ファー PEをカラムに加えてプラスミドDNAを溶出させます。 ハイコピー 10ml ローコピー 10ml ＊溶出後に溶出バッファー PE でブランクを調整し、DNA 収量を測定してください。 沈殿 14. 溶出バッファー PE 10mlに対し、室温のイソプロパノール7.5ml（0.75倍量）を加えます。 15. 遠心管を15回反転させるかボルテックスにかけて十分に混ぜ合わせ、2分間静置します。 16. 15,000* xg、4℃で30分間遠心分離し、慎重に上清を除去します。 *10,000∼15,000ｘｇで遠心する場合、遠心時間を（30）∼60分間に適宜延長してください。 DNA ペレットの洗浄及び乾燥 17. 室温の70%エタノール5 mlを加えてペレットを洗浄します。 18. 15,000* xg、4℃で10分間遠心分離後、慎重に上清を除去します。 19. ペレットを室温で10分間乾燥させます。 ペレットが乾燥しすぎると、再溶解し難くなりますのでご注意ください。 *10,000∼15,000ｘｇで遠心する場合、遠心時間を（10）∼20分間に適宜延長してください。 DNA の再溶解 20. DNAペレットを適量のTEバッファー（本製品には含まれません）または滅菌蒸留水に溶 解します。 * 極わずかにシリカレジンが混入する場合があります。 9ページのトラブルシューティング 9-（4）「カラムのシリカレジンが混入している。」をご参照ください。 21. チューブの形状により、優しくピペッティングしながら撹拌するか、十分量の溶液を添加し た上で、3Dシェーカーで10-60分間撹拌してください。 22. 再溶解の後に、分光光度計などでプラスミドDNA量を測定してください。また、アガロー スゲル電気泳動などでプラスミドDNAの品質をご確認ください。 フロー図 細胞培養 培養 集菌 アルカリ溶菌 再懸濁 溶菌 中和 自然流下 カラム平衡化 DNA結合 自然流下 洗浄 溶出 DNA沈殿 イソプロパノール沈殿 再溶解 7 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit トラブルシューティング 問題 可能性のある原因 対応方法 1. （1）プラスミドDNA自体 が増 ・念のために異なる菌種・菌株がコンタミネーションしていな プラスミドDNA 幅していない。異なる菌株 いかご確認ください。 の収量が少な がコンタミネーションして ・新たにピックアップした大 腸菌を用い、適切な抗生物質を加 い。あ る い は 得 いる。 えた新鮮な培地で増殖した培養液をご使用ください。 られない。 （2）菌体量過剰、あるいは他の ・プロトコールの推奨の培養液量どおりに使用されているかご 要 因 で アルカリ溶 菌 が 不 確認ください。 （ライセートの粘性が高すぎる場合も、菌体量 十分となっている。 が過剰な可能性があります。） ・再懸濁バッファー PX1添加後に、菌体ペレットの塊がなくな るまで十分に懸濁されているかご確認ください。 ・ご使用前に、溶解バッファー PX2のボトル底にSDSの沈殿が 見られていないかご確認ください。沈殿が見られる場合、バッ ファー PX2のボトルを30 ∼ 40℃で数分間インキュベート し、再溶解ください。 ・中和バッファー PX3添加後、SDS/ゲノムDNAの析出が見ら れているかご確認ください。 （溶 菌し過ぎ などでゲノムDNA がライセートに混入すると、カラムの結合容量が減り、収量が 低下します。） （3）イソプロパノール沈 殿/エ ・「7.イソプロパノール沈殿/エタノール洗浄 後にペレットが見 タノール洗浄中にロスをし られない。」の項目をご参照ください。 ている。 2. デブリ除去フィ ルターが詰ま る。 3. XPカラムが詰 まる。あるいは 流速が遅い。 （1）菌体量 過 剰となっている。 ・プロトコールの推奨の培養液量どおりに使用されているかご 確認ください。 （ライセートの粘性が高すぎる場合も、菌体量 が過剰な可能性があります。） （2）ライセート の 再 懸 濁 が 不 ・ライセートをロードする前にチューブを3回反転させて、デブ 十分となっている。 リの塊を細かくしてください。 （1）菌体量過剰、あるいは他の ・プロトコールの推奨の培養液量どおりに使用されているかご 要 因 で アルカリ溶 菌 が 不 確認ください。 （ライセートの粘性が高すぎる場合も、菌体量 十分となっている。 が過剰な可能性があります。） ・再懸濁バッファー PX1添加後に、菌体ペレットの塊がなくな るまで十分に懸濁されているかご確認ください。 ・ご使 用前に、溶 解バッファー PX2にSDSの沈殿が見られて いないかご確認ください。沈殿が見られる場合、30 ∼ 40℃ で数分間インキュベートし、再溶解ください。 ・中和バッファー PX3添加後、SDS/ゲノムDNAの析出が見ら れているかご確認ください。 （溶 菌し過ぎ などでゲノムDNA がライセートに混入すると、カラムの結合容量が減り、収量が 低下します。） （2）ライセート の 再 懸 濁 が 不 ・ライセートをロードする前にチューブを3回反転させて、デブ 十分となっている。 リの塊を細かくしてください。 4. ゲノムDNAが混 入している。 （1）溶菌が過剰となっている。 ・溶解バッファー PX2添加後、反転混合し過ぎないように（6 ∼ 10回まで）、また、5分間以上インキュベートしないようご 注意ください。 ・溶解バッファー PX2添加後、および中和バッファー PX3添加 後にボルテックスにかけないようにご注意ください。 5. （1）RNaseAに よる分 解 が 不 ・RNaseAが適切に再懸濁バッファー PX1に添加されているか（間 違って他のバッファーに添加されていないか）、ご確認ください。 RNAが混入して 十分になっている。 ・RNaseAを添 加したはバッファー PX1は、4℃で6か月使 用 いる。 可能です。保存温度、保存期間をご確認ください。 （2）洗 浄が 不十 分 に なって い ・各洗浄ステップに使用するバッファーの種類（PEQとPWの２ ステップがあります。）、およびバッファー量をご確認ください。 る。 8 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 問題 6. 純度が低い。 （A260/A280 ＜1.8） 可能性のある原因 対応方法 （1）デ ブリ除 去フィル ターが 適 ・デブリ除去フィルターは、必ず2回目の「洗浄バッファー PW による洗浄」の前にカラムから除去してください。 切に除去されていない。 （2）洗浄バッファーの種類を間 ・1回目の洗浄は平衡化バッファー PEQ、2回目の洗浄は洗浄 違えている。 バッファー PWを使用しますので、ご注意ください。 （3）プラスミドDNAの 量 がカ ・適切なサンプル（培養液）量を使用してください。サンプル量 ラムの 結 合 容 量 に 対して が 少な過ぎると、A260/A280の 値 が低くなる可能 性 があ 少なすぎる。 ります。 7. （1）適切に沈殿されていない。 ・必ず室温（冷却されていない）のイソプロパノールをご使用くだ さい。また、添加量が0.75倍となっているか、ご確認ください。 イソプロパノー ・イソプロパノールの添加後の遠心条件をご検討ください。 （時 ル沈殿/エタノー 間を30分から延 長するか、遠 心力を15,000×ｇより高して ル洗浄後にペ ください。） レットが見られ ない。 （2）イソプロパノール沈 殿/エ ・操作によるロスかどうかご判断いただくために、カラムから タノール洗浄操作中にロス の 溶 出 後（イソプ ロパノール沈 殿/エタノール洗 浄 の前）に をしている。 DNA量を測定しておくことをお勧めいたします。 （3）ペレットが広がって見え難 ・念のために、3Dシェーカー等を用いてチューブ壁全体にバッ くなっている。 ファーが行き渡るように再溶解してください。 （詳細はプロト コールをご確認ください。） 8. ペレットの色が 白濁している。 （1）溶 出 バッファー 由 来 の 塩 ・必ず室温（冷却されていない）のイソプロパノールをご使 用 が析出している。 ください。また、添加量が0.75倍となっているか、ご確認くだ さい。 冷却したイソプロパノールを添加したり過剰量を添 加した場合、塩が析出します。 ・カラムから溶出バッファー PEで溶出する時に、直接イソプロパ ノール中へ滴下しないでください。この場合、塩が析出します。 9. DNA ペレット がバッファーに 再溶解できな い。 （1）ペ レットが 過 乾 燥して い ・加温して時間をかけて再溶 解してください。 （例：37℃ 2時 る。 間や室温オーバーナイト、等）できれば振とうしながら再溶解 してください。 （3Dシェーカー等） （2）溶 出 バッファー 由 来 の 塩 ・イソプロパノール沈殿で塩が析出した場合は、除去が非常に が析出している。 困難です。再溶解で用いたバッファーを増やして溶解してくだ さい。必要に応じて加温も試してください。 （3）イソプ ロ パ ノール 沈 殿 の ・再溶解で用いたバッファーを増やして溶解してください。必要 エ タノー ル が 残 留して い に応じて加温も試してください。 る。 （4）カラムのシリカレジンが混 ・溶 解 し たDNA溶 液 か らシ リカレ ジ ン を 取り 除 く た め に、 入している。 15,000×g, 4℃, 10min程 度 遠 心 分 離して上 清 を 新し い チューブに移してください。 10. プラスミド精製 後の実験が上手 く行かない。 （1）プラスミドDNAにゲノムDNA ・前述のゲノムDNA混入（4.）またはRNA混入（5.）の項目を 参照ください。 またはRNAが混入している。 （2）プラスミドDNA溶 液にア ・再溶解前のプラスミドDNAが十分に乾燥されていなかった。 ルコールが混入している。 1/10量の3M NaAc pH5.0と0.7倍量のイソプロパノール を加え再度イソプロパノール沈殿をやり直してください。 （3）プ ラスミドDNAが 劣化し ・ご使用中の器具（ピペットチップ、チューブ、等）を全てヌクレ ている。 アーゼ・フリーとなるようにしてください。 ・アルカリ溶解時のPX2バッファーのインキュベーション時間 が5分を超えないようにしてください。 ・大腸菌培養液は適切な培養時間のものを使用してください。 培養後長時間保管したものは使用しないでください。 9 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit ご注文情報 キットおよびオプション 商品名 カタログナンバー FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit（2 preps） FG-90102P FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit（10 preps） FG-90202P FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit（25 preps） FG-90302P FastGene™ Xpress Plasmid Buffer Set（10prep 分）＊ FG-90002 FastGene™ Xpress Plasmid Column Rack(8 カラム用 ) FG-90001 ＊ローコピープラスミド用追加バッファーセット（梱包内容は下記のとおりです。） Resuspension Buffer PX1 110 ml×1, Neutralization Buffer PX3 110 ml×1, Lysis Buffer PX2 110 ml×1 RNase A（凍結乾燥）14 mg×1 関連製品 商品名 カタログナンバー FastGene™ ゲル /PCR 抽出キット（100 preps） FG-91202 FastGene™ ゲル /PCR 抽出キット（300 preps） FG-91302 FastGene™ ゲルバンドカッター（50 本） FG-830 FastGene™ プラスミドミニキット（100 preps） FG-90402 FastGene™ プラスミドミニキット（300 preps） FG-90502 FastGene™ ダイターミネーター除去キット（50 preps） FG-9411 LB 培地カプセル（100 個） NE-L2720-100 お問い合わせ 日本ジェネティクス株式会社 【本 社】 〒112-0004 東京都文京区後楽1丁目4番14号 後楽森ビル18階 TEL：03-3813-0961 FAX：03-3813-0962 【西日本営業所】 〒604-8277 京都市中京区西洞院通御池下ル565番地ラフィーネ御池3階 TEL：075-257-5421 FAX：075-257-5422 より詳しい製品情報、お問い合わせの詳細、ご質問、トラブルシューティングにつきましては、 弊社ウェブサイト（www.n-genetics.com）をご確認ください。 E-mail :[email protected] 10 FastGene™ Xpress Plasmid PLUS Kit 11 FastGene ® は Nippon Genetics Co.,Ltd. の登録商標です。
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