サザンブロット法使用例 - 日立アロカメディカル株式会社

アプリケーションノート AN001
DNA-アルカリホスファターゼ標識システム
サザンブロット法使用例
Labelling ONE DNA-アルカリホスファターゼ標識システムにより作製したプローブを用いて
サザンブロット法の検討を行いました。
ランダムプライマー法にてラベルしたプローブを使用し、マウスゲノムのDNAを確認できま
した。
kbp
23
9.4
6.5
4.3
サンプル：マウスゲノムHind III 消化DNA （5 µg)
マウスゲノムApa I 消化DNA （5 µg)
プローブ： Myostatin CDS配列（約2.6 kbp)
ランダムプライマーラベル
2.3
ハイブリダイゼーション： 55 ℃, オーバーナイト
露光時間： 30 分
2.0
Hind
Hind III消化
III消化：11 kbp と 2.8 kbpのバンドを検出
kbpのバンドを検出
Apa I消化：37 kbp のバンドを検出
プロトコール
■ アルカリホスファターゼ標識プローブの作製
1. グルタミン標識
DNA 合成用試薬グルタミン-ｄUTP、
ｄNTPセット/ALR-101
10× Buffer
熱変性済みテンプレートDNA （0.5～1µg ）
Q-dNTP Mixture1
Random Primer (9 mer)
Exo-free Klenow Fragment
Water
Total
↓37 ℃ 10分間インキュベート
↓65 ℃ 5分間（酵素失活）
↓精製
↓必要量を熱変性
↓アルカリホスファターゼ標識へ
2.5 µL
x µL
2.5 µL
2 µL
1 µL
17-x µL
25 µL
*1: 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, 0.12 mM dTTP, 0.08 mM Q-dUTP
2. アルカリホスファターゼ修飾
熱変性済みグルタミン標識プローブ
10× Buffer
Water
Alkaline phosphatase （8 mg/mL）
TGase （10 U/mL)
Total
↓40 ℃ 2 時間インキュベート
↓ハイブリダイゼーション
20 µL
3 µL
4.5 µL
1 µL
1.5 µL
30 µL
アルカリホスファターゼ標識キット/ALR-103
■ハイブリダイゼーション
①Prehybridization
55℃
30分
②Hybridization
55℃
オーバーナイト
（アルカリホスファターゼ標識プローブを10 µL/5 mLで使用）
③Wash1
55℃
30分 × 2回
④Wash2
55℃
10分 × 2回
⑤発光検出
室温
30分
■試薬組成
・Hybridization buffer：
2 M Urea, 20 mM Phosphate buffer pH6.0, 0.5 M NaCl, 1 mg/mL torula yeast RNA,
1×Denhardt‘s solution, 3% Casein, 4% Dextran sulfate (MW 500,000), 0.1% Triton X-100
・Wash1 buffer：
50 mM Phosphate buffer pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.2% Casein
・Wash2 buffer：
100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 50 mM MgCl2, 0.1% CHAPS
・発光検出：
発光基質, 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 50 mM MgCl2, 1% CHAPS
・Labelling ONEは日立アロカメディカル株式会社の登録商標です。
・Triton は Dow Chemical Company の登録商標です。
〒181-8622 東京都三鷹市牟礼6-22-1
計測システム営業部（0422）-45-5129

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