Spark™ 10M マルチモードリーダー – 発光感度

テクニカルノート
Spark™ 10M マルチモードリーダー –
発光感度
フラッシュ発光およびグロー発光の検出限界の最適化
緒言
Spark 10M は Tecan の次世代マルチ検出モードマイク
ロプレートリーダーで、現代のアプリケーションの
ニーズを満たすべく開発されている。同リーダーは正
確、再現可能、迅速な測定を、革新的な設計によって
実現する。
Spark 10M の基本発光モジュールを使用すると、高感
度発光測定(フラッシュ＆グロー)を実施できる。OD(光
学濃度)フィルターを使用すると、OD1～OD3 の範囲の
強い信号の減衰により、1 つの実験で非常に高い信号と
低い信号を最適な形で検出し、「過剰」読み取りを防
ぐことができる。これにより、9 桁を上回るダイナミッ
クレンジの発光信号の検出が可能になる。強化された
発光モジュールでは、最大 5 種類の異なるルシフェ
ラーゼを使用したマルチカラー発光アッセイの測定だ
けでなく、発光スペクトルスキャン(例: 発光タンパク
質)の実施もできる。革新的なフィルターベースのアプ
ローチにより、398 nm～653 nm の任意の波長を、ス
テップサイズ 15 nm、帯域幅 25 nm で選択できる(3)。
特定の測定モードにおけるマイクロプレートリーダー
の感度、または検出限界(DL)は、いくつかの異なる要
素に依存する。発光アプリケーションでは、以下の
ルールを遵守することがきわめて重要である。
リーダーは最初の測定の実施から少なくとも 20 分前に
オンにする必要がある。Spark 10M の非常に高感度な
フォトンカウンティングチューブ(PCT)が最適な性能を
発揮するには、これを平衡化する必要があるからであ
る。
5 分を上回る測定(積分時間の長い発光カイネティクス
や読み取り)を実行する際には、機器の温度制御をオン
にする。この操作は、ほとんどのルシフェラーゼの活
動が温度に大きく依存するため重要である。さらに、
操作中に機器が暖まるため、時間の経過に伴う、また
プレート全体にわたる、発光の一貫性に影響する。設
定温度(例: 室温+4℃)を維持することで、機器が安定し、
発光信号のドリフトが防止される。
各発光アプリケーションについて、積分時間(つまり、
信号取得の長さ)を最適化する。目安として、フラッ
シュ発光ベースのアプリケーションでは 1 秒から 20 秒、
グロー発光ベースのアプリケーションでは 100 ミリ秒
から 1 秒の積分時間が必要となる。
未確立の発光アプリケーションでは、「自動減衰」を
使用すべきである。この機能は、感度損失なしで Spark
10M リーダーのダイナミックレンジを強化し、不要な
「過剰」値がデータに発生するのを防ぐ。
ほとんどの場合、150 ミリ秒の待機時間は、読み取り
精度に悪影響を与える可能性のある、ウェル内の液体
の不要な水はねを防ぐのに十分である。
機器設定値の最適化に加え、一部のアッセイパラメー
タも、測定を成功させるためにきわめて重要である。
読み出しパフォーマンス性能を最大限に高めるには、
1
テクニカルノート
プレートの種類、形式、および充填容量の最適化が必
要となる。
すべての発光測定では、信号を増幅するために白色の
マイクロプレートを使用することが不可欠である。し
かし、白色マイクロプレートはエラーの原因となる場
合がある。これは、通常の実験室の明かりの下で保管
されているときに、フォトンが「満載」されるからで
ある。このりん光がリーダーによって検出され、その
結果、バッググラウンド信号の整合性が失われる。明
かりを暗くし、プレートをリーダー内で最大 10 分間寝
かせてから測定を開始すると、この偽信号を最小限に
抑え、ブランクウェルの標準偏差を減らして検出限界
を改善することができる(式 1 を参照)。
堅牢な結果を得るには、科学的に正しいデータ整理を
実施すべきである。ピペッティングやプレートエラー
に起因する不要な外れ値は、グラブス外れ値検定(1,2)
によって取り除くことができる。これは、アッセイブ
ランクを含むウェルにおいて、特に重要である。
このテクニカルノートでは、フラッシュ発光とグロー
発光について Spark 10M マルチモードリーダーの最大
機器感度を判定するために使用する、検定の最適な設
定、機器設定値、および統計式について説明する。
グロー発光
材料と手法
 Spark 10M マルチモードリーダー (Tecan、オース
トリア)
 384 ウェル、スモールボリューム白色ポリスチロー
ルマイクロプレート(Greiner® Bio-One、ドイツ)
 144-041 ATP 検出キット SL (BioThema、スウェー
デン)
 ATP を含まない ddH2O
 トリス-エチレンジアミノ四酢酸(EDTA)バッファー
 Labofuge 400e (Heraeus、ドイツ)
<>
A
B
C
D
E
F
G
H
1
BL
BL
BL
BL
BL
BL
BL
BL
2
BL
BL
BL
BL
BL
BL
BL
BL
3
4
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
5
2
2
2
2
2
2
2
2
6
20
20
20
20
20
20
20
20
7
200
200
200
200
200
200
200
200
8
2,000
2,000
2,000
2,000
2,000
2,000
2,000
2,000
表 1: グロー発光アッセイのプレートレイアウト。Bl = ブランク、各濃度
はウェルごとの最終 ATP 濃度を nM 単位で示す。グレーのウェルは空の
ままだった。
測定パラメータと機器設定値
表 2 に示す機器設定値を用いて 3 枚のプレートを測定
した。測定開始前に、白色プレートのりん光に由来す
るバックグラウンド信号を最小限に抑制するため、プ
レートをリーダーの中で 5 分間静置した。静置後
SparkControl™ ソフトウェアを使用して、吸光スペク
トルを表示、分析した。
測定パラメータ
プレート
測定モード
減衰
積分時間
待機時間
出力
機器設定値
Greiner384sw
発光
なし
1,000 ms
150 ms
カウント/秒
表 2: グロー発光用の機器設定値
データ整理
ブランクウェルの結果のうち著しい外れ値を除外する
ために、グラブス外れ値検定を使用した。グラブス検
定(別名: 最大ノルム残差検定)は、正規分布の個体群に
由来すると仮定される一変量のデータセットから外れ
値を検出するために使用する検定である(1)。検定は
GraphPad オンライン計算機を使用し、有意水準 0.05
(2)で実施した。
機器の感度を判定するため、20 nM ATP サンプルの信
ピペッティング手順
号と以下の式を用いて検出限界を計算した。
384 ウェルプレートを、表 1 に示すプレートレイアウト
に従って、ウェル 1 つあたり 25µl の充填容量で充填した。
5 µl の適切な ATP 原液(1、10、100 nM、1、10 µM)ま
たはブランク(トリス-エチレンジアミノ四酢酸(EDTA)
バッファー)を各ウェルにピペットで充填し、続いて反
応混合物 20 µl を充填した。気泡を除去するため、プ
式 1: 検出限界の計算。
Concentration [ATP]: ATP の最終濃度(単位 pM)
レートを 500～2,000 rpm ですばやく遠心沈殿させた。
mean[ATP]: 平均毎秒カウント数(cps)
手順の実施中は、実験室の明かりを暗くした。
mean[Bl]: ブランクウェルの平均毎秒カウント数(cps)
Stdev[Bl]: ブランクウェルの標準偏差
2
テクニカルノート
それぞれの測定機器について、グラブス検定を実施し、次に 50 µl の ENLITEN 試薬を Spark 10M のインジェク
検出限界を計算した。3 つの検出限界の平均値を計算し、ターシステムを使用して加えた。
機器の感度の判定に使用した。求められた絶対感度(単
位 pM)を、相対感度(単位 amol/ウェル)に変換した(表 3)。注：インジェクターシステムは、ENLITEN 試薬でプラ
イミングする前に ATP を含まない水で洗浄する必要が
ある(20 回以上のピストンストローク)。
結果
測定
1
2
3
平均
標準偏差
感度
5.1 pM
128 amol/ウェル
6.1 pM
153 amol/ウェル
6.4 pM
166 amol/ウェル
5.96 pM
149.1 amol/ウェル
0.78 pM
19.6 amol/ウェル
表 3: Spark 10M リーダーを最適な条件でグロー発光測定に用いた場合の
代表的な測定感度。
図 1: 最適な条件を用いた場合の Spark 10M リーダーのグロー発光
注: ここに提示するデータはパフォーマンスの代表値であり、機器の仕様
ではない。
フラッシュ発光
材料と手法
 Spark 10M マルチモードリーダー
(Tecan、オーストリア)
 384 ウェル白色ポリスチロールマイクロプレート
(Greiner Bio-One、ドイツ)
 ENLITEN® ATP アッセイシステム
(Promega、ドイツ)
 ATP を含まない ddH2O
<>
A
B
C
1
BL
BL
BL
2
BL
BL
BL
3
BL
BL
BL
4
BL
BL
BL
5
BL
BL
BL
6
7
8
9
10 11
0.09 nM 0.9 nM
9 nM
0.09 nM 0.9 nM
9 nM
0.09 nM 0.9 nM
9 nM
表 4: フラッシュ発光アッセイのプレートレイアウト。Bl = ブランク、各
濃度はウェルごとの最終 ATF 濃度を示す。グレーのウェルは空のまま
だった。
測定パラメータと機器設定値
プレートは、表 5 に示す機器設定値を用いて測定した。
測定開始前に、白色プレートのりん光に由来するバッ
クグラウンド信号を最小限に抑制するため、プレート
をリーダーの中で 5 分間静置した。
測定パラメータ
プレート
待機時間
測定モード
注入
機器設定値
Greiner384fw
5分
発光、ウェル毎
インジェクターA、容量 50 µl、
200 µl/秒、注入後に補充
待機時間
測定
減衰
積分時間
待機時間
出力
5秒
発光
なし
10,000 ms
150 ms
カウント/秒
表 5: フラッシュ発光用の機器設定値
データ整理
グラブス検定の実施後、グロー発光アッセイの場合と
同様に、個々の測定について検出限界を計算した(式 1)。
3 回の独立した測定の平均検出限界を用いて、機器の感
度を判定した。求められた絶対感度(単位 fM)を、相対
感度(単位 amol/ウェル)に変換した(表 6)。
ピペッティング手順
384 ウェルプレートを、表 4 に示すプレートレイアウ
トに従って、ウェル 1 つあたり 55µl の合計充填容量で
充填した。
5 µl の適切な ATP 原液(1、10、100 nM)またはブラン
ク(ATP を含まない水)をピペットで各ウェルに注入し、
3
テクニカルノート
結論
結果
測定
1
感度
171.2 fM
9.41 amol/ウェル
215.4 fM
11.85 amol/ウェル
176.6 fM
9.77 amol/ウェル
188.0 fM
10.34 amol/ウェル
23.9 fM
1.32 amol/ウェル
2
3
平均
標準偏差
表 6: Spark 10M を最適な条件でフラッシュ発光測定に用いた場合の代表
的な測定感度。
この結果は明らかに、グロー発光とフラッシュ発光の
両方について、Spark 10M の卓越したパフォーマンス
を示す。上記の感度検定および機器設定値をセット
アップすると、検出限界が改善され、機器の感度が最
大限に高まる。
このテクニカルノートで説明した原則は、すべての発
光ベースアプリケーションに当てはまるが、システム
の最適な設定値は、アッセイとユーザー要件によって
異なる。
参考文献
(1) Frank E Grubbs. Procedures for Detecting
Outlying Observations in Samples. Technometrics,
1969, 11(1), 1-21.
(2) http://graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm
(3) TN: Unparalleled flexibility for luminescence
detection with the Spark 10M multimode reader:
398597 V1.0. 12-2014
図 2: 最適な条件を用いた場合の Spark 10M のフラッシュ発光の線形性。
注: ここに提示するデータはパフォーマンスの代表値であり、機器の仕様
ではない。
※このアプリケーションノートは Tecan（本社スイス）が
発行（原文英語）し、テカンジャパンが日本語翻訳したも
のです。
翻訳文の表現等に疑義が生じた場合は、原文をご参照くだ
さい。
Australia +61 3 9647 4100 Austria +43 62 46 89 33 Belgium +32 15 42 13 19 China +86 21 2206 3206 Denmark +45 70 23 44 50 France +33 4 72 76 04 80
Germany +49 79 51 94 170 Italy +39 02 92 44 790 Japan +81 44 556 73 11 Netherlands +31 18 34 48 174 Singapore +65 644 41 886 Spain +34 93 595 95 25 31
Sweden +46 31 75 44 000 Switzerland +41 44 922 81 11 UK +44 118 9300 300 USA +1 919 361 5200 Other countries +43 62 46 89 33
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398751J V1.0. 06-2015
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