1 - 科学技術振興機構

薬剤標的の内訳
膜タンパク質：主要な薬剤標的
その他
7%
酵素
9%
水溶性タンパク質
23%
膜タンパク質
膜輸送体
70%
24%
受容体
67%
Rask-Andersen et al., Nat Rev Drug Disc (2011)
特に膜輸送体は近年注目される薬剤標的
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膜輸送体を標的とした創薬にむけて
超高感度, 定量的かつハイスループットな
膜輸送体の機能解析が必要
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従来の手法で定量的に
機能計測できない膜輸送体
長年にわたり、超高感度, 定量的かつ汎用的な
膜輸送体の機能解析手法の開発が望まれていた
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超高感度かつ定量的な
膜輸送体の機能計測にむけて
 高効率に安定な生体膜を
人工的に量産できる技術の開発
半導体製造プロセスを利用して
生体膜の形成技術を洗練化させた
 膜輸送の超高感度検出方法の開発
微小な試験管, 均一な生体膜, 新しい指示薬を
自主開発し、活性検出技術を超高感度化させた
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半導体製造装置を使って
人工生体膜チップを開発
Watanabe et al., Nat Commun (2014)
Watanabe et al., Sci Rep (2014)
 半導体製造プロセスにより微小な試験管を作成
 微小な試験管を10万個以上集積化
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チップを利用した生体膜の形成方法
試験管の入口に生体膜を形成
1, 水溶液を導入
2, 脂質入り有機溶媒を導入
3, 再度水溶液を導入
 簡単な溶液交換のみで脂質2重膜の
集積アレイを作成できる。(特願2013-171493)
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生体膜の形成効率：99~ %
本技術で改善したこと
1, 生体膜の形成効率の大幅な向上
 本手法：> 99 %, 従来法：< 30 %
2, 生体膜の量産枚数 (1分あたり)
 本手法：10万枚以上, 従来法：100枚以下
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生体膜マイクロチップを利用した
膜輸送体の超高感度機能計測
生体膜マイクロチップ
Watanabe et al., Nat Commun (2014)
Watanabe et al., Sci Rep (2014)
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超高感度化, 高定量化に求められる
計測システムの仕様
 膜輸送体と相性のよい生体膜の作成
膜輸送体と相性のよい薄い生体膜の
形成技術の開発 (特願2013-171493)
 微小試験管の容積の最小化
容積がaLの微小試験管の開発
 膜輸送体の駆動力の定量的な制御
膜電位の制御システムの開発
(特願2015-116045)
 蛍光指示薬の生体膜透過性を削減
非透過性蛍光指示薬の開発
(特願2015-202821)
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膜輸送体と相性のよい生体膜の作成
従来の溶媒膜を作成するとき
残留する
有機溶媒
使用する有機溶媒
デカン、ヘキサデカン
技術的な課題
有機溶媒が膜内に残留
• 薄膜化に時間がかかる
• 十分な薄膜化ができない
• 膜輸送体との相性が悪い
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膜輸送体と相性のよい生体膜の作成
本開発技術で生体膜を作成するとき
(特願2013-171493)
使用できる有機溶媒
技術的な利点
クロロホルム
デカン
ヘキサデカン
スクワレン
クロロホルムを利用すると
• 薄膜化が速い(20分以下)
• 十分な薄膜化が可能
• 膜輸送体との相性が良い
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試験管の容積の小型化
超小型生体膜マイクロチップの開発(容量: aL)
φ
3.4m
480nm
120nm
30nm
Soga & Watanabe, Sci Rep (2015)
世界最小の容積(aL)をもつ生体膜マイクロチップ
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試験管の小型化のメリット
微弱な輸送活性を超高感度に検出
小さい試験管は輸送基質の濃度変化を
能動輸送体の平均活性
100 s-1
劇的に大きくすることができる
1分子の膜輸送体であっても
1000秒程度で1 Mの基質濃度変化が可能になる
1 fL = 10-15 L = 1 m3
蛍光指示薬(一般的なK
は1 M程度)を利用すれば、
濃度変化
容積
反応時間
d生成物
1 膜輸送体の活性を試験管内の基質の濃度変化として
M x 1 mL = ~1015個 = 1013秒 (30万年)
超高感度に検出できる。
1 M
x
10 fL = ~103 個 = 1000秒
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膜輸送体の駆動力の定量的な制御
膜電位の定量制御システムの開発
(特願2015-116045)
Watanabe et al., IEEE Trans Nanotech (2015)
金ナノ電極を実装した生体膜マイクロチップ
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金ナノ電極を利用して膜電位を制御
DiBac4
蛍光性膜電位指示薬
長時間にわたり定量的に膜電位を制御できる
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蛍光指示薬の生体膜透過性の制御
従来の蛍光指示薬
従来の蛍光指示薬の開発は細胞内での
生体反応の検出に主眼を置いている
開発された指示薬は生体膜の透過性の高いものが多い
すなわち、in vitro での生体反応計測に利用できるもの
は少なく、従来の指示薬を簡単に膜非透過性の指示薬
へ改造する技術が必要とされていた
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膜非透過性の蛍光指示薬への改造技術
電荷を帯びた高分子鎖と蛍光指示薬を結合
(特願2015-202821)
1本鎖DNA
新しい指示薬
蛍光指示薬
(Fluorescein)
従来の指示薬
簡単に蛍光指示薬の膜透過性を改造できる
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超高感度化により
様々な膜輸送体の機能計測が可能に
溶血素
P2X4
種類
ポア
チャネル型
受容体
基質
色素
Ca2+
F-ATPase
V-ATPase
POT
トランスポーター
トランスポーター
1次性能動輸送
2次性能動輸送
H+
H+
ジペプチド
膜輸送体の1分子機能解析
(例：F-ATPase)
プロトン輸送速度
~30 (s-1)
能動輸送の1分子機能解析も可能 (世界初)
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生体膜マイクロチップの特徴まとめ
1, 生体膜でシールした微小試験管アレイ




生体膜の形成効率は99 %以上.
約10万個集積化されている.
生体膜はイオンなどの物質透過性はなく安定.
膜電位の定量制御も可能に.
2, 膜輸送活性計測の検出感度を大幅に改善
 検出感度が106倍改善 (検出限界:毎秒2分子).
 膜輸送体の活性を1分子単位で計測.
 能動輸送の計測も可能に.
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想定される用途 (創薬)
薬剤スクリーニングシステム
(標的膜タンパク質の評価、薬剤の膜透過性の評価)
膜タンパク質チップ
膜タンパク質の高感度活性計測を基盤とした
薬効の評価および薬剤の膜透過性の評価
薬剤スクリーニングシステムへの展開
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想定される用途 (医療)
膜タンパク質の個数計測システム
(早期疾患診断システム)
Watanabe et al., Proc. MicroTAS (2015)
膜タンパク質の1分子活性計測を基盤として
細胞内の標的膜タンパク質の発現個数を定量計測
細胞内発現個数の定量計測に基づく
早期疾患診断システムへの展開
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実用化に向けた課題１
人工生体膜チップに細胞環境を再現する技術開発
生体膜の脂質組成、再構成要素群などを
徹底的に検証する必要がある
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実用化に向けた課題２
従来の薬剤探索に利用されてきた
ロボティクス技術を実装する
96well プレートを利用した
自動液体分注装置
各wellの底に
膜タンパク質チップを実装
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企業への期待
生体膜チップの実用化は、膜タンパク質を標的とした
超高感度・ハイスループットな薬剤探索および
医療診断システムが実現する可能性を秘めています。
実用化にあたり、様々な階層の実用開発研究が想定さ
れますが、これらを大学の研究室レベルで遂行するこ
とは極めて困難です。
創薬、分析機器開発、生体材料開発のノウハウのある
企業様のお力添えで是非とも生体膜チップの早急な実
用化を目指して参りたいと考えています。
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本技術に関する知的財産権
知的財産権
発明の名称：高密度微小チャンバーアレイおよびその製造方法
出願番号：特願2013-171493
出願人：国立大学法人東京大学
発明者：渡邉力也, 藤田大士, 菅裕明, 野地博行
発明の名称：高密度微小チャンバーアレイおよびこれを用いた測定方法
出願番号：特願2015-116045
出願人：国立研究開発法人科学技術振興機構
発明者：渡邉力也, 曽我直樹, 野地博行
発明の名称：脂質膜非透過性蛍光指示薬
出願番号：特願2015-202821
出願人：国立大学法人東京大学
発明者：渡邉力也, 大舘真也, 曽我直樹, 野地博行
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本技術に関する問い合わせ先
技術問い合わせ
渡邉力也
東京大学大学院工学系研究科応用化学専攻
Email: [email protected]
ライセンス問い合わせ
神崎修
国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)
Email: [email protected]
鈴木和哉
株式会社東京大学TLO
Email: [email protected]
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