In Cell ウエスタン解析プロトコール例

In Cell ウエスタンアッセイプロトコール例
固定処理（刺激後）
1.
1×PBS_4%ホルムアルデヒド固定液を先に用意します（室温で置いておきます）
1×PBS
45ml
37% formaldehyde
5ml
Total
50ml
2.
刺激処理に利用した培地をアスピレーターで取り除くか、プレートを逆さまにして捨てます。
3.
マルチチャンネルピペットを用い、150ul の固定液をウエル壁面に沿ってゆっくりと加えます
（細胞の剥離を防ぐためです）。
4.
そのままベンチ上で 20 分置きます。この間に Triton 洗浄液を用意します。
Triton 洗浄液
5.
1×PBS
495ml
10% Triton X-100 溶液
5ml
(final 0.1%)
固定の時間が終了しましたら、固定液を捨て Triton 洗浄液 200μｌをウエル壁面に沿ってゆっく
りと加えます。
6.
シェーカーで振とうしながら 5 分置きます。
7.
時間がきましたらプレートを逆さまにして液を捨て、５．６．の操作を 4 回繰り返します。ウエル
が乾燥しないように、液を捨てましたらすぐに次の溶液を加えます。また、次のステップで利
用する Odyssey Blocking buffer の用意をします。
8.
最後の洗浄が終わりましたら Triton 洗浄液を廃棄し、Odyssey Blocking Buffer 150ul を各ウ
エルに加えます。ウエル壁面に沿ってゆっくり加えます。
9.
室温でシェーカーを利用してゆっくり振とうしながら 90 分置きます。この間に一次抗体溶液を
準備します。
一次抗体溶液は Odyssey Blocking buffer で 1:100 希釈します。
１ウエルあたり 50μｌ必要ですので目安として、
Bloking buffer 50ul×（
抗体溶液
①×0.01=
：ウエル数）＝
ul になります。
ul－①
10. ブロッキング過程が終了後、バッファーを捨てて、サンプルウエルに一次抗体溶液 50ul を加
えます。溶液がウエル底面をカバーしていることを確認してください。コントロールウエル（バ
ックグラウンド）には、Odyssey ブロッキングバッファーを 50ul 加えます。
11. 室温でゆっくり振とうしながら一晩置きます。
12. 1×PBS_0.1% Tween 20 溶液を用意します。
1×PBS
995ml
20% Tween 20 溶液
5ml
(final 0.1%)
13. 一次抗体反応液を取り出し、各ウエルに Tween 20 洗浄液を 200ul 加えます。ウエル壁面に
沿ってゆっくり加えます。
14. シェーカーを使い 5 分間室温で洗浄します。
15. 13．14．のステップを 4 回繰り返します（トータル 5 回洗浄）
16. 洗浄ステップ中に蛍光標識二次抗体溶液の準備をします。Odyssey Blocking buffer に、
IRDye800CW 標識抗体を 800 倍希釈で調製します。
１ウエルあたり 50ul 必要ですので目安として、
Bloking buffer 50ul×（
抗体溶液
①×0.0125=
：ウエル数）＝
ul－①
ul
になります。
17. 16．で調製した二次抗体溶液から、コントロールウエルに加える分を別のチューブに抜き取り
ます。残りの二次抗体溶液に Sapphire700 を 1000 倍希釈になるように加えます。
残りの二次抗体溶液量
ul×0.001=
ul :Sapphier700 量
18. 洗浄作業終了後、Tween 洗浄液を捨てて、サンプルウエルに二次抗体溶液 50ul を各ウエル
に加えます。ウエル壁面に沿って、ゆっくりと加えます。コントロールウエルには、二次抗体だ
けの溶液を加えます。
19. アルミフォイルで遮光して、室温で一時間ゆっくり振とうします。
20. 反応後、抗体溶液を除いて先程も利用した Tween 20 洗浄液を 200ul ずつ各ウエルに加えま
す。このとき、壁面に沿ってゆっくり加えます。遮光して室温でゆっくり振とうしながら 5 分洗浄
します。この操作を残り 4 回（トータル 5 回）行います。
21. 最後の洗浄終了後、洗浄液を捨ててからプレートを逆さまにしてキムタオルなどに軽く叩き、
液を完全に取り除きます。できるだけすぐに Odyssey でスキャンすると良好な結果が得られ
ます（時間が経過するとバックグラウンドが上昇する可能性が高くなります）。

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