Über den Einfluß von Puffergemischen auf die

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Bd. 297 (1954)
Über den Einfluß von Puffergemischen
auf die Trennung von DNP-Aminosäuren
mit Hilfe der Papier Chromatographie
Von
H. Iwainsky*
Aus dem Institut für Lebensmittelchemie und -technologic der Humboldt-Universität zu Berlin und
dem Institut für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften, Abt. Chemische
Krebsforschung, Berlin-Buch
(Der Schriftleitung zugegangen am 24. April 1954)
Bei der Trennung von DNP-Aminosäuren mit Hilfe der Papierchromatographie wird zur Verbesserung des Trenneffektes verschiedentlieh die Pufferung des Filterpapiers mit Puffergemischen von p 61 bzw.
7,752 empfohlen. Angeregt durch eine Arbeit über den Einfluß derartiger Gemische auf die Trennung von Aminosäuren3, woraus sich
besondere Vorteile hinsichtlich Isolierung -und Bestimmung der Hexonbasen ergeben, wurde die Auswirkung des p H- Wertes des Puffers auf die
Trennung der DNP-Aminosäuren bei verschiedenen Lösungsmittelgemischen systematisch untersucht.
Arbeitsweise
Die DNP-Derivate von Cystin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure,
Glykokoll, Alanin,
Valin, Leucin, Phenylalanin und Tyrosin wurden nach E. Abderhalden 4 dargestellt**. Die Untersuchungen wurden mit 1-proz. Lösungen in
Methanol bzw. Eisessig durchgeführt. Wie festgestellt wurde, hat der Wechsel
des Lösungsmittels keinen Einfluß auf die nachfolgende Trennung; die RF-Werte
sind bei Eisessig ganz geringfügig erhöht.
Zur Pufferung des Papieres fanden folgende von MC Farren 3 angegebenen
Gemische Verwendung:
PR 2:
5 ml 0,067-m. KC1 -f 10,66 ml 0,067-m. HC1
PH 6,2:
8 ml 0,067-m. KH2P04 + 2 ml 0,067-m. Na2HP04
pH 8,4: 50 ml 0,067-m. Borsäure und KC1 -f 8,55 ml 0,067-m. NaOH
PH 9,7: 50 ml 0,067-m. Borsäure und KC1 + 38,82 ml 0,067-m. NaOH
PH 10,5: 100 ml 0,02-n. Borsäure, KH2P04 und Phenylessigsäure + 62,4 ml
0,1-rc. NaOH
PH 11,2: 50 ml 0,067-m. Na2HP04 -f 16,5 ml 0,067-m. NaOH
PH 12,0: 50 ml 0,067-m. Na2HP04 -f 50 ml 0,067-m, NaOH.
1
K. Felix u. A. Krekels, diese Z. 290, 78 [1952]. S. Blackburn, Biochem.
J. 48,2 126 [1951].
S. M. Partridge u. T. Swain, Nature [London] 166, 272 [1950].
3
E. F. MC Farren, Analytic Chem. 23, 168 [1951].
4
E. Abderhalden u. P. Blumberg, diese Z. 65, 318 [1910].
* Ich möchte nicht verfehlen, Fräulein R. Eisner und Fräulein J. Müller
für die tatkräftige Hufe bei der Durchführung der Versuche meinen Dank auszusprechen.
** Für die Überlassung von DNP-Serin, - -Aminobuttersäure, -Z-Arginin und
- -Lysin sei Herrn Dr. Grümer, Charite Berlin, auch an dieser Stelle bestens
gedankt.
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Über den Einfluß von Puffergemischen
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Die Papierstreifen wurden damit getränkt und an der Luft getrocknet. Die
DNP-Derivate wurden dann nebeneinander und im Gemisch auf die Startlinie
(aufsteigend 5 cm vom unteren Ende, absteigend 2 cm vom Knick entfernt) aufgetragen und mit dem jeweiligen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Als Filterpapier wurde das „Elektrophorese''-Papier der Fa. Geßner & Kreuzig (jetzt
VEB Spezialpapierfabrik), Niederschlag (Erzgeb.), und die Sorten 2043 a u. b der
Fa. Schleicher & Schüll benutzt. An Stelle des üblichen Wasserzusatzes wurde
bei den Lösungsmittelgemischen die gleiche Menge des jeweiligen Puffers zugefügt.
Folgende Lösungsmittelgemische wurden geprüft:
1. Phenol-Puffer (l : l)3
2. m-Kresol-Puffer (l: l)3 3
3. Butanol-Puffer (l : l)
4. Benzylalkohol-Äthanol- (10:1) (Blackburn 1 ) bzw. BenzylalkoholÄthanol-Puffer (10:1:11)
5. Ti-Butanol-Methylacetat-Isobutylchlorid-Puffer (Felix u. Krekels 1 )
(50 : 30 : 4 : 16)
An Stelle von sek. Butanol verwendeten wir w-Butanol und an Stelle von
Isopropylchlorid Isobutylchlorid.
6. Butanol-Isoamylalkohol-Äthanol-Puffer (20 : 20 : 6,5 : 30).
Einige dieser Gemische sind sehr temperaturempfindlich. Die im
folgenden angegebenen R$-Werte der DNP-Aminosäuren können nur
als relatives Maß gewertet werden, da es uns nicht möglich war, bei
konstanter Temperatur zu arbeiten. Bei aufeinanderfolgenden Ansätzen
wurden mitunter nicht unbeträchtliche Schwankungen festgestellt; die
relative Stellung der einzelnen Komponenten und der Trenneffekt aber
blieben praktisch gleich. Die einzelnen Versuchsreihen wurden unter
gleichen Bedingungen durchgeführt, um gleichzeitig auch andere auf
den J?F-Wert einflußnehmende Faktoren5 auszuschalten.
Ergebnisse
a) Einfluß von Papier und Arbeitsweise
Das verwendete „Elektrophorese*'-Papier ist härter als die Sorte 2043 a der
Fa. Schleicher & Schüll. Das Gewicht beträgt 80 g/m2. Für die Untersuchungen
s'nd be.de Sorten gut geeignet. Die Sorte 2043b ist etwas zu weich. Das Puffern
muß sehr vorsichtig durchgeführt werden; im nassen Zustand reißen die Streifen
leicht. Die Flecken hatten diffuse Ränder.
Im allgemeinen wurden mit der aufsteigenden Arbeitsweise die besten Trennungen erzielt. Der Nachteil dieser Technik, die längere Entwicklungsdauer, wird
durch die bessere Ausbildung der Flecken und durch die etwas niedrigeren ÄF-Werte
bei weitem aufgehoben. Bei absteigender Methodik werden die Flecken oft länglich,
neigen zur Ausbildung von Schwänzen, so daß eine völlige Trennung mitunter
nicht möglich ist.
b) Die Lösungsmittelgemische l bis 3
Bereits die orientierenden Versuche mit den zwei erstgenannten
Gemischen zeigten, daß sie, abgesehen von den bekannten Nachteilen
(Verfärbung, diffuse Flecken, lange Laufzeit), zur Trennung ungeeignet
sind. Der Einfluß des p H- Wertes des Puffers auf den hier sehr hohen
J?F-Wert der DNP-Aminosäuren macht sich in charakteristischer Weise
bemerkbar, und zwar dergestalt, daß im pn-Bereich um 10,5 ein gewisser
5
G. Zimmermann, Z. analyt. Chem. 138, 322 [1953].
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H. Iwainsky
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Trenneffekt zu erzielen ist. Beim Gemisch 2 wurden z. B. folgende
.ftp-Werte ermittelt: bei pn unter 6 DNP-Asparagin (I) ~ l, DNPLeucin (II) ~ 1; bei p* 9,7 I 0,67, II 0,90; bei pn 10,5 I 0,44, II 0,76;
sie steigen dann bei höheren p H- Werten wieder an.
Die mit dem Gemisch Butanol-Puffer erzielte Trennwirkung ist
etwa die gleiche. Die R-p-Werte unterscheiden sich wenig. Trotz seiner
Vorteile — kürzere Laufzeit und bessere Ausbildung der Flecken — ist
es nicht brauchbar.
c) Lösungsmittelgemisch 4
Tab. l zeigt den Einfluß des p H- Wertes des Puffers auf die B$- Werte
einiger DNP-Derivate.
Tab. 1. Rf -Werte von DNP-Aminosäuren in Abhängigkeit vom pH-Wert
des Puffers
(Benzylalkohol-Äthanol 10 : l, J )
DNP- Aminosäuren
DNP-Asparagin
DNP-Serin
. .
DNP-Glykokoll
DNP-Alanin
DNP-a-Aminobuttersäure
DNP-Valin
DNP-Leucin
DNP-Phenylalanin
DNP-e-Lysin
TOsTP-Arginin
DNP-Histidin
PR -Wert des Puf fers
2
0,92
0,89
0,93
0,93
0,95
0,96
0,47
0,42
Schwanz
6,2
10,5
0,13
0,32
0,40
0,59
0,74
0,77
0,87
0,75
0,32
0,29
Schwanz
0,08
0,17
0,31
0,47
0,63
0,67
0,83
0,73
0,19
0,23
Schwanz
Danach müßten vor allem im ^ -Bereich von 6—11 gute Trennungen durchführbar sein. Auf dem von uns benutzten Papier waren
jedoch die Hecken immer außerordentlich lang (4 cm u. mehr). Eine
Trennung war somit nicht möglich.
Zur Beseitigung der vorgenannten Störungen wurde das Gemisch
mit der gleichen Menge des jeweiligen Puffers versetzt (BenzylalkoholÄthanol-Puffer, 10: l: 11) und mit der organischen Phase chromatographiert.
Die Flecken sind nach dieser Abwandlung der Technik weit besser
ausgebildet und die erzielten E^-Werte etwas niedriger; der für eine
Trennung günstigste pn-Bereich liegt zwischen 9 bis 11.
d) Lösungsmittelgemisch 5
Bei diesem System liegen die für eine Trennung günstigeren Jßi·Werte in einem Pufferbereich von pm 6 bzw. 9,7—11,2 (s. Tab. 2). Bei
Verwendung von aqua dest. bzw. 0,5-^. HC1 (Felix u. Krekels 1 ) sind
die ÄF-Werte etwas höher, als sie in Tab. 2, Spalte 2 (pn 6,2) angegeben
sind.
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Über den Einfluß von Puffergemischen
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Tab. 2. J?F-Werte von DNP-Aminosäuren in Abhängigkeit vom pH-Wert
des Puffers
(Butanol-Methylacetat-Isobutylchlorid-Puffer, 50: 30: 4:16, j )
DNP- Aminosäure
DNP-Asparagin
DNP-Asparaginsäure . . .
DNP- Glutaminsäure . . .
DNP-Cvstin
. .
DNP-Serin
DNP-Glykokoll . . . .
DNP-Alanin
DNP-a-Aminobuttersaure .
DNP-Valin . . . . . . .
DNP-Leucin
DNP-Phenylalanin. . . .
DNP-e-Lysin
DNP-Arginin
2
0,62
0,78
0,85
0,84
0,73
0,78
0,84
0,88
0,89
0,91
0,88
0,42
0,45
2?fl-Wert c Les Puffers
6,2
8,4
0,1
0,23
0,63
0,14
0,25
0,30
0,54
0,67
0,73
0,89
0,71
0,11
0,13
0,17
0,20
0,48
0,13
0,29
0,33
0,64
0,70
0,78
0,88
0,79
0,18
0,21
10,5
12 '
,0,12
0,09
0,25
0,08
0,26
0,26
0,45
0,55
0,57
0,75
0,61
0,19
0,21
0,11
0,07
0,24
0,12
0,23
0,23
0,49
0,56
0,61
0,80
0,64
0,20
0,20
e) Gemisch Butanol-Isoamylalkohol-Äthanol-Puffer, 20:20:
6,5:30
Die Beschaffung der für die Gemische 4 und 5 notwendigen Ausgangsstoffe war für uns schwierig. Es wurde daher versucht, das Gemisch
Butanol-Isoamylalkohol-Äthanol-Puffer (20 : 20 : 6,5 : 30) heranzuziehen.
Dieses Gemisch hatte sich wegen seines ausgezeichneten Trenneffektes
bei Untersuchungen bewährt, bei denen eine nachträgliche Einwirkung
von Säure oder Alkali bzw. Ammoniak auf Aminosäuren und Kohlenhydrate mit Sicherheit auszuschließen ist. Das Ergebnis der Versuche
zeigt Tab. 3.
Tab. 3. jßp-Werte von DNP- Aminosäuren in Abhängigkeit vom p^
des Puffers
(Butanol-Isoamylalkohol-Äthanol-Puffer, 20 : 20 : 6,5 : 30, t )
DNP- Aminosäure
2
6,2
DNP-Asparagin
DNP- Glutaminsäure . . .
DNP-Cystin
DNP-Serin .
DNP-Glykokoll . . . .
DNP-Alanin
DNP-a-Aminobuttersäure .
DNP-Valin
DNP-Leucin
DNP-Phenylalanin. . . .
DNP-Tyrosin
DNP-e-Lysin
DNP-Arginin
0,75
0,90
0,95
0,72
0,83
0,88
0,83
0,88
0,88
0,82
0,95
0,35
0,45
0,20
0,16
0,09
0,19
0,32
0,52
0,47
0,63
0,70
0,57
0,61
0,21
0,21
Wert des I'uffers
10,5
9,7
11,2
0,09
0,04
0,02
0,11
0,18
0,31
0,34
0,41
0,55
0,48
0,39
0,20
0,27
0,19
0,02
0,06
0,14
0,30
0,50
0,40
0,57
0,72
0,51
0,45
0,20
0,26
0,08
0,05
0,03
0,10
0,20
0,34
0,31
0,42
0,56
0,44
0,42
0,18
0,23
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Über den Einfluß von Paffergemischen
Bd. 297 (1954)
Die jßF-Werte sind von der Puffermenge bei
10,5 weitgehend
unabhängig. Durch den Zusatz von 10 ml Puffer wird bereits eine gute
Trennung erzielt; sehr günstig ist die saubere Abtrennung aller störenden
Nebenprodukte in einem scharfen Band an der Lösungsmittelfront.
Aus den Versuchsreihen ergibt sich, daß bei Anwendung von Puffergemischen der ^ -Bereich von 9—11 für den Trenneffekt am günstigsten
ist. Bei den z. Tl. sehr niedrigen J?F-Werten sind u. U. auch Durchlaufchromatogramme möglich bzw. ist die Methode der mehrfachen Entwicklung anwendbar.
Das letztgenannte Lösungsmittelgemisch eignet sich gut für die
Trennung der DNP-Derivate und hat Vorteile, die seinen Gebrauch
empfehlen, z. B. gute Ausbildung der Flecken, leichte Beschaffung der
benötigten Lösungsmittel, rasches Arbeiten und gute Abtrennung der
Nebenprodukte.
Herrn Prof. Dr. K. Täufel und Herrn H. Bothe bin ich für förderndes
Interesse und stetes Entgegenkommen zu Dank verpflichtet.
Zusammenfassung
1. Der Einfluß von verschiedenen Puffergemischen auf die papierehrornatographische Trennung von DNP-Aminosäuren Avird bei mehreren
Lösungsmittelgemischen studiert. Es wird vorgeschlagen, in einem
Bereich von 9—11 zu arbeiten.
2. Als neues geeignetes Lösungsmittelgemisch wird das Gemisch
Butanol-Isoamylalkohol-Äthanol-Puffer (20 : 20 : 6,5 : 30 bzw. 10) empfohlen.
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