〔特集２：2011年農林水産研究成果10大トピックス〕 口蹄疫の簡易・迅速・低コスト診断： 迅速な行政対応を目的としたmultiplexRT-LAMP法の開発 山崎渉・三津尚明 宮崎大学農学部獣医学科 口蹄疫の感染拡大を防ぐには，初発例を迅速かつ確実に診断した上で遅滞なく殺処分し，早 期に封じ込めることが重要である｡それゆえ簡易・迅速かつ低コストの検査法であるmultiplex RT-LAMP法を用いた口蹄疫の診断法を開発した。牛豚由来の286臨床検体を使用して，ＯＩＥ の推奨するリアルタイムRT-PCR法と比較を行った結果，我々が開発したmultiplexRTLAMP法はリアルタイムRT-PCR法と同等の診断能力を有することが明らかになった。本診 断法はバイオセキュリティ上の問題を回避できる安全な遺伝子検査であり，口蹄疫の一次スク リーニング法として有用であることが示唆された。 （キーワード：Multiplex，RT-LAMP，口蹄疫，遺伝子検査，行政対応） ウイルス分離等によって確定診断がなされる。 １．はじめに しかし，現行の体制は材料採取から診断確定ま ヒトや動物，食料ならびに家畜飼料・敷料等 でに日数を必要とする上に煩雑であるため，早 の国境を越えた移動の増加（グローバリゼーシ 期封じ込め措置を行う上で支障となっている。 ョン）に伴い，海外悪性伝染病のわが国への侵 問題解決には都道府県で実施できる安全な高感 入リスクは増大している。2010年，宮崎県で発 度迅速スクリーニング検査法の開発が有用であ 生した口蹄疫では2,000億円を超える経済被害 る。それゆえ筆者らはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ により，県畜産業は壊滅的な打撃を被った。口 法と比較して，より簡易迅速かつ低コストの検 蹄疫の感染拡大防止には，初発例の早期診断に 査が可能であることが知られているＲＴ− よる摘発ならびに迅速な殺処分によるウイルス ＬＡＭＰ（RTLoop-mediatedlsothermalAmpli‐ 拡散の封じ込めが重要である。国が定める現在 fication）法を用いた口蹄疫の診断法の開発に の防疫指針によれば，病変形成などの肉眼所見 取り組んだ。 や臨床所見によって口蹄疫が疑われる場合，検 体を東京都内の動物衛生研究所に搬送した上で， 2．ＬＡＭＰ法 リアルタイムRT-PCR(ReverseTranscription PolymeraseChainReaction）法や抗体測定， ＬＡＭＰ法は，2000年にNotomieraﾉ.(2000） によって開発されたＤＮＡを短時間で増幅・検 出する技術である。鎖置換型酵素，６−８領域を WataruYAMAzAKIandNaoakiMIsAwA：Simple,rapid andcost-effectivediagnosisoffbot-and-mouthdis‐ ease：developmentofamultiplexRT-LAMPassay fbrrapidadministrativedecisionmaking 認識する４−６本のプライマーならびに基質等を 用い，60-65℃付近の一定温度下で標的遺伝子 が増幅される。それゆえ，増幅効率ならびに反 −３７− 農林水産技術研究ジャーナル３５（５）２０１２ 応特異性が高く，15-60分程度の短時間で標的 ＬＡＭＰ法の詳細な原理については，アニメー 遺伝子を１０，−１０１０倍程度に増幅させることがで ションを含む豊富な解説が掲載されている栄研 きる。ＲＮＡを対象とする場合は，上述の試薬 化学のウエブサイト（http://loopampeiken・ 混和時に逆転写酵素を加えておくのみで増幅が CO.』p/）を参考にされたい。 可能である（RT-LAMP法)。反応副生物であ るピロリン酸マグネシウム生成により生じる濁 度上昇によって判定するために増幅から判定 3．Multiplex化により特異性を増強した口 蹄疫診断用ＲＴ−ＬＡＭＰ法の構築 までを１本の反応チューブ内で完結させること 口蹄疫ウイルスは動物衛生研究所を除き国内 ができる。専用の測定機器が無い環境でも， では取り扱えないため，まず既知の口蹄疫ウイ ヒートブロックやウオーターバスを使用して増 ルス３Ｄ領域の塩基配列と相同な人工合成ヌク 幅・検出が可能である。 ネオチド鎖を作製し，陽性対照とした。次に 公衆衛生分野ではマラリアやコレラ，腸管出 GenBankに登録されている全７血清型（Ａ，Ｃ 血性大腸菌，ノロウイルスなどの感染症や食中 Ｏ，Asia−１，ＳＡＴ−１，ＳＡＴ−２，ＳＡＴ−３） 毒を引き起こす多くの病原体の迅速検出を目的 からなる265の口蹄疫ウイルス３Ｄ領域の塩基 としたＬＡＭＰ法が多数開発されている。SARＳ 配列を用いて多数のプライマーを設計した。 結核菌群，レジオネラ，マイコプラズマ，イン BLAST検索により各プライマーの特異性を確 フルエンザなどではすでに診断キットがヒト用 認した。口蹄疫ウイルス遺伝子の多様性に対応 の体外診断用医薬品として認可されている。動 するために，さらに既報の２セットのプライ 物用においても近年開発が進んでおり，アフリ マー（Dukesαα/､,2006；Ｓｈａｏｅ/α/､,2010） カ豚コレラや豚コレラなどを対象とした も利用してmultiplex（複合）化した。このう ＬＡＭＰ法が開発されている。ＬＡＭＰ法はＰＣＲ ち良好な増幅を示したmultiplex4セット（セ 法と比較して簡易迅速性，検出感度ならびに経 ット１−４）を選択して以降の試験に用いた。 済性に優れている。高価な機器類や試薬類を必 要としないＬＡＭＰ法は開発途上国における感 4．臨床検体を用いた有用性評価 染症診断や野外調査に特に有用である。なお， ＲＴ−ＬＡＭＰ 1976年から2011年の35年間にアジア・アプリ (ReverseTranscriptionLoop-mediatedisothermaIampI而cationl プライマー ３０分 63°Ｃ・15-60分 試薬 核酸抽出機 Ｉ →唾 肉眼による判定 、 Ｄ Ｊ ＋ ÷ Ｎ 一…．‐上錐…“含 ０ ． ３ ０ ． ２ : 1 粁 一 Ｉ Ｉ ﾉ 声与つ室ご﹄ ﾘ ' 訂ﾘｱﾙﾀｲﾑ雌計による判定 愚Ｏ Ａ Ｏ ,胃噸 琴１１︾罰謝謝珪証睡諏嘩睡証奇ｆＪＪ 買跳蝶ｉｆ旧師＃幾℃︲包り .g、杉＝&日，一二 rリアルタイム〕濁度計 ■ 再 ■ ■ 藍 ｪ 巨 宇 ｚ Ｐ 冒 手 Ｆ 面 与 ▲ - 一 宇 守 口 , タ ー p ｧ " , d L e u p ,Ｆ 墓 騨 茜 創 ＝ ＝ − ＝ . ご − Ｚ Ｏ ． 0 4 ０ Ｃ 図ｌＲＴ−ＬＡＭＰ法による検査の流れ −３８− 山崎・三浬：口蹄疫の簡易・迅速・低コスト診断 力・ヨーロッパ・南アメリカ大陸において採取 表lMultiplexRT-LAMP法とリアルタイムＲＴ− ● ＰＣＲ法の結果比較 され，英国動物衛生研究所に保存されていた MultiplexRT-LAMPセット１ 牛・豚由来の臨床検体から無作為に抽出した の結果/リアルタイムRT-PCR の結果 286検体（Ｃ型を除く６種の血清型からなる） を用いて，ＯＩＥ（世界動物保健機関）の推奨す 診断的感度（陽性） 229/231（99.1％） るリアルタイムRT-PCR法（Callahaneraﾉ.， 診断的特異度（陰性） ４０/5５（72.7％） 2002；Reideraﾉ.,2009）と今回開発したmulti‐ 286臨床検体を使用：リアルタイムRT-PCR法において231 検体が陽性，５５検体が陰性． plexRT-LAMP法との比較を行った。286検体 から抽出されマイナス80℃で冷凍保存されてい たＲＮＡを用いて，各multiplexRT-LAMP法 表２リアルタイムRT-PCR法で陰性を示した55検 ならびにリアルタイムＲＴＬＰＣＲ法を実施した。 体の診断的特異度 リアルタイムRT-PCR法はＣｔ値（闘値サイク MultiplexRT-LAMPセット１ 検体種類（Ct値） ル値，thresholdcycle）３２，増幅サイクル数５０ の条件（ReidaaJ.,2009）で実施した。ＲＮＡ の結果/リアルタイムRT-PCR の結果 SVDV（Ct値陰性） ７／７（100.0％） 保存量の制約から，１反応あたりリアルタイム ＮＶＤ（Ct値陰性） 24/2４（100.0％） RT-PCR法では５瓜L，multiplexRT証ＡＭＰ ＮＶＤ（32<Ct値く50） 法では即LのRNAをそれぞれ使用した｡RT ９/2４（37.5％） SVDV：豚水庖病ウイルス陽性検体，ＮＶＤ：口蹄疫ウイ ルス陰性検体． -LAMP法の手順は図１に示すとおりであり， 皮膚や血液，水庖液などを材料としてＲＴ− ＬＡＭＰ法を実施した場合，判定所要時間は４５ 表３MultiplexRT-LAMP法とリアルタイムＲＴ− ＰＣＲ法の検出感度蟻の比較 分から90分程度である。プライマーを除く反応 陽性対照の希釈濃度 試薬はキット化され市販されているが高価であ 検出系 るので，自家製試薬を使用しＲＮＡ抽出後のｌ ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ− 反応あたりコストを１００円程度に削減した。 ＬＡＭＰセット１ リアルタイムRT-PCR法の結果は口蹄疫ウ イルス陽』性231検体，陰性55検体であった（表 １)。リアルタイムRT-PCR法と比較したmul‐ tiplexRT証ＡＭＰ法で最も良好な結果を示し リアルタイム ＲＴ−ＰＣＲ 1０−１’１０−２ １ ０ − ３ １ ０ − ４ １ ０ − ５ 実 施 せ ず ＋ ＋ ＋･（一）ｂ（÷）ｃ １サンプルにつき２回実施，＋：２回ともに陽性，一：２ 回ともに陰性，（一）：Ｃｔ値検出だが，カットオフ値を上 回るため判定は陰性，ａ：Ｃｔ値は28.3と28.6,ｂ：Ｃｔ値は 34.1と36.0,Ｃ：Ｃｔ値は44.3と陰性 たのは，用いた４プライマーセットのうち，セ ット１であり，診断的感度99.1％（229/231） ならびに診断的特異度72.7％（40/55）を示し リアルタイムRT-PCR法において32を超え た（表１)。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法陰性の検 る弱いＣｔ値を示し口蹄疫陰性と判定された２４ 体のＣｔ値ごとの詳細はＣｔ値陰性：３１検体（豚 検体のうち，１５検体がmultiplexRT証ＡＭＰ法 水胞病ウイルス陽‘性の７検体含む)，Ｃｔ値32を 陽性と判定されたのは表３に示すとおり，両者 超え50未満：２４検体であり，Ｃｔ値陰性検体に の検出感度の違いによると推測された。リアル 限れば診断的特異度は１００％（31/31）を示した タイムRT-PCR法陽性かつmultiplexRT- （表２)。検出感度はmultiplexRT-LAMP法 LAMP法陰性を示したスーダン由来の２検体 がリアルタイムRT-PCR法よりも１００倍優れて は再テストではmultiplexRT-LAMP法で弱い いた（表３)。 陽性を示した。リアルタイムRT-PCR法にお −３９− 農林水産技術研究ジャーナル３５（５）２０１２ けるＣｔ値も弱いことからこれらは微量なウイ めて低い，安全性の高い検査法である。都道府 ルスを含む検体と推測された。以上の結果から， 県の家畜保健衛生所と食肉衛生検査所はＢＳＥ 開発したmultiplexRT岩ＬＡＭＰ法は口蹄疫診断 スクリーニング検査専用に安全キャビネットを に有用であり，現行の口蹄疫診断法のスクリー 備えた安全性の高い検査施設を保有しており， ニング法となり得る可能性が示唆された 新たなインフラ整備を行わなくても，一次スク リーニング検査体制を構築することは可能であ （Yamazakieraﾉ.投稿中)。 る。 ５今後の展望 グローバリゼーションに伴う海外悪性伝染病 感染症対策の基本の一つは「早期発見・早期 の侵入リスク増大という社会情勢の変化に対応 終息」である。2010年の宮崎県えびの市におけ するために，現行の口蹄疫診断体制を変更した る口蹄疫飛び火事例においては，検査結果を待 場合の費用対効果，メリット・デメリットを見 たずに臨床所見を基に迅速に殺処分を行った結 極めながら，農家の安心と国家の安全という相 果，封じ込めに成功している。この封じ込め成 互の利益に立脚した実効性の高い防疫体制の構 功事例は迅速な初動対応の重要さを証明してお 築が求められている。なお，農場での迅速診断 り，短時間で口蹄疫を診断できるスクリーニン を目的とした抗原あるいは抗体検出用イムノク グ法の確立は初動対応をより確実にするもので ロマトキットが開発されているが，診断的感度 ある。 が低く，陽性例を見逃がす可能性があるため， 現行の口蹄疫診断体制は都道府県が検体採 現時点では初発例の摘発には適さない。さらな 取・搬送，動物衛生研究所が診断という形で役 る技術革新による，農場で実施可能な診断的感 割が分担されている。遺伝子検査を一次スク 度・診断的特異度ともに優れた口蹄疫の簡易迅 リーニングとして都道府県が実施し，陽性検体 速診断法の開発が望まれる。 を動物衛生研究所において確定診断する体制が 参考文献 構築できれば，より迅速な口蹄疫の初動対応が 可能になるであろう。このような検査体制 は，2001年以来ＢＳＥ（牛海綿状脳症）検査に おいて実施されており，有用性が実証されてい る。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法やmultiplexRT -LAMP法などの遺伝子診断法はウイルスの培 Callahan,』.Ｄ､eraﾉ.(2002)J・Ａｍ､Vet､MedAssoc.， ２２０：1636-1642． D u k e s , J ・ Ｐ ､ e r a Ｉ . ( 2 0 0 6 ） A r c h ､ V i r o 1 . , 1 5 1 ： 1 0 9 3 1 1 0 6 ． Notomi,Ｔ､ααI.(2000）NucleicAcidsRes.,２８：Ｅ63． Reid,Ｓ､Ｍ､αα1.(2009)Ｊ､VetDiagn､Invest.,２１：321 3 3 0 ． S h a o , 』 . 』 . “ α ﾉ . ( 2 0 1 0 ） I n t e r ､ . 』 ､ A p p l ・ R e s ・ V e t , M e d . ， 養を伴わない上に，核酸抽出時にウイルスを不 活化しているため，実験室内汚染リスクのきわ ８：１３３−１４２． 〒88チ2192宮崎市学園木花台西１−１ −４０−
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