〔実 82 頁〕 公表特許公報（Ａ） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許出願公表番号 特表2015-519076 （Ｐ２０１５−５１９０７６Ａ） (43)公表日 平成27年7月9日(2015.7.9) (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード(参考) Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ４Ｂ０２４ Ａ０１Ｋ 67/027 (2006.01) Ａ０１Ｋ 67/027 ＺＮＡ ４Ｂ０６４ Ｃ１２Ｎ 5/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 １０２ ４Ｂ０６５ Ｃ１２Ｐ 21/08 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 審査請求 Ｃ 未請求 予備審査請求 未請求 （全107頁） (21)出願番号 特願2015-517239(P2015-517239) (71)出願人 597160510 (86)(22)出願日 平成25年3月7日(2013.3.7) リジェネロン・ファーマシューティカルズ (85)翻訳文提出日 平成27年2月3日(2015.2.3) ・インコーポレイテッド (86)国際出願番号 PCT/US2013/029624 ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ (87)国際公開番号 WO2013/187953 ＴＩＣＡＬＳ， (87)国際公開日 平成25年12月19日(2013.12.19) アメリカ合衆国１０５９１−６７０７ニュ (31)優先権主張番号 61/663,131 ーヨーク州タリータウン、オールド・ソー (32)優先日 平成24年6月22日(2012.6.22) ・ミル・リバー・ロード７７７番 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 61/658,466 (32)優先日 平成24年6月12日(2012.6.12) (33)優先権主張国 米国(US) ＰＨＡＲＭＡＣＥＵ ＩＮＣ． (74)代理人 100078282 弁理士 山本 秀策 (74)代理人 100113413 弁理士 森下 夏樹 最終頁に続く (54)【発明の名称】限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するヒト化非ヒト動物 (57)【 要 約 】 限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質をコードす る異所性配列とを有するマウス、胚、細胞および組織を提供する。様々な実施形態におい て、ヒト化内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、雄マウスにおい て機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機 能的断片を発現することができるマウスを記載する。単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、 複数のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび複数のヒトＪＨ 遺伝子セグメントを特徴とする免 疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウス、胚、細胞および組織であって、ＡＤＡＭ６タ ンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を発現することがで きるマウス、胚、細胞および組織も提供する。 ( 2 ) JP 1 2015-519076 A 2015.7.9 2 【特許請求の範囲】 前記免疫グロブリン定常遺伝子が、ヒトＣＨ １、ヒトヒ 【請求項１】 ンジ、ヒトＣＨ ２、ヒトＣＨ ３およびそれらの組み合わ マウスであって、 せから選択されるヒト配列を含む、請求項１１に記載の （ａ）単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以上のＤ マウス。 Ｈ 遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメ 【請求項１４】 ントを含むヒトゲノム配列；および 前記マウス定常遺伝子が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝 （ｂ）雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパ 子座にある、請求項１２に記載のマウス。 ク質をコードする配列であって、野生型マウスのＡＤＡ 【請求項１５】 Ｍ６遺伝子座とは異なる位置にある配列 をその生殖細胞系に有する、マウス。 前記ヒトゲノム配列が、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメ 10 ント、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒト 【請求項２】 ＪＨ 遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載のマウス 前記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントが多型ＶＨ 遺伝子 。 セグメントである、請求項１に記載のマウス。 【請求項１６】 【請求項３】 前記ヒトゲノム配列が、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメン 前記ＡＤＡＭ６をコードする配列がマウス配列である、 ト、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪ 請求項１に記載のマウス。 Ｈ 【請求項４】 【請求項１７】 前記マウスゲノム配列が前記ヒトゲノム配列に並置また １つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上の は隣接している、請求項１に記載のマウス。 Ｊκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１、１５ま 【請求項５】 20 遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載のマウス。 たは１６に記載のマウス。 前記ヒトゲノム配列および前記マウスゲノム配列が内因 【請求項１８】 性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、請求項１に 前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以 記載のマウス。 上のＪκ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリン軽鎖 【請求項６】 遺伝子座に存在する、請求項１７に記載のマウス。 前記ヒトゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子 【請求項１９】 座に存在し、前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブ 少なくとも１つのヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび少な リン重鎖遺伝子座以外の該マウスゲノム内の位置に存在 くとも１つのヒトＪＨ 遺伝子セグメントに作動可能に連 する、請求項１に記載のマウス。 結された少なくとも１つのヒトＶＨ 遺伝子セグメントを 【請求項７】 含むマウスであって、異所性マウスＡＤＡＭ６配列を含 すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ 遺伝子セグ 30 む、マウス。 メントの欠失を含む、請求項１に記載のマウス。 【請求項２０】 【請求項８】 前記核酸配列が異所位置に存在する、請求項１９に記載 前記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントが、ＶＨ １−２、 のマウス。 ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３− 【請求項２１】 ２３またはそれらの多型変異体から選択される、請求項 前記核酸配列が内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在す １に記載のマウス。 る、請求項１９に記載のマウス。 【請求項９】 【請求項２２】 前記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントがＶＨ １−６９である、 前記核酸配列がマウスゲノム内の内因性免疫グロブリン 請求項８に記載のマウス。 【請求項１０】 遺伝子座以外の位置に存在する、請求項１９に記載のマ 40 ウス。 前記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントがＶＨ １−２である、請 【請求項２３】 求項８に記載のマウス。 血清免疫グロブリンを発現するマウスであって、該マウ 【請求項１１】 スの該血清免疫グロブリンの８０％超がヒト重鎖可変ド 前記単一のＶＨ 遺伝子セグメントが、ヒト、マウスまた メインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、該ヒ はキメラヒト／マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に ト重鎖可変ドメインが、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメン 作動可能に連結されている、請求項１に記載のマウス。 トおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶＨ 【請求項１２】 遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、マウス。 前記免疫グロブリン定常領域遺伝子がマウス定常領域遺 【請求項２４】 伝子である、請求項１１に記載のマウス。 マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に 【請求項１３】 50 おいて、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ 遺 ( 3 ) JP 3 2015-519076 A 2015.7.9 4 伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントお めの該マウスの第二の改変を行う工程 よび／またはその多型変異体による置換をその生殖細胞 を含む、方法。 系に含む、マウス。 【請求項３４】 【請求項２５】 工程（ｂ）の核酸配列が異所位置に存在する、請求項３ マウスであって、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に ３に記載の方法。 おいて、すべてのまたは実質的にすべての内因性軽鎖Ｖ 【請求項３５】 遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグ 前記第一の改変が、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝 メントによる置換をさらに含む、請求項２４に記載のマ 子配列の存在を含む、請求項３３に記載の方法。 ウス。 【請求項２６】 【請求項３６】 10 前記第一の改変が、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝 前記ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに作動可能に連結され 子座内の１つ以上の配列の、該マウス免疫グロブリン重 た１つ以上のヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをさらに含む 鎖遺伝子座内の１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配 、請求項２５に記載のマウス。 列による置換を含む、請求項３３に記載の方法。 【請求項２７】 【請求項３７】 請求項１、１９、２３または２４に記載のマウスに由来 前記第一の改変が、１つ以上の内因性ＶＨ 遺伝子セグメ する、細胞または組織。 ントの、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の単 【請求項２８】 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントによる置換を含む、請求 単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントに由来する重鎖を含む 項３６に記載の方法。 ヒト抗体集団を作製するための方法であって、以下： 【請求項３８】 （ａ）請求項１に記載のマウスを対象となる抗原で免疫 20 前記第一の改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、前記 する工程； マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のヒト重鎖可変遺 （ｂ）該マウスが該対象となる抗原に関して免疫応答を 伝子配列による置換を含む、請求項３３に記載の方法。 開始するようにする工程；および 【請求項３９】 （ｃ）該抗体が該対象となる抗原に結合する、該非ヒト 前記第一および前記第二の改変が同時に行われる、請求 動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単 項３３に記載の方法。 離する工程 【請求項４０】 を含む、方法。 抗原に対して特異的な抗体を産生させるための方法であ 【請求項２９】 って、以下の工程： 前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号５と （ａ）請求項１に記載のマウスを該抗原で免疫する工程 少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５ 30 ； ％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なく （ｂ）該抗原に対して特異的な抗体を産生する該マウス とも９８％同一である、請求項２８に記載の方法。 から少なくとも１つの細胞を単離する工程；および 【請求項３０】 （ｃ）工程ｂ）の抗体を産生する少なくとも１つの細胞 前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号５を含 を培養する工程、および該抗体を得る工程 む、請求項２８に記載の方法。 を含む、方法。 【請求項３１】 【請求項４１】 前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号６４ 工程（ｃ）における前記培養する工程が、工程（ｂ）に と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８ おいて得た前記少なくとも１つの細胞から産生された少 ５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少な くとも９８％同一である、請求項２８に記載の方法。 なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行われる、請求項 40 ４０に記載の方法。 【請求項３２】 【請求項４２】 前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号６４を 工程（ｂ）において得られる前記少なくとも１つの細胞 含む、請求項２８に記載の方法。 が、工程（ａ）からの前記マウスの脾臓、リンパ節また 【請求項３３】 は骨髄に由来する、請求項４０に記載の方法。 マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための 【請求項４３】 方法であって、以下： 工程（ａ）の前記抗原での免疫が、タンパク質、ＤＮＡ （ａ）雄マウスにおいて内因性マウスＡＤＡＭ６活性の 、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発 低減または除去を結果としてもたらす、該マウス免疫グ 現する細胞で行われる、請求項４０に記載の方法。 ロブリン重鎖遺伝子座の第一の改変を行う工程；および 【発明の詳細な説明】 （ｂ）該マウスに対してＡＤＡＭ６活性を回復させるた 50 【技術分野】 ( 4 ) JP 5 2015-519076 A 2015.7.9 6 【０００１】 つかの実験的障害、例えば、マウスが十分に多様な抗体 分野 レパートリーの産生を実行できなくなる、広範なリエン 低減された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の複雑性を含 ジニアリングフィックス（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ む遺伝子操作非ヒト動物であって、ＡＤＡＭ６タンパク ｇ ｆｉｘｅｓ）の使用を必要とする、おそらくヒト要 質またはその機能的断片を発現することができる遺伝子 素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクロー 操作非ヒト動物を提供する。限られた数の免疫グロブリ ン選択過程を提供する、およびヒト治療薬の作製に真に ン重鎖可変遺伝子セグメントおよび／またはその変異体 有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様 から抗体を発現する遺伝子操作非ヒト動物であって、機 な集団の信頼できない源、をもたらす。 能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くがＡＤＡＭ６機能を 【０００４】 保持する遺伝子操作非ヒト動物、例えば、マウスを機能 10 ヒト抗体治療薬は、選択された抗原に関して所望される 的ＡＤＡＭ６タンパク質作製不能にし、その結果、妊性 特徴に基づき操作される。ヒト化マウスを選択抗原で免 を喪失させる内因性免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ ）領 疫し、免疫したマウスを用いて、所望の結合特徴を有す 域遺伝子座の改変を含むマウスを記載する。遺伝子改変 る高親和性の同種の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ド マウスは、限られた数のＶＨ 遺伝子セグメント、例えば メインを同定するための抗体集団を生成する。内因性マ 単一の免疫グロブリンＶＨ セグメント、例えばヒトＶＨ ウス遺伝子座において可変領域だけをヒト化させたヒト １−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ １−２遺伝子 化マウスなど、一部のヒト化マウスは、特徴および数が セグメントを特徴とする免疫グロブリンＶＨ 遺伝子座を 野生型マウスのＢ細胞集団と類似するＢ細胞集団を生成 含むマウスであって、ＡＤＡＭ６機能をさらに含むマウ する。結果として、多数の異なる免疫グロブリン再構成 ス、例えば、雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配 を反映する抗体をスクリーニングして、最も所望される 列を含むマウスを記載する。 20 特徴を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン 【０００２】 を同定するためのこれらのマウスでは、極めて大きくか 機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座をコードする核酸配列を含む つ多様なＢ細胞集団が利用可能である。 遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織であって、単一 【０００５】 のヒトＶＨ 遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン しかし、すべての抗原が、可変（Ｖ）セグメントの広範 重鎖を発現する遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織 な選択に由来する極めて多数の再構成を示す免疫応答を を記載する。さらに、上記マウス、細胞、胚および組織 惹起するわけではない。すなわち、特定の抗原に対する は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くが、ＡＤＡＭ ヒト体液性免疫応答は見かけ上限定される。限定は、十 ６タンパク質をコードする異所性核酸配列の存在を特徴 分に高い親和性および特異性で特定の抗原に結合する特 とするＡＤＡＭ６機能を保持する。ヒト病原体などの病 定のＶセグメントのみを発現するＢ細胞のクローン選択 原体に結合するのに有用である抗体配列を、妊性の非ヒ 30 に反映される。一部のかかる抗原は、臨床的に有意義で ト動物において作製するための方法が提供される。 ある、すなわち、それらの一部は、周知のヒト病原体で 【背景技術】 ある。ヒト免疫応答において発現されるＶセグメントは 【０００３】 、その抗原に対するヒト抗体応答において観察されたこ 背景 とのないランダムに選択されたＶセグメントよりも、ヒ 非ヒト動物、例えばマウスは、抗体ベースのヒト治療薬 トＤセグメントおよびヒトＪセグメントを組み合わせて において使用するための抗体配列を作製するための方法 、有用な高親和性抗体を生成する可能性が高いＶセグメ において有用なツールになるように遺伝子操作されてき ントであるという仮説が提起されている。 た。ヒト化可変領域遺伝子座（例えば、ＶＨ 、ＤＨ およ 【０００６】 びＪＨ 遺伝子ならびにＶＬ およびＪＬ 遺伝子）を有する ヒトと病原体との間の経験の千年間にわたる自然選択は マウスは、抗体治療薬において使用するための同種の（ 40 、病原体を中和するためのその最も有効な武器をデザイ ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖および軽鎖可変ドメインを生成す ンするのに最も効率的な基礎または基盤（選択されたＶ るために使用される。同種の重鎖および軽鎖を有する完 遺伝子セグメント）を選択したと仮定されている。当該 全ヒト抗体を生成するマウスは、当該技術分野において 技術分野においては、上記で論じられた病原体のような 公知である。これらのマウスを作製する場合、ランダム 抗原に結合し、および／またはこれらを中和する、優れ に組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおい た抗体が必要とされている。有用な配列を、多型および て発現する免疫グロブリンレパートリーとして機能する ／または体細胞変異させた選択Ｖ遺伝子セグメントを含 ために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化す めた選択Ｖ遺伝子セグメントからより迅速に生成させる る必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての こと、および、その体細胞変異バージョンを含めた様々 使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫 なＤおよびＪ遺伝子セグメントとのＶ遺伝子セグメント 系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、幾 50 の再構成、特に、固有で有用なＣＤＲ３領域との再構成 ( 5 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 7 8 を有する有用なＢ細胞集団をより迅速に生成することが ン遺伝子座を提供し、様々な実施形態において、遺伝子 必要とされている。治療的に有用な抗体可変領域配列を 座は、内因性機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする 、選択されたＶ遺伝子セグメントから、例えば、既存の 配列を欠く。 改変動物において達成され得る数および多様性を増大さ 【０００９】 せて生成させ、それと同時に、遺伝子改変に起因し得る 限定される重鎖Ｖ遺伝子レパートリー、例えば、単一の 有害な変化を低減または排除し得る改善された生物系、 ＶＨ 遺伝子セグメントである重鎖Ｖ遺伝子レパートリー 例えば、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ 、または単一のＶＨ 遺伝子セグメントの複数の多型変異 など）が必要とされている。限定された選択Ｖ遺伝子セ 体から選択される重鎖Ｖ遺伝子レパートリーに由来する グメントであって、特定のヒト病原体を含め、選択され 重鎖可変ドメインをコードする遺伝子を再構成および形 た抗原に対するヒト抗体ベースの治療剤の製造において 10 成することが可能な遺伝子座を提供し、ここで、様々な 有用な同種のヒト重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメ 実施形態において、該遺伝子座は、内因性機能的ＡＤＡ インが含まれるがこれらに限定されないＶ遺伝子セグメ Ｍ６遺伝子またはその機能的断片を欠く。 ントに由来する抗体の可変配列をクローン選択するため 【００１０】 に拘束された体液性免疫系を有するように操作された改 内因性機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、ヒト免疫グロブ 善された生物系が必要とされている。当該技術分野にお リン配列、例えば、ヒトまたは（またはヒト／非ヒトキ いては、ヒト集団の負担となる病原体の排除を対象とす メラ）非ヒト免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結 るヒト抗体配列を含む免疫グロブリン配列を生成するの された（かつ、例えば、Ｄセグメントおよび／またはＪ に有用な改良された遺伝子改変マウスを作製することが セグメントと作動可能な連結にある）ヒトＶセグメント 依然として必要とされている。 を含む遺伝子座を含む改変免疫グロブリン遺伝子座を提 【０００７】 20 供する。単一のＶＨ 遺伝子セグメントの複数コピーを含 当該技術分野においては、単一のヒト可変遺伝子セグメ む改変遺伝子座であって、コピーのうちの１つ以上が多 ントに由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を含め、 型変異体を含み、非ヒト動物において機能的であるＡＤ ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶを中和する ＡＭ６タンパク質またはその断片をコードする異所性ヌ ことが可能な治療用抗体が必要とされている。また、単 クレオチド配列を包含する改変遺伝子座を提供する。非 一のヒトＶＨ セグメントに由来する重鎖であってＣＤＲ ヒト免疫グロブリン定常配列、例えば、マウス、ラット 配列の多様なセットを有する重鎖（同種のヒト軽鎖と共 またはヒト配列に作動可能に連結された、１つ以上のＤ に発現する重鎖を含む）のレパートリーを含む抗体を含 セグメントおよび１つ以上のＪセグメントと作動可能に め、ならびにヒトゲノム配列を非ヒト動物のゲノムに挿 連結された単一のＶＨ セグメントの複数コピーを含む改 入することに起因する望ましくない効果の回復を含め、 変遺伝子座を提供する。また、かかるヒト化遺伝子座を 有用な抗体を作製するためのさらなる方法および非ヒト 30 含む非ヒト動物であって、野生型妊性を有する非ヒト動 動物も必要とされている。例えば、ヒト治療薬の作製に 物も提供する。 おける使用のための体細胞変異した、およびクローン選 【００１１】 択した免疫グロブリン可変ドメインを生成するための組 Ｄ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメント 成物および方法を含め、免疫グロブリンベースの結合タ に作動可能に連結された単一のＶＨ セグメントを含む免 ンパク質のＣＤＲを選択するための方法であって、それ 疫グロブリン重鎖可変遺伝子座（例えば、導入遺伝子上 から選ぶための結合タンパク質の多様性を増強する、お の（ｏｎｅ よび免疫グロブリン可変ドメインの多様性を増強する方 重鎖可変遺伝子座、または内因性非ヒト動物重鎖可変遺 法が必要とされている。 伝子座における挿入もしくは置換としての免疫グロブリ 【発明の概要】 【課題を解決するための手段】 ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）免疫グロブリン ン重鎖可変遺伝子座）を含む非ヒト動物を提供する。様 40 々な実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメン 【０００８】 トは、上記非ヒト動物の上記内因性免疫グロブリン重鎖 概要 可変遺伝子遺伝子座において、１つ以上のＤ遺伝子セグ 限られた数の異なる重鎖可変領域遺伝子セグメント（す メントおよび／または１つ以上のＪ遺伝子セグメントに なわち、Ｖ遺伝子、ＶＨ 遺伝子、ＶＨ 遺伝子セグメント 作動可能に連結されている。様々な実施形態において、 、またはＶ遺伝子セグメント）、例えば、１つ以下、２ 上記非ヒト動物は、改変重鎖遺伝子座を含む雄非ヒト動 つ以下、もしくは３つ以下の異なるＶ遺伝子を含む遺伝 物において機能的なＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホ 子改変免疫グロブリン遺伝子座、あるいは、例えば、単 モログもしくはオルソログをコードする異所性ヌクレオ 一のコピーもしくは複数コピーで存在し、および／また チド配列をさらに含む。様々な実施形態において、異所 は１つ以上の多型を含む、１つ以下のＶ遺伝子セグメン 性ヌクレオチド配列は、上記単一のＶＨ セグメント、Ｄ トのファミリーメンバーを含む遺伝子改変免疫グロブリ 50 遺伝子セグメントまたはＪ遺伝子セグメントに隣接して ( 6 ) JP 9 2015-519076 A 2015.7.9 10 いる。様々な実施形態において、上記異所性ヌクレオチ の、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供す ド配列は、上記非ヒト動物のゲノム内の非免疫グロブリ る。１つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グ ン配列に隣接する。１つの実施形態において、上記異所 ロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であ 性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と同じ染 り、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ 色体上にある。１つの実施形態において、上記異所性ヌ ６活性を低減させるかまたは除去する。１つの実施形態 クレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と異なる染色 において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は 体上にある。 、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄 【００１２】 マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を保持するま それらの免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において たは持続させる。 、すべてのまたは実質的にすべての内因性免疫グロブリ 10 【００１６】 ンＶＨ セグメント（例えば、すべての機能的セグメント １つの態様では、Ｖセグメントの正体（ｉｄｅｎｔｉｔ 、またはほぼすべての機能的セグメント）を欠失させる ｙ）に関して限定された重鎖Ｖセグメントのレパートリ ように改変され、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重 ーを含み、１つ以上のＤセグメントおよび１つ以上のＪ 鎖可変領域遺伝子座において、ＤセグメントおよびＪセ セグメント、または１つ以上のＪセグメントを含む、改 グメントまたはＪセグメントに作動可能に連結されたヒ 変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。１つの実施 トＶＨ １−６９セグメント（またはヒトＶＨ １−２セグ 形態において、上記重鎖Ｖセグメントは、ヒトセグメン メント）を含む非ヒト動物を提供する。かかる遺伝子座 トである。１つの実施形態において、上記改変免疫グロ を含む非ヒト動物であって、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（ ブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠く 複数可）を欠く非ヒト動物も提供する。 。１つの実施形態において、上記改変重鎖遺伝子座は、 【００１３】 20 ＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を 非ヒト動物においてヒト免疫グロブリン配列を作製する さらに含む。特定の実施形態において、上記ヌクレオチ ための方法を提供する。様々な実施形態において、上記 ド配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座におい ヒト免疫グロブリン配列は、単一のヒトＶセグメント、 て上記Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントに隣接 例えば、ＶＨ １−６９またはＶＨ １−２、ならびに１つ している。 以上のＤセグメントおよびＪセグメントまたは１つ以上 【００１７】 のＪセグメントから本質的になる免疫グロブリンＶ配列 １つの実施形態において、上記改変遺伝子座は、非ヒト のレパートリーに由来する。非ヒト動物、非ヒト組織、 遺伝子座である。１つの実施形態において、上記非ヒト および非ヒト細胞において、ヒト免疫グロブリン配列を 遺伝子座は、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン配列 作製するための方法であって、上記ヒト免疫グロブリン で改変されている。１つの実施形態において、上記非ヒ 配列が病原体に結合する方法を提供する。 30 ト遺伝子座は、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン配 【００１４】 列と、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列とで改変 １つの態様では、非機能的内因性マウスＡＤＡＭ６タン されている。 パク質またはＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、内因性ＡＤＡ 【００１８】 Ｍ６遺伝子のノックアウトまたは内因性ＡＤＡＭ６遺伝 １つの実施形態において、上記限定は、１つのＶセグメ 子内での欠失）を生じさせる結果となる改変を含むマウ ントファミリーメンバーに対するものである。１つの実 スであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ 施形態において、上記１つのＶセグメントファミリーメ タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもし ンバーは、２コピー以上で存在する。１つの実施形態に くは断片をコードする核酸配列を含むマウスを作製する おいて、上記１つのＶセグメントファミリーメンバーは ための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提 、２つ以上の変異体（例えば、Ｖセグメントファミリー 供する。１つの実施形態において、上記マウスは、齧歯 40 メンバーの２つ以上の多型形態）として存在する。１つ 動物ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしく の実施形態において、上記１つのＶセグメントは、ヒト はホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌク Ｖセグメントファミリーメンバーである。１つの実施形 レオチド配列を含む；特定の実施形態において、上記齧 態において、上記１つのＶセグメントファミリーメンバ 歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質は、マウスＡＤＡＭ６タン ーは、その変異体に関してヒト集団内で観察される多数 パク質である。 の変異体で存在する。１つの実施形態において、上記Ｖ 【００１５】 セグメントファミリーメンバーは、表１から選択される １つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座 。１つの実施形態において、上記Ｖセグメントファミリ の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的 ーメンバーは、各Ｖセグメントについて、１つの対立遺 であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもし 伝子∼表１の右欄で示される数の対立遺伝子にわたる多 くはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するため 50 数の対立遺伝子で示されるとおりの多数の変異体で存在 ( 7 ) JP 11 2015-519076 A 2015.7.9 12 する。 つ以上の重鎖連結（ＪＨ ）遺伝子セグメントによる置換 【００１９】 を含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、 １つの態様では、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソロ 単一のオルソロガス免疫グロブリンＶＨ 遺伝子セグメン グもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異 ト、少なくとも１つのＤＨ 遺伝子セグメントおよび少な 所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する；マウス くとも１つのＪＨ 遺伝子セグメントの、内因性免疫グロ ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもし ブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形 くは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を 態において、上記種はヒトである。１つの実施形態にお 含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの いて、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可 遺伝子改変を含むマウスも提供する。１つの実施形態に 変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失は、 おいて、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしく 10 内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。 はホモログもしくは機能的断片をコードする上記内因性 特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の ヌクレオチド配列は、野生型マウスの内因性ＡＤＡＭ６ 喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる 遺伝子と比較して異所位置にある。 。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性 【００２０】 免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不 １つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座 活性化を含み、上記欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪 の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的 失を生じさせる結果とならない。不活性化は、内因性遺 であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもし 伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするように再 くはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するため 構成するのが実質的にできない内因性免疫グロブリン重 の方法を提供する。 鎖遺伝子座を生じさせる結果となる１つ以上の内因性遺 【００２１】 20 伝子セグメントの置換または欠失を含み得る。不活性化 １つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子 は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重 改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これ 鎖をコードするように再構成するのを不可能にする他の らの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖 改変を含み得、該改変は、内因性遺伝子セグメントの置 遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、 換または欠失を含まない。例示的な改変としては、例え 該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができ ば、部位特異的な組換え部位の正確な配置を使用する分 る。１つの実施形態において、上記雄マウスは、マウス 子技術（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ技術）によって媒介さ 子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精 れる染色体の逆位および／または転座が挙げられる。 させることができる精子を産生できる。 【００２４】 【００２２】 １つの実施形態において、上記遺伝子改変は、１つ以上 １つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子 30 の定常領域配列（例えば、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ 改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これ 遺伝子）に作動可能に連結された別の種（例えば、非マ らの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖 ウス種）の限られた数の、例えば、１つ以下、２つまた 遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、 は３つの異なる重鎖可変（ＶＨ ）遺伝子セグメント、１ 該雄マウスは妊性の低減を示し、および該マウスは、そ つ以上の重鎖多様性（ＤＨ ）遺伝子セグメントおよび１ の妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含 つ以上の重鎖連結（ＪＨ ）遺伝子セグメントを含有する む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マ ＤＮＡ断片の、上記マウスのゲノムへの挿入を含む。 ウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動 １つの実施形態において、上記ＤＮＡ断片は、抗体の重 してマウス卵子を受精させることができないことを特徴 鎖をコードする配列を形成するように再構成を受けるこ とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、 とができる。１つの実施形態において、上記遺伝子改変 ｉｎ は、単一のオルソロガス免疫グロブリンＶＨ 遺伝子セグ ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々 40 な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部 メント、少なくとも１つのＤＨ 遺伝子セグメントおよび 回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であ 少なくとも１つのＪＨ 遺伝子セグメントの、上記マウス るマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしく のゲノムへの挿入を含む。特定の実施形態において、上 はホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。 記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝 【００２３】 子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能 １つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免 的にする内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部 疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種（例えば、非 または一部の欠失を含み、該欠失はさらに、内因性ＡＤ マウス種）の限られた数、例えば、１つ以下、２つまた ＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施 は３つの異なる重鎖可変（ＶＨ ）遺伝子セグメント、１ 形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄 つ以上の重鎖多様性（ＤＨ ）遺伝子セグメントおよび１ 50 マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。 ( 8 ) JP 13 2015-519076 A 2015.7.9 14 【００２５】 のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子 １つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からのマ セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所 ウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは除去する改変を 性タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における非免 有する雄マウスが、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または 疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコー 除去に起因して、妊性低減（例えば、交配による子孫産 ドされている。１つの実施形態において、上記非免疫グ 生能力の高度低減）を示すまたは本質的に不妊性である ロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の ように、該改変を含み、さらに、異所性ＡＤＡＭ６配列 実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的 ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転 断片を含む、マウスを提供する。１つの態様において、 写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連づけられる。 マウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは除去する改変 10 １つの実施形態において、上記組織特異的発現は、生殖 は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変（例えば、挿 組織に存在する。１つの実施形態において、上記タンパ 入、欠失、置換など）である。１つの実施形態において ク質は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入され 、上記免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖 たゲノム配列によってコードされている。 遺伝子座である。 【００３０】 【００２６】 １つの実施形態において、上記マウスは、ヒトまたはキ １つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または メラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラット軽鎖（例え 喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って ば、ヒト可変、マウスまたはラット定常）とキメラヒト 進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生 可変／マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実 できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特 施形態において、上記マウスは、転写活性プロモーター 定の実施形態において、上記マウスの射精体積中の産生 20 、例えばＲＯＳＡ２６プロモーター、に作動可能に連結 された精子細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％ されているキメラヒト可変／ラットまたはマウス定常軽 、９８％または９９％は、交尾後にｉｎ ｖｉｖｏで卵 鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施 管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させる 形態において、上記キメラヒト／マウスまたはラット軽 ことができない。 鎖導入遺伝子は、上記マウスの生殖細胞系内に再構成ヒ 【００２７】 ト軽鎖可変領域配列を含む。 １つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または 【００３１】 喪失は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２およ １つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列 び／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合 は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺 体を形成できないことまたは実質的に形成できないこと 伝子座内にある。特定の実施形態において、上記免疫グ を含む。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の喪 30 ロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施 失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させ 形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ 、 ることが実質的にできないことを含む。 少なくとも１つのヒトＤＨ および少なくとも１つのヒト 【００２８】 ＪＨ 遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において １つの態様において、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を 、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ 、２７のヒトＤ 欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能 Ｈ 性を付与するタンパク質（またはタンパク質をコードす トを含む。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレ る異所性ヌクレオチド配列）を含むマウスを提供する。 オチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫 １つの実施形態において、上記マウスは雄マウスであり グロブリン遺伝子座内にある。１つの実施形態において 、上記機能性は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠い ているマウスと比較して強化された妊性を含む。 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグメン 、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座 40 である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子 【００２９】 座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。１つの実施形態に １つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウ おいて、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの スの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあ 生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。 るゲノム配列によってコードされている。特定の実施形 【００３２】 態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝 １つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠い 子座である。もう１つの特定の実施形態において、上記 ているマウスであって、マウスＡＤＡＭ６機能の喪失を 重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ 、少なくとも１つのヒ 補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。 トＤＨ および少なくとも１つのヒトＪＨ 遺伝子セグメン １つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列 トを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重 は、上記マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含 鎖遺伝子座は、１つのヒトＶＨ 遺伝子セグメント、２７ 50 有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を ( 9 ) JP 15 2015-519076 A 2015.7.9 16 付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記 を産生する。 マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡ 【００３８】 ＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ 能力を、上記マウスに付与する。１つの実施形態におい 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 て、上記配列は、上記マウスに、マウス子宮からマウス マウスは、該機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異 卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる 所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて、匹敵する 能力を付与する。 期間内に約１．５倍、約２倍、約３倍または約４倍以上 【００３３】 の同腹子を産生する。 １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ 【００３９】 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 10 １つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードす マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月 る非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約５０％、６ 提供し、上記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスＡ ０％、７０％、８０％または９０％の数の同腹子を産生 ＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログ する。 もしくは機能的断片の挿入を含む。１つの実施形態にお 【００３４】 いて、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グ １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ ロブリン配列を含む。１つの実施形態において、上記配 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。１つの実施 マウスは、６ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実 形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配 質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配さ 列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、単一 せた、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き該異所性 20 のＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ 遺伝子セグメ ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまた ントおよび１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメントを含む；１ は類似系統のマウスに比べて、少なくとも約１．５倍、 つの実施形態において、上記配列は、１つ以上のＶＬ 遺 約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍 伝子セグメントおよび１つ以上のＪＬ 遺伝子セグメント 、約８倍または約１０以上後代を産生する。 を含む。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ 、１ 【００３５】 つ以上のＤＨ および１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメント、 １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ または１つ以上のＶＬ およびＪＬ 遺伝子セグメントは、 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 再構成されない。１つの実施形態において、上記単一の マウスは、４または６ヶ月の交配期間中に、該機能的内 ＶＨ 、１つ以上のＤＨ および１つ以上のＪＨ 遺伝子セグ 因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチ メント、または１つ以上のＶＬ およびＪＬ 遺伝子セグメ ド配列が無い、同じ期間交配させたマウスより、同腹子 30 ントは、再構成される。１つの実施形態において、上記 あたり平均少なくとも約２倍、３倍、４倍多い数の子を 単一のＶＨ 、１つ以上のＤＨ および１つ以上のＪＨ 遺伝 産生する。 子セグメント、または１つ以上のＶＬ およびＪＬ 遺伝子 【００３６】 セグメントの再構成後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしく 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 は機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列を マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約５∼ そのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成 ６時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性 後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはその ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配 ホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコー 列が無いマウスに比べて少なくとも１０倍、少なくとも ドする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む ２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なく 40 。１つの実施形態において、再構成後、上記マウスは、 とも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少 マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオ なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０ ルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１ 倍または１２０倍以上である卵管移動を表わす精子を産 つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態に 生する。 おいて、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそ 【００３７】 のホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ １つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６ 細胞内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは 遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記 、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオ マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスか ルソログもしくは機能的断片を非Ｂ細胞内に含む。 らの精子にほぼ等しい効率で約６時間以内に子宮を通り 【００４０】 抜けて卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子 50 １つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域また ( 10 ) JP 17 2015-519076 A 2015.7.9 18 はその機能的断片を内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺 び下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログも 伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて しくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実 機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。 施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメ １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖 ントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態 可変領域は、多型ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。１ において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可 、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的 変領域は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含む。 である上記マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもし １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖 くはホモログもしくは断片をコードする上記配列は、ヒ 可変領域は、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントを含む。 【００４１】 トＶＨ 遺伝子セグメント間にある；１つの実施形態にお 10 いて、上記マウスは、１つのヒトＶＨ 遺伝子セグメント １つの実施形態において、上記雄マウスは、単一の未改 を含み、上記配列は、上記ＶＨ 遺伝子セグメントの５’ 変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログも の位置にある；１つの実施形態において、上記配列は、 しくはホモログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｈｏｍｏｌ 上記ＶＨ 遺伝子セグメントの３’の位置にある；１つの ｏｇ）もしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座 ｏｆ 実施形態において、上記配列は、上記ＶＨ 遺伝子セグメ に含む。 ントと上記最初のＤＨ 遺伝子セグメントとの間の位置に 【００４２】 ある。特定の実施形態において、上記ＤＨ 遺伝子セグメ １つの実施形態において、上記雄マウスは、ＡＤＡＭ６ ントは、上記最初のＤＨ 遺伝子セグメントである。１つ 機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスＡ の実施形態において、上記マウスは、２つのＶＨ 遺伝子 ＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログも セグメントを含み、上記配列は、上記２つのＶＨ 遺伝子 しくは機能的断片を含む。 20 セグメント間の位置にある；１つの実施形態において、 【００４３】 上記配列は、ＶＨ 遺伝子セグメントとＤＨ 遺伝子セグメ １つの実施形態において、上記雄マウスは、上記内因性 ントとの間の位置にある。特定の実施形態において、上 マウスＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所に近いマウスゲノム 記ＤＨ 遺伝子セグメントは、上記最初のＤＨ 遺伝子セグ 内の場所、例えば、Ｖ遺伝子セグメント配列の３’およ メントである。 び最初のＤ遺伝子セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列ま 【００４５】 たはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断 １つの実施形態において、上記雄マウスは、野生型雄マ 片を含む。特定の実施形態において、上記雄マウスは、 ウスと同じまたは実質的に同じ内因性免疫グロブリン遺 ヒトＶＨ 遺伝子セグメントの３’およびヒトＤＨ 遺伝子 伝子座内の位置にあるＡＤＡＭ６配列またはそのホモロ セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログ グもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定 もしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。もう１ 30 の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、抗体の重 つの特定の実施形態において、上記雄マウスは、ヒトＶ 鎖をコードできない。特定の実施形態において、上記内 遺伝子セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列またはその 因性遺伝子座は、それが抗体の重鎖をコードできないよ ホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む うにする上記雄マウスのゲノム内の場所に配置される。 。もう１つの特定の実施形態において、上記雄マウスは 様々な実施形態において、上記雄マウスは、ヒト免疫グ 、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ 遺 ロブリン遺伝子セグメントと同じ染色体上にあるＡＤＡ 伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメント Ｍ６配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、機能的ＡＤＡ を含むキメラ重鎖遺伝子座の５’にＡＤＡＭ６配列また Ｍ６タンパク質をコードする。 はそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片 【００４６】 を含む。１つの実施形態において、上記キメラ重鎖遺伝 １つの態様では、非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子、ま 子座は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメント、２７のヒ 40 たは内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失をその生殖細胞系内 トＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグ に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マ メントを含む。１つの実施形態において、上記キメラ重 ウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させるこ 鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメント、２７ とができる。１つの実施形態において、上記マウスは、 のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子 雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子 セグメントを含む。 またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的 【００４４】 断片の染色体外コピーを含む。１つの実施形態において １つの実施形態において、上記雄マウスは、免疫グロブ 、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的である異所性 リン可変遺伝子セグメントまたは免疫グロブリン多様性 マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくは 遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６ ホモログもしくは機能的断片を含む。 配列の転写方向に関して）上流、下流、または上流およ 50 【００４７】 Ｈ ( 11 ) JP 19 2015-519076 A 2015.7.9 20 １つの態様において、内因性マウスＡＤＡＭ６機能を低 形態において、雌マウスと交配するとき、上記雄マウス 減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしく は、１つまたは２つの内因性未改変ＡＤＡＭ６対立遺伝 は一部機能的である内因性未改変対立遺伝子（例えば、 子を有するマウスの子孫産生能力の、１つの実施形態で ヘテロ接合体）によってあるいは雄マウスにおいて機能 は少なくとも２５％、１つの実施形態では少なくとも３ 的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモ ０％、１つの実施形態では少なくとも４０％、１つの実 ログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの 施形態では少なくとも５０％、１つの実施形態では少な 発現によってもたらされる、少なくともいくらかのＡＤ くとも６０％、１つの実施形態では少なくとも７０％、 ＡＭ６機能性を含むマウスを提供する。 １つの実施形態では少なくとも８０％、１つの実施形態 【００４８】 では少なくとも９０％、および１つの実施形態では該マ １つの実施形態において、上記マウスは、機能的ＡＤＡ 10 ウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を Ｍ６を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫 示す。 を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡ 【００５０】 Ｍ６機能を含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡ １つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスから Ｍ６機能は、マウスＡＤＡＭ６またはそのホモログもし の精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウ くはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性 ス卵子を受精させることを可能にするために十分なＡＤ ヌクレオチド配列の存在によって付与される。１つの実 ＡＭ６（またはそのオルソログもしくはホモログもしく 施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、内因性免疫グ は機能的断片）を発現する。 ロブリン遺伝子座に存在する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子に 【００５１】 よって付与され、該内因性免疫グロブリン遺伝子座は、 １つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能性は、マ 抗体の重鎖をコードできない。雄マウスにおいて機能的 20 ウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される であるＡＤＡＭ６ホモログもしくはオルソログまたはそ （例えば、上記核酸は、マウス染色体にランダムに組み の断片としては、十分な内因性マウスＡＤＡＭ６活性が 込まれている；または例えば、上記核酸を特定の場所に 無い雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、 ターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコ 例えば、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスにおいて観察さ ンビナーゼ媒介（例えば、Ｃｒｅ媒介）挿入もしくは相 れる能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げ 同組換えにより、特定の場所に配置されている）。１つ られる。この意味で、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスに の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は上記マウス は、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でな の染色体とは異なる核酸上に存在する（例えば、上記Ａ い、すなわち、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もし ＤＡＭ６配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に くはＡＤＡＭ６ｂ）をまったく発現しない、または野生 、例えば、発現構築物、ベクター、ＹＡＣ、導入染色体 型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するの 30 などに存在する）。 に不十分であるレベルでＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよ 【００５２】 び／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）を発現するマウスが含まれ １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の る。機能の喪失は、例えば、上記遺伝子座の構造遺伝子 改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マ （すなわちＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディ ウスは、免疫グロブリン重鎖配列の少なくとも一部分、 ング領域）の改変、または上記遺伝子座の調節領域（例 例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウ えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子に対して５’のまたはＡＤＡ スは、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を Ｍ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域の３’の 含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウ 配列であって、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写、ＡＤＡＭ６ スのＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは根絶する。１つ ＲＮＡの発現またはＡＤＡＭ６タンパク質の発現を全部 の実施形態では、上記マウスは、ＡＤＡＭ６活性をコー または一部制御する配列）の改変に起因し得る。様々な 40 ドする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または 実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオル 雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機 ソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの 能しないＡＤＡＭ６を発現するように、改変される。１ 精子（または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞） つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能 可能にするものである。 的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。１つ 【００４９】 の実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡ １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン可変 Ｍ６活性を維持し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座 領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マ が抗体の重鎖をコードできないようにする。特定の実施 ウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに 形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン 付与するのに十分なＡＤＡＭ６活性を含み、１つの実施 50 重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードできないようにする ( 12 ) JP 21 2015-519076 A 2015.7.9 22 染色体の逆位およびまたは転座を含む。 Ｌ 【００５３】 ＪＬ 遺伝子セグメント）での置換である。 １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の 【００５６】 改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改 １つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座 変は、該遺伝子座のＡＤＡＭ６配列から発現するＡＤＡ の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の Ｍ６活性を低減させるまたは除去するものであり、およ 遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけ び該マウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソ るものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生 ログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々 殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性 な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質または ＡＤＡＭ６発現の結果として生ずる。特定の実施形態に その断片は、異所性ＡＤＡＭ６配列によってコードされ 10 おいて、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２ ている。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タン ６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非免 パク質またはその断片は、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子 疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性で から発現する。様々な実施形態において、上記マウスは ある。 、第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的Ａ 【００５７】 ＤＡＭ６の発現を低減させるまたは除去する第一の改変 １つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座 を含む第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、第二の の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺 免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６ 伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子における の発現を実質的に低減させないまたは除去しない第二の ものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、上記第一の 改変を含む第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子とを含 免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６の む。 20 遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶＬ および／または 発現の結果として生じる。１つの実施形態において、上 【００５４】 記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖 １つの実施形態において、上記第二の改変は、最後のマ 対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリ ウスＶ遺伝子グメントの（マウスＶ遺伝子セグメントの ン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤ 転写方向性に対して）３’にあり、およびマウス（また ＡＭ６機能は、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝 はキメラヒト／マウス）免疫グロブリン重鎖定常遺伝子 子での異所性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じる。 またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス： 【００５８】 ＣＨ １および／またはヒンジおよび／またはＣＨ ２およ １つの態様では、ＡＤＡＭ６のヘテロ接合またはホモ接 び／またはＣＨ ３をコードする核酸配列）の（定常配列 合ノックアウトを含むマウスを提供する。１つの実施形 の転写方向性に対して）５’にある。 態において、上記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グ 【００５５】 30 ロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒト １つの実施形態において、上記改変は、第一のＡＤＡＭ もしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グ ６対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫 ロブリン配列をさらに含む。１つの実施形態において、 グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および 上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス重鎖免疫 上記ＡＤＡＭ６機能は、機能的ＡＤＡＭ６をコードする グロブリン遺伝子座に存在する。１つの実施形態におい 第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子 て、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス免疫 での内因性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じ、上記第 グロブリン重鎖遺伝子座にヒト重鎖可変遺伝子配列を含 二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、Ｖ、Ｄおよび／ む。１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変遺伝子 またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも１つの改変を含 配列は、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座 む。特定の実施形態において、上記Ｖ、Ｄおよびまたは の内因性マウス重鎖可変遺伝子配列を置換する。 Ｊ遺伝子セグメントの上記少なくとも１つの改変は、欠 40 【００５９】 失、単一のヒトＶＨ 、１つ以上のＤＨ および／または１ １つの態様では、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座から つ以上のＪＨ 遺伝子セグメントによる置換、ラクダ科動 機能的内因性マウスＡＤＡＭ６を発現できないマウスを 物ＶＨ （またはＶＨ ）、ＤＨ および／またはＪＨ 遺伝 提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、該 子セグメントによる置換、ヒト化またはラクダ化ＶＨ （ マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはその機能 またはＶＨ ）、ＤＨ および／またはＪＨ 遺伝子セグメ 的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施 ントによる置換、重鎖配列の軽鎖配列による置換、なら 形態において、上記異所性核酸配列は、ＡＤＡＭ６ノッ びにその組み合わせである。１つの実施形態において、 クアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示 上記少なくとも１つの改変は、上記重鎖遺伝子座におけ される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質 る１つ以上のＶＨ 、ＤＨ および／またはＪＨ 遺伝子セグ をコードする。特定の実施形態において、上記異所性核 メントの欠失ならびに１つ以上のＶＬ および／またはＪ 50 酸配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。 Ｈ Ｈ ( 13 ) JP 23 2015-519076 A 2015.7.9 24 【００６０】 １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモ １つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠 ーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実 いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能を 施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤ 付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。１つ ＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関 の実施形態において、上記核酸配列は、内因性マウスＡ して）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤ ＤＡＭ６配列またはその機能的断片を含む。１つの実施 ＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわた 形態において、上記内因性マウスＡＤＡＭ６配列は、野 る（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの 生型マウスにおける最も３’側の（ｔｈｅ ３’−ｍｏ 特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーター ｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ は、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌ ＶＨ ）と最も５’側の（ｔｈｅ クレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約 ５’−ｍｏｓｔ）マウ 10 ス免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント（ＤＨ ）との ０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる 間にあるＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂコード配列を 断片である。 含む。 【００６５】 【００６１】 １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモ １つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスＡＤ ーターは、配列番号７３のプロモーターである。特定の ＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、お 実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーター よび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断 は、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写 片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／も 方向に関して）直ぐ上流の配列番号７３の核酸配列であ しくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしく って、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号７ は複数）は、プロモーターに作動可能に連結されている 20 ３の端にわたる核酸配列を含む。もう１つの特定の実施 。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ヒト 形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡ プロモーターである。１つの実施形態において、上記プ Ｍ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド ロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。 以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約０．５ｋｂ 特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーター 、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる断片である は、最も５’側のマウスＤＨ 遺伝子セグメントに最も近 。 い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側 【００６６】 のＤＨ 遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間に １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモ ある配列を含み、ここで、５’は、マウス免疫グロブリ ーターは、配列番号７７のプロモーターである。特定の ン遺伝子の転写方向に関して示される。１つの実施形態 実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、Ａ において、上記プロモーターは、ウイルスプロモーター 30 ＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に である。特定の実施形態において、上記ウイルスプロモ 関して）直ぐ上流の配列番号７７の核酸配列であって、 ーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号７７の端 ーである。１つの実施形態において、上記プロモーター にわたる核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態に は、ユビキチンプロモーターである。 おいて、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａ 【００６２】 の開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内か １つの実施形態において、上記プロモーターは、誘導性 らＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約０．５ｋｂ、１ｋ プロモーターである。１つの実施形態において、上記誘 ｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる断片である。 導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。 【００６７】 １つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、 １つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６ 生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において 40 欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内 、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ ｂ配列またはその機能的断片（単数もしくは複数）の発 野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片 現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発 を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはそ 生調節される。 の断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精 【００６３】 させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウス １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよ に付与する。 び／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａ 【００６８】 および／または配列番号２（ｓｅｑｕｅｎｃｅ １つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６ ＩＤ ＳＥＱ ＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。 【００６４】 欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内 50 に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ ( 14 ) JP 25 2015-519076 A 2015.7.9 26 野生型の妊性に回復させる、配列番号７３またはその断 つ以上のヒトＪＨ 遺伝子セグメントでの、すべてのまた 片を含む。１つの実施形態において、配列番号７３また は実質的にすべての内因性ＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ 遺伝子 はその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を セグメントの置換ならびに内因性ＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ 受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マ 遺伝子遺伝子座における置換を含み、この場合のマウス ウスに付与する。 は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配 【００６９】 列を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡ １つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６ Ｍ６タンパク質をコードする異所性配列は、上記単一の 欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内 ヒトＶＨ 遺伝子セグメントの上流または５’に配置され に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ る。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスＡ 野生型の妊性に回復させる、配列番号７７またはその断 10 ＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、上記単 片を含む。１つの実施形態において、配列番号７７また 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントの下流または３’に配置 はその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を される。 受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マ もう１つの特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡ ウスに付与する。 Ｍ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在する上 【００７０】 記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントと第一のヒトＤＨ 遺 １つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内 伝子セグメントとの間に配置される。もう１つの特定の 因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性マウスＶＨ 遺伝 実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質 子セグメントの、ヒトＶＨ 遺伝子セグメントによる置換 的にすべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの欠失、およ と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タ び単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントによる置換を含み、 ンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしく 20 上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌ は断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマ クレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ １−６９ ウスを提供する。 の下流かつヒト遺伝子セグメントＤＨ １−１の上流に配 【００７１】 置されている。もう１つの特定の実施形態において、上 １つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡ 記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ Ｍ６遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレ Ｈ オチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を 子セグメントによる置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６ 含み、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒ をコードするヌクレオチド配列を含み、および上記マウ ト遺伝子セグメントＶＨ １−２の下流かつヒト遺伝子セ スＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチ グメントＤＨ １−１の上流に配置されている。 ド配列は、該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグ 30 【００７３】 メントをコードするヌクレオチド配列内にある、または 特定の実施形態において、上記マウスは、単一のＶＨ 遺 該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコ 伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、す ードするヌクレオチド配列に直接隣接する。 べてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ 遺伝子セグメ 【００７２】 ントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を １つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトＶ コードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒトＶ Ｈ 遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での Ｈ 遺伝子セグメントの欠失、および単一のヒトＶＨ 遺伝 遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内に 、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ 遺伝子セ あるか、該単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントをコードす グメントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク るヌクレオチド配列に直接隣接する。 質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒ 【００７４】 トＶＨ 遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列 40 １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパ 内にあるか、該単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントをコー ク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウ ドするヌクレオチド配列に直接隣接する。１つの実施形 スのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。１つの実施形 態において、上記マウスは、内因性ＤＨ 遺伝子遺伝子座 態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコード における１つ以上のヒトＤＨ 遺伝子セグメントでの、１ する異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの染色体外 つ以上の内因性ＤＨ 遺伝子セグメントの置換をさらに含 に存在する。 む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性Ｊ 【００７５】 遺伝子遺伝子座における１つ以上のヒトＪＨ 遺伝子セ １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の グメントでの、１つ以上の内因性ＪＨ 遺伝子セグメント 改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に の置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マ 作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列を ウスは、単一のヒトＶＨ 、１つ以上のヒトＤＨ および１ 50 含むＢ細胞を発現するマウスを提供し、該Ｂ細胞は、雄 Ｈ ( 15 ) JP 27 2015-519076 A 2015.7.9 28 マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオル １つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性マ ソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝 ウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト 子をそのゲノム内（例えば、Ｂ細胞染色体上）に含む。 免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含み； １つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列 該内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝 に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列 子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マ は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；マウス重鎖 ウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質 Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖ またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を および／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において 発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マ 、上記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ １、ヒンジ、Ｃ ウスを提供する。 Ｈ ２、ＣＨ ３およびその組み合わせからなる群より選択 10 【００８０】 されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。 １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパ 【００７６】 ク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外の １つの態様では、マウスであって、機能的にサイレンシ ものである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤ ングされた内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子を含み、Ａ ＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は ＤＡＭ６機能が上記マウスにおいて保持されており、１ 、上記マウスのゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込 つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入を まれている。特定の実施形態において、上記１つ以上の さらに含み、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子 遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。 セグメントが、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、１つ 【００８１】 以上のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒト １つの態様では、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セ ＪＨ 遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。１つの 20 グメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロ 実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン ブリン重鎖配列を改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖 遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメン 遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおい ト、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪ て機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する Ｈ 遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、 。 上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは 【００８２】 、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ 遺 １つの実施形態において、上記マウスは、一つのヒトＶ 伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグメントを 遺伝子セグメント、複数のＤ遺伝子セグメント、および 含む。 複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態にお 【００７７】 いて、上記Ｄ遺伝子セグメントは、ヒトＤ遺伝子セグメ １つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的に 30 ントである。１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セ サイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み グメントは、ヒトＪ遺伝子セグメントである。１つの実 、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子 施形態において、上記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配 セグメントの、単一のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域 列をさらに含み、該ヒト化は、ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２ 遺伝子セグメントによる置換をさらに含み、機能的内因 、ＣＨ ３およびその組み合わせから選択される配列の置 性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き、および雄マウスにおいて 換を含む。特定の実施形態において、上記重鎖は、上記 機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオ ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒ ルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所 トＪ遺伝子セグメント、ヒトＣＨ １配列、ヒトまたはマ 性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供す ウスヒンジ配列、マウスＣＨ ２配列、およびマウスＣＨ る。 【００７８】 ３配列に由来する。もう１つの特定の実施形態において 40 、上記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。 １つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子 【００８３】 座または配列を欠き、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座 １つの実施形態において、上記マウスは、５’および３ またはマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列の機能的 ’が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに隣接 断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウス するＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において であって、異性のマウスと交配して、該異所性ＡＤＡＭ 、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、 ６遺伝子座または配列を含む後代を産生することができ 抗体の重鎖をコードできない。特定の実施形態において るマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マ 、上記マウスの上記ＡＤＡＭ６遺伝子は、野生型マウス ウスは雄である。１つの実施形態において、上記マウス の場合と同じ位置にあり、上記マウスの上記内因性免疫 は雌である グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座は、抗体の重鎖をコ 【００７９】 50 ードするように再構成できない。 ( 16 ) JP 29 2015-519076 A 2015.7.9 30 【００８４】 いて、ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方 １つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、 向に関して５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いて （該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、 ＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。 上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコー 【００９３】 ドする配列に隣接する。 １つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡ 【００８５】 Ｍ６配列またはその機能的断片に並置または隣接する単 １つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。 （該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）３’が、 【００９４】 上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコー ドする配列に隣接する。 １つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡ 10 Ｍ６配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒ 【００８６】 トＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含む。 １つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、 【００９５】 （該Ｄ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、 １つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡ 上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコー Ｍ６配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒ ドする配列に隣接する。 トＶＨ １−２遺伝子セグメントを含む。 【００８７】 【００９６】 １つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、 １つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトＶ （該Ｊ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、 Ｈ 上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコー またはその機能的断片は、内因性免疫グロブリン重鎖遺 ドする配列に隣接する。 20 遺伝子セグメントを含み、上記マウスＡＤＡＭ６配列 伝子セグメントに並置または隣接しており、上記内因性 【００８８】 免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖を １つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的で コードするように再構成できない。 あるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫 【００９７】 グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写方向 １つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的で を基準して）最も５’側のＤ遺伝子セグメントの５’お あるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、マウスＡＤＡ よび単一のＶ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチ Ｍ６配列またはその機能的断片である。 ド配列の発現の結果として生ずる。 【００９８】 【００８９】 １つの態様では、非再構成Ｂ細胞系列のＤＮＡ保有細胞 １つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的で 内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオ あるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫 30 ルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を グロブリン遺伝子座の（Ｄ遺伝子セグメントの転写方向 含むが、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞内 を基準して）最も５’側のＪ遺伝子セグメントの５’お に該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオ よび最も３’側のＤ遺伝子セグメントの３’にあるヌク ルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を レオチド配列の発現の結果として生ずる。 含まないマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（または 【００９０】 そのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片） １つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的で をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野 あるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫 生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内 グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写方向 の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウ を基準して）上記単一のヒトＶ遺伝子セグメントの５’ にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。 スＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログ 40 もしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、再構成 【００９１】 Ｂ細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべ １つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、マ てのＤＮＡ保有細胞に存在する；１つの実施形態におい ウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片、マウスＡ て、上記核酸配列は、上記マウスの生殖細胞系細胞には ＤＡＭ６ａ配列またはその機能的断片、およびその組み 存在するが、再構成Ｂ細胞の染色体には存在しない。 合わせから選択される配列を含む。 【００９９】 【００９２】 １つの態様では、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含む １つの実施形態において、上記単一のヒトＶ遺伝子セグ Ｂ細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべての メントの上流（５’）または下流（３’）に位置するヌ ＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモ クレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントに対して ログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコード 反対の転写配向に配置されている。特定の実施形態にお 50 する核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ ( 17 ) JP 31 2015-519076 A 2015.7.9 32 ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機 少なくとも１つの重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重 能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ 鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できないよ 遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる うにし、少なくとも１つの内因性免疫グロブリン重鎖対 、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において 立遺伝子内にある内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持す 、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくは る。 オルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列 【０１０５】 は、上記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸 １つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グ 上にある。１つの実施形態において、上記再構成免疫グ ロブリン重鎖対立遺伝子の少なくとも１つから、再構成 ロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。１ 内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現で つの実施形態において、上記染色体は、野生型マウスに 10 きず、および該マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子 おいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免 からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。特定の実施形態 疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。 において、上記マウスは、２つの内因性免疫グロブリン 【０１００】 重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重鎖遺伝子セグメン １つの態様では、ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログ トを含む機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、 もしくはホモログをそのゲノムに含むＢ細胞を含む、遺 １つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６ 伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、 タンパク質を発現する。 上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモ 【０１０６】 ログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。特定の実 １つの実施形態において、上記マウスは、各内因性重鎖 施形態において、上記重鎖遺伝子座は、抗体の重鎖をコ 対立遺伝子から機能的重鎖を発現できず、および該マウ ードするように再構成できない内因性免疫グロブリン重 20 スは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（マウ 鎖遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、 ス重鎖遺伝子座の転写方向に関して）上流１、２、３、 上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモ ４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、 ログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にあ ８０、９０、１００、１１０または１２０Ｍｂｐ以内ま る。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は、 たは１２０ｋｂ超にある機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子を 異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にあ 含む。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６ る。特定の実施形態において、上記異種プロモーターは 対立遺伝子は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座 、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形 に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セ 態において、Ｂ細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそ グメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメント のオルソログもしくはホモログを発現する。 との間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの 【０１０１】 30 間などに）ある。特定の実施形態において、上記機能的 １つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の９０％ ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、最後のマウスＶ遺伝子セグメ 以上は、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タン ントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から パク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまた １００ｋｂ遺伝子間配列内にある。 はその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態 【０１０７】 において、上記マウスは雄マウスである。 １つの態様では、１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝 【０１０２】 子における改変を含むマウスを提供する。 １つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記Ａ 【０１０８】 ＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを １つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、 含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む １つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の少なくとも１ 。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記 40 つから、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できないよ ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログ うにする。特定の実施形態において、上記マウスは、上 を含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を 記内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子それぞれから機能的ＡＤ 含まない。 ＡＭ６タンパク質を発現できない。 【０１０３】 【０１０９】 １つの態様では、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖 １つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤ 対立遺伝子における改変を含むマウスであって、上記改 ＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発 変が１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持する 現できず、および該マウスは、異所性ＡＤＡＭ６配列を マウスを提供する。 含む。 【０１０４】 【０１１０】 １つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、 50 １つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤ ( 18 ) JP 33 2015-519076 A 2015.7.9 34 ＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発 リン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント内にある機能 現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重 的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、 鎖定常領域配列の（マウス重鎖遺伝子座の転写の方向に 上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む内因性 対して）上流１、２、３、４、５、１０、２０、３０、 重鎖遺伝子座を含み、上記内因性重鎖遺伝子座は、８９ ４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０ のＶ遺伝子セグメント、１３のＤ遺伝子セグメントおよ または１２０ｋｂ以内または１２０ｋｂ超にある異所性 び４のＪ遺伝子セグメントを含み、上記内因性重鎖遺伝 ＡＤＡＭ６配列を含む。特定の実施形態において、上記 子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするよう 異所性ＡＤＡＭ６配列は、上記内因性免疫グロブリン重 に再構成できず、上記ＡＤＡＭ６遺伝子座は、上記マウ 鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つの スにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質をコード Ｖ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子 10 する。 セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグ 【０１１４】 メントとの間などに）ある。特定の実施形態において、 １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄおよ 上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、最後のマウスＶ遺伝子セ びＪ遺伝子セグメントが無いマウスであって、該マウス グメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０ のＢ細胞の大部分がＡＤＡＭ６配列またはそのオルソロ から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定 グもしくはホモログを含むマウスを提供する。 の実施形態において、上記内因性９０から１００ｋｂ遺 【０１１５】 伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配 １つの実施形態において、上記マウスには、２つ以上の 列が、単一のヒトＶ遺伝子セグメントと最初のヒトＤ遺 Ｖ遺伝子セグメント、２つ以上のＤ遺伝子セグメント、 伝子セグメントとの間に配置されている。もう１つの特 ２つ以上のＪ遺伝子セグメントおよびその組み合わせか 定の実施形態において、上記内因性９０から１００ｋｂ 20 ら選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメン 遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６ トが無い。１つの実施形態において、上記マウスには、 配列が、上記単一のヒトＶ遺伝子セグメントの５’また 少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、 は上流に配置されている。 少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、 【０１１１】 少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、お １つの態様では、２つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝 よびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖 子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。１つの態 遺伝子セグメントが無い。１つの実施形態において、上 様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって 記マウスには、約３メガ塩基の上記内因性免疫グロブリ 、非機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子または内因性ＡＤＡＭ ン重鎖遺伝子座を含む染色体１２由来のゲノムＤＮＡ断 ６対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マ 片が無い。特定の実施形態において、上記マウスには、 ウスを提供する。 30 すべての機能的内因性重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメ 【０１１２】 ントが無い。特定の実施形態において、上記マウスには １つの態様では、抗体の重鎖をコードするように再構成 、８９のＶＨ 遺伝子セグメント、１３のＤＨ 遺伝子セグ できない内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄおよびまたは メントおよび４つのＪＨ 遺伝子セグメントが無い。 Ｊ遺伝子セグメントを含むマウスであって、上記マウス 【０１１６】 のＢ細胞の大部分が機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含むマウ １つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を スを提供する。 含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖 【０１１３】 遺伝子座への改変が、１つ以上のマウス免疫グロブリン １つの実施形態において、上記マウスは、抗体の機能的 可変領域配列の、１つの非マウス免疫グロブリン可変領 重鎖をコードするように再構成できないインタクトな内 域配列による置換を含むものであるマウスであって、マ 因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメン 40 ウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含む トを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少 マウスを提供する。 なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少 好ましい実施形態において、上記内因性免疫グロブリン なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少 重鎖遺伝子座のＤＨ およびＪＨ 配列ならびに少なくとも なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およ ３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０ びその組み合わせを含み、上記少なくとも１つ、かつ８ 、少なくとも６０または少なくとも８０のＶＨ 配列は、 ９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１ 非マウス免疫グロブリン重鎖配列によって置換されてい ３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４ る。さらなる好ましい実施形態において、上記内因性免 以下のＪ遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコ 疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ 、ＪＨ およびすべての ードするように再構成できない。特定の実施形態におい ＶＨ 配列は、単一の非マウス免疫グロブリンＶ遺伝子セ て、上記マウスは、上記インタクトな内因性免疫グロブ 50 グメント配列、１つ以上のＤ遺伝子セグメント配列およ ( 19 ) JP 35 2015-519076 A 2015.7.9 36 び１つ以上のＪ遺伝子セグメント配列によって置換され 物の導入遺伝子上に存在する。 ている。上記非マウス免疫グロブリン配列は、再構成さ 【０１１９】 れていない場合がある。好ましい実施形態において、上 １つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝 記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全な 子セグメントは、ＶＨ １−６９遺伝子セグメントである 非再構成ＤＨ およびＪＨ 領域ならびに単一の非再構成Ｖ 。１つの実施形態において、上記ＶＨ １−６９遺伝子セ 配列を含む。さらなる好ましい実施形態において、上 グメントは、配列番号３７を含む。１つの実施形態にお 記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全可 いて、上記ＶＨ １−６９遺伝子セグメントは、配列番号 変領域（すなわち、互いに結合して、重鎖可変領域をコ ３７に由来する。１つの実施形態において、上記ＶＨ １ ードする配列を形成するＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ セグメン −６９遺伝子セグメントは、配列番号３７と少なくとも トを含有する再構成可変領域）を形成することができる 10 ８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なく 。上記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり とも９５％、または少なくとも９８％同一である。 、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト配列である 【０１２０】 場合がある。 １つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝 【０１１７】 子セグメントは、配列番号３７のヌクレオチド配列によ １つの態様では、単一の機能的ヒトＶセグメントを含む りコードされる。 重鎖免疫グロブリン遺伝子座を提供する。１つの実施形 【０１２１】 態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、Ｖ １つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝 Ｈ １−２、ＶＨ １−３、ＶＨ １−８、ＶＨ １−１８、Ｖ 子セグメントは、ＶＨ １−２遺伝子セグメントである。 Ｈ １−２４、ＶＨ １−４５、ＶＨ １−４６、ＶＨ １−５ １つの実施形態において、上記ＶＨ １−２遺伝子セグメ Ｈ ８、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−５、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２ 20 ントは、配列番号６３を含む。１つの実施形態において −７０、ＶＨ ３−７、ＶＨ ３−９、ＶＨ ３−１１、ＶＨ 、上記ＶＨ １−２遺伝子セグメントは、配列番号６３に ３−１３、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−１６、ＶＨ ３−２０ 由来する。１つの実施形態において、上記ＶＨ １−２遺 、ＶＨ ３−２１、ＶＨ ３−２３、ＶＨ ３−３０、ＶＨ ３ 伝子セグメントは、配列番号６３と少なくとも８０％、 −３０−３、ＶＨ ３−３０−５、ＶＨ ３−３３、ＶＨ ３ 少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５ −３５、ＶＨ ３−３８、ＶＨ ３−４３、ＶＨ ３−４８、 ％、または少なくとも９８％同一である。 ＶＨ ３−４９、ＶＨ ３−５３、ＶＨ ３−６４、ＶＨ ３− 【０１２２】 ６６、ＶＨ ３−７２、ＶＨ ３−７３、ＶＨ ３−７４、Ｖ １つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝 ４−４、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ４−３０−１、ＶＨ ４− 子セグメントは、配列番号６３を含むヌクレオチド配列 Ｈ ３０−２、ＶＨ ４−３０−４、ＶＨ ４−３１、ＶＨ ４− によりコードされる。 ３４、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ４−５９、ＶＨ ４−６１、Ｖ 30 【０１２３】 ５−５１、ＶＨ ６−１、ＶＨ ７−４−１およびＶＨ ７ １つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグ −８１セグメントから選択される。１つの実施形態にお メントは、１つ以上のＤセグメントおよび１つ以上のＪ いて、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ＶＨ １− セグメント、または１つ以上のＪセグメントに作動可能 ６９セグメントである；特定の実施形態において、上記 に連結されている。１つの実施形態において、上記Ｖセ 単一の機能的ヒトＶセグメントは、ヒト集団内で見出さ グメント、ならびに１つ以上のＤセグメントおよび／ま れる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ たはＪセグメントは、免疫グロブリン重鎖定常領域配列 、９つ、１０、１１、１２、または１３の多型形態で存 に作動可能に連結されている。１つの実施形態において 在する。１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒ 、上記免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、ＣＨ １配列 トＶセグメントは、ＶＨ １−２セグメントである；特定 、ヒンジ配列、ＣＨ ２配列、ＣＨ ３配列、およびその組 の実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメン 40 み合わせから選択される。１つの実施形態において、上 トは、ヒト集団内で見出される１つ、２つ、３つ、４つ 記ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３、またはその組み合 、または５つの多型形態で存在する。 わせは、各々非ヒト内因性定常配列である。１つの実施 【０１１８】 形態において、上記ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３、 １つの実施形態において、上記重鎖免疫グロブリン遺伝 またはその組み合わせのうちの少なくとも１つは、ヒト 子座は、非ヒト動物の改変遺伝子座である。１つの実施 配列である。特定の実施形態において、上記ＣＨ １およ 形態において、上記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝 び／またはヒンジは、ヒト配列である。 子座は、非ヒト動物のゲノム内の位置であって、対応す 【０１２４】 る非改変非ヒト遺伝子座が野生型非ヒト動物において見 １つの態様では、すべての機能的Ｖセグメントの、単一 出される位置に存在する。１つの実施形態において、上 のヒトＶセグメントによる置換を含む改変内因性非ヒト 記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動 50 免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、単一のヒトＶセ Ｈ ( 20 ) JP 37 2015-519076 A 2015.7.9 38 グメント以外のＶセグメントに由来する重鎖可変遺伝子 ヒトＶＨ セグメントを欠く再構成免疫グロブリン重鎖可 を形成するように再構成できない非ヒト免疫グロブリン 変ドメイン遺伝子を実質的に形成できない遺伝子改変非 重鎖遺伝子座を提供する。 ヒト動物を提供する。 【０１２５】 【０１２９】 １つの実施形態において、上記単一のヒトＶセグメント １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記 は、ＶＨ １−６９である。１つの実施形態において、上 非ヒト動物において発現される免疫グロブリン重鎖可変 記単一のヒトＶセグメントは、ＶＨ １−２である。 領域のみが、ヒトＶＨ １−２、ＶＨ １−３、ＶＨ １−８ 【０１２６】 、ＶＨ １−１８、ＶＨ １−２４、ＶＨ １−４５、ＶＨ １ １つの実施形態において、上記遺伝子座は、少なくとも −４６、ＶＨ １−５８、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−５、Ｖ １つのヒトＤＨ セグメントまたは非ヒトＤＨ セグメント 10 Ｈ 、および１つのヒトＪＨ セグメントまたは非ヒトＪＨ セ ＶＨ ３−１１、ＶＨ ３−１３、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３− グメントを含む。特定の実施形態において、上記遺伝子 １６、ＶＨ ３−２０、ＶＨ ３−２１、ＶＨ ３−２３、Ｖ 座は、ヒトＤＨ セグメントおよびヒトＪＨ セグメントを Ｈ ３−３０、ＶＨ ３−３０−３、ＶＨ ３−３０−５、Ｖ 含む。特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒト Ｈ ３−３３、ＶＨ ３−３５、ＶＨ ３−３８、ＶＨ ３−４ ＪＨ セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態にお ３、ＶＨ ３−４８、ＶＨ ３−４９、ＶＨ ３−５３、ＶＨ いて、上記遺伝子座は、ヒトＶＨ １−６９、すべての機 ３−６４、ＶＨ ３−６６、ＶＨ ３−７２、ＶＨ ３−７３ 能的ヒトＤＨ セグメント、およびすべての機能的ヒトＪ 、ＶＨ ３−７４、ＶＨ ４−４、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ４− Ｈ セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒ ２−２６、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−７、ＶＨ ３−９、 ３０−１、ＶＨ ４−３０−２、ＶＨ ４−３０−４、ＶＨ トＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグ ４−３１、ＶＨ ４−３４、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ４−５９ メント（またはヒトＶセグメントおよびヒトＪセグメン 20 、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ５−５１、ＶＨ ６−１、ＶＨ ７− ト）は、内因性マウス重鎖遺伝子座において、マウス定 ４−１およびＶＨ ７−８１遺伝子セグメントから選択さ 常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施 れるヒトセグメントのうちの１つに由来する、遺伝子改 形態において、上記マウス重鎖遺伝子座は、マウス免疫 変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上 グロブリン定常領域配列の野生型レパートリーを含む。 記ヒトセグメントは、ＶＨ １−６９セグメントである。 【０１２７】 １つの実施形態において、上記ヒトセグメントは、ＶＨ １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記 １−２セグメントである。１つの実施形態において、上 非ヒト動物の機能的免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメ 記マウスによって発現される免疫グロブリン重鎖可変領 ントのみが、ヒトＶＨ １−２、ＶＨ １−３、ＶＨ １−８ 域のみが、単一のＶセグメントファミリーメンバーに由 、ＶＨ １−１８、ＶＨ １−２４、ＶＨ １−４５、ＶＨ １ 来し、１つの実施形態において、上記免疫グロブリン重 −４６、ＶＨ １−５８、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−５、Ｖ 30 鎖可変領域のみが、上記単一のＶセグメントファミリー Ｈ ２−２６、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−７、ＶＨ ３−９、 メンバーの多型変異体に由来する。 ＶＨ ３−１１、ＶＨ ３−１３、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３− 【０１３０】 １６、ＶＨ ３−２０、ＶＨ ３−２１、ＶＨ ３−２３、Ｖ １つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝 Ｈ ３−３０、ＶＨ ３−３０−３、ＶＨ ３−３０−５、Ｖ 子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって Ｈ ３−３３、ＶＨ ３−３５、ＶＨ ３−３８、ＶＨ ３−４ 、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変セグメント ３、ＶＨ ３−４８、ＶＨ ３−４９、ＶＨ ３−５３、ＶＨ （Ｖκ）をさらに含む非ヒト動物を提供する。１つの実 ３−６４、ＶＨ ３−６６、ＶＨ ３−７２、ＶＨ ３−７３ 施形態において、上記１つ以上のＶκセグメントは、１ 、ＶＨ ３−７４、ＶＨ ４−４、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ４− つ以上のヒトＪセグメントに作動可能に連結されている ３０−１、ＶＨ ４−３０−２、ＶＨ ４−３０−４、ＶＨ 。特定の実施形態において、上記Ｊセグメントは、ヒト ４−３１、ＶＨ ４−３４、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ４−５９ 40 Ｊκセグメントである。もう１つの特定の実施形態にお 、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ５−５１、ＶＨ ６−１、ＶＨ ７− いて、上記非ヒト動物は、免疫グロブリンλ軽鎖を発現 ４−１およびＶＨ ７−８１セグメントから選択される遺 しない。もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒ 伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態におい ト動物は、機能的ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子 て、上記重鎖Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ １−６９ 座も機能的内因性免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も 遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上 含まない。 記重鎖Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ １−２遺伝子セ 【０１３１】 グメントである。 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスで 【０１２８】 ある。 １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、単一 【０１３２】 の機能的ヒトＶＨ セグメントを含み、上記単一の機能的 50 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非 ( 21 ) JP 39 2015-519076 A 2015.7.9 40 ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子座において、すべてのま 形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブリ たは実質的にすべての機能的内因性Ｖκセグメントの、 ン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトＶＨ １− １つ以上の機能的ヒトＶκセグメントによる置換を含む ２配列、ヒトＤＨ 配列、ヒトＪＨ 配列、およびマウス定 。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべ 常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形 てのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリン 成するように再構成する。 Ｖκセグメントによるものである。 【０１３６】 【０１３３】 １つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むＢ細 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非 胞を提供する。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は ヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子座において、すべてのま 、対象となる抗原で免疫された記載されるマウスに由来 たは実質的にすべての機能的内因性非ヒト免疫グロブリ 10 し、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合 ンＪκセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブ する抗体をコードする。１つの実施形態において、上記 リンＪκセグメントによる置換を含む。さらなる特定の 対象となる抗原は、病原体である。特定の実施形態にお 実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的 いて、上記病原体は、インフルエンザウイルス、肝炎ウ にすべての機能的ヒト免疫グロブリンＪκセグメントに イルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイ よるものである。 ルス）、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。 【０１３４】 特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、上記対象とな 特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶ る抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域（例えば、 セグメントおよび／またはその多型変異体から本質的に ヒトκ軽鎖可変領域）を含む体細胞変異高親和性（例え なるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン ば、約１０ 重鎖可変領域遺伝子座を含む。１つの実施形態において 20 【０１３７】 、上記単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントは、ヒト １つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖセグ ＶＨ １−６９セグメントであり、上記非ヒト動物は、す メントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、１つ べての機能的非ヒトＤＨ セグメントの、すべての機能的 以上のヒトλ軽鎖可変（Ｖλ）セグメントを含む非ヒト ヒトＤＨ セグメントによる置換をさらに含み、すべての 動物を提供する。１つの実施形態において、上記１つ以 機能的非ヒトＪＨ セグメントの、すべての機能的ヒトＪ 上のヒトＶλセグメントは、１つ以上のヒトＪセグメン − ９ のＫＤ 以下）抗体をコードする。 セグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブ トに作動可能に連結されている。特定の実施形態におい リン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒ て、上記Ｊセグメントは、ヒトＪλセグメントである。 ト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。 もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は 特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は 、κ軽鎖を発現しない。もう１つの特定の実施形態にお 、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実 30 いて、上記非ヒト動物は、機能的ヒトκ軽鎖可変遺伝子 施形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブ 座も非ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も含まない。 リン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトＶＨ １ 【０１３８】 −６９配列、ヒトＤＨ 配列、ヒトＪＨ 配列、およびマウ １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべての ス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子 または実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンＶ を形成するように再構成する。 λセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブリン 【０１３５】 Ｖλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施 特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶ 形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にす セグメントおよび／またはその多型変異体から本質的に べての機能的ヒト免疫グロブリンＶλセグメントによる なるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン ものである。 重鎖可変領域遺伝子座を含む。１つの実施形態において 40 【０１３９】 、上記単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントは、ヒト １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべての ＶＨ １−２セグメントであり、上記非ヒト動物は、すべ または実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンＪ ての機能的非ヒトＤＨ セグメントの、すべての機能的ヒ λセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブリン トＤＨ セグメントによる置換をさらに含み、すべての機 Ｊλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施 能的非ヒトＪＨ セグメントの、すべての機能的ヒトＪＨ 形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にす セグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブリ べての機能的ヒト免疫グロブリンＪλセグメントによる ン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト 置換である。 定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特 【０１４０】 定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、 特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶ 内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施 50 Ｈ Ｈ セグメントのみを含む免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ ( 22 ) JP 41 2015-519076 A 2015.7.9 42 ）領域遺伝子座を含み、上記単一のＶＨ セグメントは、 トＪ遺伝子、および／または非ヒト定常領域遺伝子は、 ヒトＶＨ １−６９セグメントまたはヒトＶＨ １−２セグ マウス遺伝子もしくはラット遺伝子またはキメラヒト／ メントであり、すべての機能的非ヒトＤＨ セグメントの マウスもしくはラット遺伝子である。 、すべての機能的ヒトＤＨ セグメントによる置換をさら 【０１４３】 に含み、すべての機能的非ヒトＪＨ セグメントの、すべ １つの実施形態において、上記導入遺伝子が、上記非ヒ ての機能的ヒトＪＨ セグメントによる置換をさらに含み ト動物において再構成免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺 、上記ＶＨ 領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト 伝子を形成するように再構成するように、上記非ヒト動 定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特 物は、１つ以上のヒト免疫グロブリンＶλセグメントお 定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、 よびヒト免疫グロブリンＪλセグメント、または１つ以 非ヒト定常領域の遺伝子配列、例えば、内因性非ヒト定 10 上のヒト免疫グロブリンＶκセグメントおよびヒト免疫 常遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非 グロブリンＪκセグメント、ならびにヒト免疫グロブリ ヒト動物は、上記非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座に ンκ軽鎖定常領域遺伝子またはヒト免疫グロブリンλ軽 おいて、セグメントを、ヒトＶＨ １−６９配列（または 鎖定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域遺 ヒトＶＨ １−２配列）、ヒトＤＨ 配列、ヒトＪＨ 配列、 伝子座を含む導入遺伝子を含む。 および内因性非ヒト定常領域配列を含む免疫グロブリン 【０１４４】 重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構 特定の実施形態において、上記マウスが、導入遺伝子か 成する。 ら、ＶＨ １−６９セグメント（またはＶＨ １−２セグメ 【０１４１】 ント）に由来する完全ヒト抗体を発現するように、上記 １つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むＢ細 非ヒト動物は、ヒトＶＨ １−６９セグメント（またはヒ 胞を提供する。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は 20 トＶＨ １−２セグメント）である単一のＶセグメント、 、対象となる抗原で免疫された記載される非ヒト動物に １つ以上のヒトＤセグメント、１つ以上のヒトＪセグメ 由来し、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に ント、および重鎖可変遺伝子座に作動可能に連結された 結合する抗体をコードする。１つの実施形態において、 ヒト定常遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座 上記抗原は、リガンド、細胞表面受容体、および細胞内 を有する導入遺伝子を含む。１つの実施形態において、 タンパク質から選択されるヒトタンパク質である。１つ 上記非ヒト動物は、機能的内因性免疫グロブリン重鎖可 の実施形態において、上記対象となる抗原は、病原体で 変領域遺伝子座を含まない。特定の実施形態において、 ある。特定の実施形態において、上記病原体は、インフ 上記非ヒト動物が内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺 ルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウ 伝子座を再構成して、再構成非ヒト抗体遺伝子を形成で イルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、およびヒト免疫不全 きないように、上記非ヒト動物は、内因性非ヒトＤＨ セ ウイルスから選択される。特定の実施形態において、上 30 グメントおよび／または内因性非ヒトＪＨ セグメントの 記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒ 欠失を含む非機能的内因性免疫グロブリン重鎖可変領域 ト軽鎖可変領域（例えば、ヒトλ軽鎖可変領域）を含む 遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記非ヒト 体細胞変異高親和性（例えば、約１０ − ９ ＫＤ 以下）抗 動物は、内因性マウス重鎖定常領域に作動可能に連結さ 体をコードする。 れたスイッチ配列の欠失を含む。特定の実施形態におい 【０１４２】 て、上記スイッチ配列は、非ヒト（例えば、マウス）μ １つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖセグ スイッチ配列である。もう１つの実施形態において、上 メントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、導入 記非ヒト動物は、免疫グロブリンκ遺伝子座および免疫 遺伝子上にヒトＶＨ １−６９セグメント（またはヒトＶ グロブリンλ遺伝子座から選択される機能的内因性軽鎖 １−２セグメント）を含み、上記ヒトＶＨ １−６９セ 可変遺伝子座の欠如をさらに含む。特定の実施形態にお Ｈ グメントは、上記導入遺伝子上で、ヒトＤＨ セグメント 40 いて、上記非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリン もしくは非ヒトＤＨ セグメントおよび／またはヒトＪセ κ軽鎖および／または内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽 グメントもしくは非ヒトＪセグメントに作動可能に連結 鎖可変領域を再構成して、再構成内因性非ヒト免疫グロ され、上記導入遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子もしくは ブリンκ軽鎖および／または再構成内因性非ヒト免疫グ 非ヒト定常領域遺伝子、またはキメラヒト／非ヒト定常 ロブリンλ軽鎖遺伝子を形成できないように、上記非ヒ 領域（例えば、少なくとも１つの配列は、非ヒトの、例 ト動物は、Ｊκ配列および／またはＪλ配列の欠失を含 えば、ヒンジ、ＣＨ ２、ならびにＣＨ ３および／または む。 ヒンジから選択されるＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３ 【０１４５】 、またはその組み合わせ）をさらに含む非ヒト動物を提 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非 供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、 ヒト免疫グロブリンκ軽鎖の機能的ノックアウトを結果 マウスまたはラットであり、上記非ヒトＤ遺伝子、非ヒ 50 としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配 ( 23 ) JP 43 2015-519076 A 2015.7.9 44 列の欠失を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト ド構築物であって、上記単一のＶＨ セグメントがＶＨ １ 動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の機能的ノ −６９（またはＶＨ １−２）セグメントである構築物を ックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グ 提供する。１つの実施形態において、上記構築物は、部 ロブリンλ軽鎖配列の欠失を含む。 位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。１つの実施形 【０１４６】 態において、上記構築物は、ＶＨ １−６９（またはＶＨ １つの態様では、１つ以下のヒトＶＨ セグメントまたは １−２）セグメントの上流に第一のマウスホモロジーア その１つ以上の多型、１つ以上のＤセグメントのレパー ーム、およびＶＨ １−６９（またはＶＨ １−２）セグメ トリーから選択されるＤセグメント、および１つ以上の ントの下流に第二のマウスホモロジーアームを含み、上 Ｊセグメントのレパートリーから選択されるＪセグメン 記第一のマウスホモロジーアームは、マウス免疫グロブ トに由来する免疫グロブリン重鎖可変レパートリーを含 10 リン重鎖可変領域の直ぐ上流のマウス染色体の領域と相 む齧歯動物であって、雄の齧歯動物において機能的であ 同であるが、機能的マウス免疫グロブリン重鎖可変セグ る異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくは メントを含まない。１つの実施形態において、上記構築 ホモログもしくは断片を含む齧歯動物を提供する。 物は、配列番号６を含む。１つの実施形態において、上 【０１４７】 記構築物は、配列番号７４を含む。１つの実施形態にお １つの実施形態において、上記ヒトＶＨ セグメントは、 いて、上記構築物は、配列番号７５を含む。１つの実施 １つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９ 形態において、上記構築物は、配列番号７６を含む。 つまたは１０以上の多型変異体で存在し、各多型変異体 【０１５０】 が、１つ以上のＤセグメントのうちのいずれかおよび１ １つの態様では、上記限定された単一のＶＨ セグメント つ以上のＪセグメントのうちのいずれかを有する再構成 は、非ヒト動物内にあるか、または上記限定されたＶＨ 重鎖可変ドメインを再構成および形成できるように、多 20 セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあ 型変異体は、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメント り（例えば、本来の位置に（ｉｎ に作動可能に連結されている。１つの実施形態において 入遺伝子内）、上記非ヒト動物または非ヒト免疫グロブ 、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。１つの リン重鎖遺伝子座は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、 実施形態において、上記Ｄセグメントのレパートリーは ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤ 、２つ以上のＤセグメントを含む。１つの実施形態にお ギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例 いて、上記Ｊセグメントのレパートリーは、２つ以上の えば、マーモセット、アカゲザル）の遺伝子座または動 Ｊセグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｄ 物から選択される。特定の実施形態において、上記非ヒ セグメントおよび／またはＪセグメントは、ヒトセグメ ト動物または非ヒト遺伝子座は、マウスまたはラット遺 ントである。１つの実施形態において、上記異所性ＡＤ 伝子座である。 ＡＭ６配列は、同じ種の野生型齧歯動物のＡＤＡＭ６配 30 【０１５１】 列である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、 １つの態様では、（ａ）ヒト可変領域遺伝子セグメント マウスまたはラットである。１つの実施形態において、 のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌ 上記雄の齧歯動物において機能的である上記異所性ＡＤ クレオチド配列と（ｂ）マウスにおいて機能的であるマ ＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもし ウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ くは断片は、上記改変免疫グロブリン重鎖可変レパート もしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むタ リーと同じ染色体上にある；１つの実施形態において、 ーゲティングベクターを提供する。 それは異なる染色体上にある。 【０１５２】 【０１４８】 １つの実施形態において、上記ターゲティングベクター １つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ セ は、上記マウスＡＤＡＭ６をコードする配列に作動可能 グメントおよび／またはその多型変異体、ならびに１つ 40 に連結されているプロモーターをさらに含む。特定の実 以上のＤＨ 配列および１つ以上のＪ配列をコードする配 施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ 列を含むヌクレオチド構築物であって、非ヒト免疫グロ ６プロモーターである。 ブリン重鎖可変遺伝子座と相同な少なくとも１つのホモ 【０１５３】 ロジーアーム、またはリコンビナーゼ認識部位（例えば １つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子 、ｌｏｘ部位）を含む構築物を提供する。１つの実施形 座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少な 態において、上記Ｖセグメントは、ＶＨ １−６９セグメ くとも１つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マ ントまたはＶＨ １−２セグメントである。 ウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質または 【０１４９】 そのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコード １つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖Ｖセグ する配列とを含む構築物を提供する。 メントをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチ 50 【０１５４】 ｓｉｔｕ）または導 ( 24 ) JP 45 2015-519076 A 2015.7.9 46 １つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモ 互作用の測定、画像化技術による顕色（ｄｅｖｅｌｏｐ ロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロ ｍｅｎｔ）、またはその組み合わせが挙げられる。 ジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と 【０１６０】 同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモ １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスで ロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変 ある。 領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、 【０１６１】 マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド １つの態様では、本明細書に記載の限定された重鎖ＶＨ 配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホ セグメントを含む非ヒト胚を提供する。１つの実施形態 モロジーアームとの間に配置されている。特定に実施形 において、上記胚は、上記限定されたＶＨ セグメントを 態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする 10 含むＥＳドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。 配列は、野生型マウスの場合に該マウスＡＤＡＭ６が連 【０１６２】 結されているマウスプロモーターに作動可能と連結され １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスで ている。 ある。 【０１５５】 【０１６３】 １つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変マウスか １つの態様では、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の ら単離された細胞を提供する。 非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。１つの実施 １つの実施形態において、上記細胞はリンパ球である。 形態において、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非 １つの実施形態において、上記リンパ球はＢ細胞である ヒト動物の核を含む。１つの実施形態において、上記非 。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、異所性ＡＤ ヒト細胞は、核移植の結果としての染色体またはその断 ＡＭ６配列またはそのオルソログまたはホモログまたは 20 片を含む。 その機能的断片をコードする配列を含み、上記Ｂ細胞は 【０１６４】 、ヒトＶＨ 遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメイ １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来す ンを発現する。 る核を提供する。１つの実施形態において、上記核は、 【０１５６】 Ｂ細胞ではない二倍体細胞に由来する。 １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来し 【０１６５】 、限定されたＶＨ セグメントのレパートリー含む細胞ま １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来す たは組織を提供する。１つの実施形態において、上記Ｖ る多能性細胞、人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒ セグメントのレパートリーは、単一のＶＨ セグメント ｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、または全能性細胞を提供する。 ファミリーメンバーおよび／またはその多型変異体に限 特定の実施形態において、上記細胞は、マウス胚性幹（ 定される。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ セ 30 ＥＳ）細胞である。 グメントは、ヒトＶＨ １−６９セグメントまたはヒトＶ 【０１６６】 Ｈ １−２セグメントである。１つの実施形態において、 １つの態様では、限定されたＶＨ セグメントのレパート 上記細胞または組織は、上記非ヒト動物の脾臓、リンパ リーを含む非ヒト人工多能性細胞を提供する。１つの実 節、または骨髄に由来する。 施形態において、上記人工多能性細胞は、本明細書に記 【０１５７】 載の非ヒト動物に由来する。 １つの実施形態において、上記細胞は、ＥＳ細胞である 【０１６７】 。１つの実施形態において、上記細胞は、Ｂ細胞である １つの態様では、本明細書に記載のマウスのリンパ球の 。１つの実施形態において、上記細胞は、生殖細胞であ 配列を含むハイブリドーマを提供する。１つの実施形態 Ｈ る。 【０１５８】 において、上記リンパ球はＢ細胞である。 40 【０１６８】 １つの実施形態において、上記組織は、結合組織、筋肉 １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に 組織、神経組織、および上皮組織から選択される。特定 由来するハイブリドーマまたはクアドローマを提供する の実施形態において、上記組織は、生殖組織である。 。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス 【０１５９】 またはラットである。 １つの実施形態において、本明細書に記載のマウスに由 【０１６９】 来する細胞および／または組織は、１つ以上のエクスビ １つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、 ボアッセイにおいて使用するために単離される。様々な ＥＳ細胞、多能性細胞および人工多能性（ｉｎｄｕｃｅ 実施形態において、上記１つ以上のエクスビボアッセイ ｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞をはじめとする（し としては、物理特性、熱特性、電気特性、機械的な特性 かしこれらに限定されない）マウス細胞およびマウス胚 、または光学特性の測定、手術手順、異なる組織型の相 50 を提供する。ＸＸである細胞およびＸＹである細胞を提 ( 25 ) JP 47 2015-519076 A 2015.7.9 48 供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入によ マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に隣接する核酸分子 り細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提 （例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。 供する。ウイルス導入ＡＤＡＭ６遺伝子を含む細胞、胚 【０１７５】 およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的である １つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成 ＡＤＡＭ６遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚 マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む核酸分子とは およびマウスも提供する。 異なる核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。 【０１７０】 【０１７６】 １つの態様では、遺伝子改変マウス細胞であって、再構 １つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、マウス 成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む重 またはヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に 鎖を発現できず、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそ 10 連結されている再構成非マウス免疫グロブリン可変遺伝 の機能的断片をコードする機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含 子配列を含み、ここで、Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機 む遺伝子改変マウス細胞を提供する。１つの実施形態に 能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログ おいて、上記細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメ もしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を ントの挿入をさらに含む。特定の実施形態において、上 含む。 記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成の際 【０１７７】 にヒト可変領域を含む抗体の機能的重鎖をコードするよ １つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成 うな、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された重鎖 非ヒト免疫グロブリン可変遺伝子配列に対して最も近い 遺伝子セグメントである。 遺伝子の遺伝子座にあるまたはその中にある核酸分子（ 【０１７１】 例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。 １つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子 20 【０１７８】 座を欠いている遺伝子改変マウス細胞であって、マウス １つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成 ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードす 非ヒト免疫グロブリン可変領域配列に隣接する核酸分子 る異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス細 （例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。 胞を提供する。１つの実施形態において、上記細胞は、 【０１７９】 内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変をさら １つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、 に含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロ 雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６または ブリン重鎖可変遺伝子配列の改変は、マウスＶＨ 遺伝子 そのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコード セグメントの欠失、マウスＤＨ 遺伝子セグメントの欠失 する核酸配列とを含む染色体を含む、マウス体細胞を提 、マウスＪＨ 遺伝子セグメントの欠失およびその組み合 供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上 わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態におい 30 記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にあ て、上記マウスは、１つ以上のマウス免疫グロブリンＶ る。１つの実施形態において、上記核酸は、上記改変免 、ＤＨ および／またはＪＨ 配列の、ヒト免疫グロブリ 疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。 ン配列による置換を含む。特定の実施形態において、上 １つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列 記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトＶＨ 、ヒトＶＬ 、ヒ の単一のコピーを含む。１つの実施形態において、上記 トＤＨ 、ヒトＪＨ 、ヒトＪＬ およびその組み合わせから 体細胞は、上記核酸配列の少なくとも２つのコピーを含 選択される。 む。特定の実施形態において、上記体細胞は、Ｂ細胞で 【０１７２】 ある。特定の実施形態において、上記細胞は、生殖細胞 １つの実施形態において、上記細胞は、全能性細胞、多 である。特定の実施形態において、上記細胞は、幹細胞 Ｈ 能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形 態において、上記細胞は、マウスＥＳ細胞である。 である。 40 【０１８０】 【０１７３】 １つの態様では、マウス生殖細胞であって、マウスＡＤ １つの態様では、再構成免疫グロブリン重鎖遺伝子を含 ＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしく むマウスＢ細胞であって、雄マウスにおいて機能的であ は機能的断片）をコードする核酸配列を該生殖細胞の染 るＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくは 色体上に含み、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモロ ホモログもしくは断片をコードする核酸配列を該Ｂ細胞 グもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードす の染色体上に含むＢ細胞を提供する。１つの実施形態に る核酸配列が、野生型マウス生殖細胞の染色体内の位置 おいて、上記マウスＢ細胞は、上記核酸配列の２つの対 とは異なる染色体内の位置にあるマウス生殖細胞を提供 立遺伝子を含む。 する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウ 【０１７４】 ス免疫グロブリン遺伝子座にある。１つの実施形態にお １つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成 50 いて、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グ ( 26 ) JP 49 2015-519076 A 2015.7.9 50 ロブリン遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形 １つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配 態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス 列番号６３に由来する。１つの実施形態において、上記 免疫グロブリン遺伝子座とは異なる染色体上にある。１ 抗体可変領域配列は、配列番号６３と少なくとも７５％ つの実施形態において、上記マウス免疫グロブリン遺伝 、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９ 子座は、少なくとも１つのマウス免疫グロブリン配列の ０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一 、少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列による である。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配 置換を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも 列は、配列番号６３を含む。 １つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブ 【０１８８】 リン配列である。１つの実施形態において、上記ヒト免 １つの態様では、非ヒト動物において、ヒト抗体可変領 疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。 10 域のレパートリーを生成するための方法であって、上記 【０１８１】 レパートリーの上記ヒト重鎖可変領域が、同じＶＨ 遺伝 １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において 子ファミリーメンバーならびに複数のＤＨ セグメントの 作製される抗体可変ドメイン配列を提供する。 うちの１つおよび複数のＪＨ セグメントのうちの１つに 【０１８２】 由来し、上記レパートリーが、単一のＶＨ 遺伝子ファミ １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来す リーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリンのＦＲ１（ る配列を含む抗体可変ドメインを含むヒト治療薬を提供 フレームワーク１）配列、ＣＤＲ１配列、ＦＲ２配列、 する。 ＣＤＲ２配列、およびＦＲ３配列を有することを特徴と 【０１８３】 する方法を提供する。１つの実施形態において、上記レ １つの態様では、ヒトＶＨ １−６９セグメントまたはＶ パートリーは、複数の異なるＣＤＲ３＋ＦＲ４配列を有 Ｈ １−２セグメントに由来する抗体可変領域配列を非ヒ 20 することをさらに特徴とする。 ト動物から得る方法であって、（ａ）非ヒト動物を対象 【０１８９】 となる抗原で免疫する工程であって、上記非ヒト動物が １つの実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子ファミ 、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべての リーは、ＶＨ ファミリー１、２、３、４、５、６、およ または実質的にすべての非ヒト可変セグメントの、単一 び７から選択される。特定の実施形態において、上記単 のヒト可変セグメントによる置換を含み、上記単一のヒ 一のＶＨ 遺伝子ファミリーは、ＶＨ ファミリー１である ト可変セグメントが、ＶＨ １−６９セグメントまたはＶ 。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子ファ Ｈ １−２セグメントであり、上記非ヒト動物が、ヒトＶ ミリーメンバーは、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２ Ｈ １−６９セグメントまたはＶＨ １−２セグメントに由 −２６、ＶＨ ２−７０、およびＶＨ ３−２３から選択さ 来しない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を実質的に形 れる。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子 成できない工程と、（ｂ）上記非ヒト動物が上記対象と 30 ファミリーメンバーは、ＶＨ １−６９である。 なる抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と 【０１９０】 、（ｃ）上記非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域 １つの実施形態において、上記レパートリーは、ＶＨ １ 配列を同定または単離する工程であって、上記抗体が上 −６９セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤ 記対象となる抗原に結合する工程とを含む方法を提供す Ｒ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および る。 重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記 【０１８４】 レパートリーは、配列番号３８に由来する重鎖ＦＲ１配 １つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメン 列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２ トは、ＶＨ １−６９セグメントである。 配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態に 【０１８５】 おいて、上記レパートリーは、配列番号３８の重鎖ＦＲ １つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配 40 １配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤ 列番号３７に由来する。１つの実施形態において、上記 Ｒ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。 抗体可変領域配列は、配列番号３７と少なくとも７５％ 【０１９１】 、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９ １つの実施形態において、上記レパートリーは、ＶＨ １ ０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一 −２セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ である。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配 １配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重 列は、配列番号３７を含む。 鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記レ 【０１８６】 パートリーは、配列番号６４に由来する重鎖ＦＲ１配列 １つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメン 、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配 トは、ＶＨ １−２セグメントである。 列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態にお 【０１８７】 50 いて、上記レパートリーは、配列番号６４の重鎖ＦＲ１ ( 27 ) JP 51 2015-519076 A 2015.7.9 52 配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ 遺伝子セグメントの転写に対して）下流の１つ以上の免 ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。 疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫 【０１９２】 グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置換す １つの態様では、非ヒト動物において、複数の異なるＣ る工程を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動 ＤＲ３配列およびＦＲ４配列を生成するための方法であ 物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以上の内因 って、単一のＶＨ セグメントファミリーメンバーに限定 性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１ されたＶＨ セグメントのレパートリーを有する免疫グロ つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺 ブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む非ヒト動物を、対 伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記 象となる抗原に曝露する工程と、上記非ヒト動物が上記 非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以 抗原に対する免疫応答を発生するようにする工程とを含 10 上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する み、上記免疫応答が、その重鎖可変ドメインの各々が上 ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＤ遺 記単一のＶＨ セグメントファミリーメンバーに由来する 伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記 Ｂ細胞レパートリーであって、複数の異なるＣＤＲ３配 非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以 列およびＦＲ４配列を含むＢ細胞レパートリーを生成す 上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する る方法を提供する。 、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント 【０１９３】 は、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態におい １つの実施形態において、上記単一のＶＨ セグメントフ て、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流 ァミリーメンバーは、ヒトのものである。１つの実施形 の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを 態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、およ 置換する、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セ びウサギから選択される。１つの実施形態において、上 20 グメントは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つ 記対象となる抗原は、リガンド、受容体、細胞内タンパ の実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ ク質、および分泌タンパク質から選択される。１つの実 ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺 施形態において、上記対象となる抗原は、ヒト病原体で 伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト免疫グ ある。 ロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セ 【０１９４】 グメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において 動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内 作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレ 因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記 オチド配列を提供する。 １つ以上の遺伝子セグメントは、単一のＶ遺伝子セグメ 【０１９５】 ント、１つ以上のＤ遺伝子セグメントおよび１つ以上の １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において 30 Ｊ遺伝子セグメントを含む。 作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸 【０１９９】 配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列を １つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６遺伝子の上流 提供する。 および／または下流の上記１つ以上の免疫グロブリン重 【０１９６】 鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、ま １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において たは全能性細胞中で置換して、遺伝子改変前駆細胞を形 作製される抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン 成し；該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し；そして、 重鎖可変領域ヌクレオチド配列または免疫グロブリン軽 該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺 鎖可変領域ヌクレオチド配列を提供する。 伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含む非ヒト動物を 【０１９７】 形成する。１つの実施形態において、上記宿主は胚であ １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において 40 る。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑 作製される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａ 実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）（例えば８または４細胞 ｂ、Ｆ（ａｂ）２ 、ｓｃＦｖ）を提供する。 期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から 【０１９８】 選択される。 １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製するため 【０２００】 の方法を提供し、この方法は、該非ヒト動物の内因性Ａ １つの態様では、単一のＶセグメントファミリーメンバ ＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメ ーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現す ントの転写に対して）上流の１つ以上の免疫グロブリン るＢ細胞レパートリーを有する非ヒト動物を提供する。 重鎖遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫グロブリ １つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーにお ン重鎖遺伝子セグメントで置換する工程、および該非ヒ いて発現される上記非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変 ト動物の該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖 50 ドメインの上記Ｂ細胞レパートリーのうちの少なくとも ( 28 ) JP 53 2015-519076 A 2015.7.9 54 １０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なく する。特定の実施形態において、上記限定されたレパー とも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少 トリーは、図７のＶＨ １−６９変異体のうちの１つ以上 なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％ から選択される。 、または少なくとも９５％は、同じＶセグメントファミ 【０２０４】 リーメンバーに由来する。特定の実施形態において、上 １つの態様では、限定されたＶＨ 遺伝子セグメントのレ 記割合は、少なくとも９０％である。１つの実施形態に パートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒ おいて、上記Ｂ細胞レパートリーは、末梢（血）Ｂ細胞 トＶＨ １−２遺伝子セグメントまたはＶＨ １−２遺伝子 から本質的になる。１つの実施形態において、上記Ｂ細 セグメントに対するものであり、ＶＨ１−２遺伝子セグ 胞レパートリーは、脾性Ｂ細胞から本質的になる。１つ メントと少なくとも約９４．９％、９５．９％、９６． の実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーは、骨髄 10 ９％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物を提 Ｂ細胞から本質的になる。１つの実施形態において、上 供する。特定の実施形態において、上記限定されたレパ 記Ｂ細胞レパートリーは、末梢Ｂ細胞、脾性Ｂ細胞、お ートリーは、図１０のＶＨ １−２変異体のうちの１つ以 よび骨髄Ｂ細胞から本質的になる。 上から選択される。 【０２０１】 【０２０５】 １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、重鎖 １つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであ 免疫グロブリン可変ドメインを発現する上記非ヒト動物 る。 のＢ細胞のうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５ 【０２０６】 ０％、６０％、７０％、８０％超または９０％超が、単 １つの態様では、限定されたヒトＶＨ セグメントのレパ 一のＶＨ 遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来す ートリーを含む非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブ る重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現する遺伝子改 20 リン軽鎖可変セグメント遺伝子座をさらに含み、上記マ 変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、免 ウスにおいて発現されるκ軽鎖に対するλ軽鎖の比率が 疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する上記非ヒト動 、野生型マウスにおける場合とほぼ同じである非ヒト動 物のＢ細胞のうちの少なくとも７５％は、上記単一のＶ 物を提供する。 Ｈ 遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する免疫 【０２０７】 グロブリン重鎖可変ドメインを発現する。特定の実施形 １つの態様では、単一のＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以 態において、上記割合は、少なくとも９０％である。１ 上のＤＨ 遺伝子セグメント、および１つ以上のＪＨ 遺伝 つの実施形態において、上記Ｂ細胞のすべては、上記単 子セグメントの存在を特徴とする限定された免疫グロブ 一のＶＨ 遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖ドメ リン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、上記単一 インを発現する。 のＶＨ 遺伝子セグメントが、多型ＶＨ 遺伝子セグメント 【０２０２】 30 である非ヒト動物を提供する。 １つの態様では、対象となる抗原による免疫に応答して 【０２０８】 抗原特異的Ｂ細胞集団を作製する遺伝子改変マウスであ １つの実施形態において、上記多型ＶＨ 遺伝子セグメン って、上記抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも１ トは、ヒト集団における高コピー数に関連するヒトＶＨ ０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０ 遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上 ％、８０％、または９０％超が、同じＶＨ 遺伝子セグメ 記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントは、ＶＨ １−２、ＶＨ １− ントにすべて由来する免疫グロブリン重鎖を発現する遺 ６９、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−２３、ま 伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、 たはこれらの多型変異体から選択される。特定の実施形 上記抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも７５％は 態において、上記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントは、ＶＨ １ 、同じＶＨ 遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン −６９遺伝子セグメントである。もう１つの特定の実施 重鎖を発現する。１つの実施形態において、上記抗原特 40 形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ 異的Ｂ細胞のすべては、同じＶＨ 遺伝子セグメントに由 １−２遺伝子セグメントである。 来する重鎖を発現する。 【０２０９】 【０２０３】 １つの実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメ １つの態様では、限定されたＶＨ 遺伝子セグメントのレ ントは、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウス免 パートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒ 疫グロブリン定常領域遺伝子、またはキメラヒト／マウ トＶＨ １−６９遺伝子セグメントまたはＶＨ １−６９遺 ス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結され 伝子セグメントに対するものであり、ＶＨ１−６９＊０ ている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン １遺伝子セグメントと少なくとも約７５．５％、７６． 定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。１つ ５％、８６．７％、８７．８％、９４．９％、９６．９ の実施形態において、上記免疫グロブリン定常遺伝子は ％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物を提供 50 、ヒトＣＨ １、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ ２、ヒトＣＨ ３、 ( 29 ) JP 55 2015-519076 A 2015.7.9 56 およびその組み合わせから選択されるヒト配列を含む。 子セグメントに作動可能に連結された１つ以上のヒトＪ １つの実施形態において、上記マウス定常遺伝子は、内 Ｌ 因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。 【０２１７】 【０２１０】 １つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／ １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、Ｊ遺伝子 非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む セグメントおよび軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結され 抗体を発現する非ヒト動物であって、内因性免疫グロブ たヒト免疫グロブリンＶＬ 遺伝子セグメントをさらに含 リン重鎖遺伝子座から非ヒトＡＤＡＭ６タンパク質また む。特定の実施形態において、上記ＶＬ 遺伝子セグメン はそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒト動 トおよび／またはＪ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子 物を提供する。１つの実施形態において、上記内因性免 セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択され 10 疫グロブリン重鎖遺伝子座は、抗体の機能的重鎖をコー る。１つの実施形態において、上記ＶＬ 遺伝子セグメン ドするように再構成できない。 トおよび／またはＪ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子 【０２１８】 セグメントである。 １つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／ 【０２１１】 非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む 様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、すべての 抗体を発現する非ヒト動物であって、免疫グロブリン遺 または実質的にすべての内因性ＶＨ 遺伝子セグメントの 伝子座以外の遺伝子座から非ヒトＡＤＡＭ６タンパク質 欠失を含む。 またはそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒ 【０２１２】 ト動物を提供する。 様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、不活性化 【０２１９】 内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む。様々な実施形態 20 １つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質ま において、上記不活性化内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座 たはそのオルソログもしくはホモログは、上記非ヒト動 は、内因性重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されて 物のＢ細胞において発現され、該Ｂ細胞は、ヒト可変配 いない。 列と非ヒト定常配列とを含む再構成免疫グロブリン配列 【０２１３】 を含む。 １つの態様では、血清免疫グロブリンの発現を特徴とす 【０２２０】 る非ヒト動物であって、上記血清免疫グロブリンのうち １つの実施形態において、上記非ヒト定常配列は、齧歯 の８０％超が、ヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト 動物配列である。１つの実施形態において、上記齧歯動 軽鎖可変ドメインを含み、上記ヒト重鎖可変ドメインが 物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される 、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントおよび／またはその 。 多型変異体から本質的になるＶＨ 遺伝子セグメントのレ 30 【０２２１】 パートリーに由来する非ヒト動物を提供する。 １つの態様では、不妊性雄非ヒト動物を作製するための 【０２１４】 方法を提供し、この方法は、ドナーＥＳ細胞の内因性Ａ １つの実施形態において、上記単一のヒトＶＨ 遺伝子セ ＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にすること（または該対 グメントは、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントおよび 立遺伝子をノックアウトすること）、該ドナーＥＳ細胞 ／またはその多型変異体である。１つの実施形態におい を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊 て、上記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ 娠させること、および該ドナーＥＳ細胞に全部または一 １−２遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体 部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。１ である。 つの実施形態において、上記方法は、後代を交配させて 【０２１５】 不妊性雄非ヒト動物を得ることをさらに含む。 １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に 40 【０２２２】 おけるすべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ 遺伝 １つの態様では、対象となる遺伝子改変を有する非ヒト 子セグメントの、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントおよ 動物であって、不妊性である非ヒト動物を作製するため び／またはその多型変異体での置換をその生殖細胞系内 の方法を提供し、この方法は、（ａ）対象となる遺伝子 に含む非ヒト動物を提供する。 改変をゲノム内で行う工程；（ｂ）上記ゲノムを改変し 【０２１６】 て、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子をノックアウトするか １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免 、または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にする 疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質 工程；および（ｃ）上記ゲノムを非ヒト動物の作製に用 的にすべての内因性ＶＬ 遺伝子セグメントの、１つ以上 いる工程を含む。様々な実施形態において、上記ゲノム のヒトＶＬ 遺伝子セグメントによる置換をさらに含む。 は、ＥＳ細胞からのものであり、または核移植実験で使 特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトＶＬ 遺伝 50 用される。 遺伝子セグメントをさらに含む。 ( 30 ) JP 57 2015-519076 A 2015.7.9 58 【０２２３】 ト動物から細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細 １つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベク 胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核とし ター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製さ て利用する工程と、上記細胞または核を使用する工程で れる非ヒト動物を提供する。 あって、宿主細胞を使用してならびに／または代理母に 【０２２４】 おいて上記細胞および／もしくは核を妊娠させて遺伝子 １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物と、野生 改変非ヒト動物を作製するする工程とを含む。 型非ヒト動物であるまたは遺伝子改変されている第二の 【０２２９】 非ヒト動物との交配の後代を提供する。 １つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置換に関し 【０２２５】 てヘテロ接合性である雄非ヒト動物のみを雌非ヒト動物 １つの態様では、非ヒト免疫グロブリン重鎖配列の、１ 10 に交配させる。特定の実施形態において、上記雌非ヒト つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列による置換を含む 動物は、置換される重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、 非ヒト動物系統を維持するための方法を提供する。１つ ヘテロ接合性または野生型である。 の実施形態において、上記１つ以上の異種免疫グロブリ 【０２３０】 ン重鎖配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列である。 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免 【０２２６】 疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび／またはκ １つの実施形態において、上記非ヒト動物系統は、１つ 軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列による置 以上の非ヒトＶＨ 、ＤＨ および／またはＪＨ 遺伝子セグ 換をさらに含む。１つの実施形態において、上記異種免 メントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記非 疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび ヒト動物は、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以 ／またはκ軽鎖可変配列である。 上のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび／または１つ以上 20 【０２３１】 のヒトＪＨ 遺伝子セグメントをさらに含む。１つの実施 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免 形態において、上記非ヒト動物は、単一のヒトＶＨ セグ 疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさ メント、少なくとも２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、 らに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領 および少なくとも６のＪＨ 遺伝子セグメントを含む。特 域配列に（非再構成配列については）作動可能に連結さ 定の実施形態において、上記非ヒト動物は、定常領域遺 れているまたは（再構成配列については）融合されてい 伝子に作動可能に連結されている、単一のヒトＶＨ セグ る、再構成または非再構成異種λまたはκ軽鎖配列（例 メント、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒ えば、非再構成ＶＬ および非再構成ＪＬ 、または再構成 トＪＨ 遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態におい ＶＬ ＪＬ ）をコードする配列を含む。１つの実施形態に て、上記定常領域遺伝子は、非ヒト定常領域遺伝子であ おいて、上記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものであ る。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、 30 る。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、齧 ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３および／もしくはＣＨ 歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。１つ ４またはその組み合わせから選択されるマウスまたはラ の実施形態において、上記定常領域配列は、マウス、ラ ット定常領域遺伝子配列を含む。様々な実施形態におい ットおよびハムスターから選択される。１つの実施形態 て、上記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ において、上記導入遺伝子は、上記軽鎖配列の発現を駆 １−６９またはヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントである 動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実 。 施形態において、上記プロモーターは、転写活性プロモ 【０２２７】 ーターである。特定の実施形態において、上記プロモー １つの実施形態において、上記方法は、上記非ヒト免疫 ターは、ＲＯＳＡ２６プロモーターである。 グロブリン重鎖配列の置換に関してヘテロ接合性の雄非 【０２３２】 ヒト動物を産生する工程、および上記ヘテロ接合雄非ヒ 40 １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法 ト動物を野生型雌非ヒト動物とまたはヒト重鎖配列に関 を提供し、この方法は、第一の改変のために、非ヒト免 してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌非ヒト動 疫グロブリン遺伝子セグメントを含む非ヒトヌクレオチ 物と交配させる工程を含む。１つの実施形態において、 ド配列を上記動物のゲノムに挿入する工程であって、上 上記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒ 記挿入が内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を維持する工程、その ト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性で 後、第二の改変のために、上記非ヒト動物の上記内因性 ある雌とを繰り返し交配させることにより上記非ヒト動 免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にする工程を含 物系統を維持する工程を含む。 む。１つの実施形態において、内因性免疫グロブリン重 【０２２８】 鎖遺伝子座が機能的重鎖可変領域をコードするように再 １つの実施形態において、上記方法は、ヒト重鎖配列に 構成できないように、上記第一の改変は、内因性免疫グ 関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌非ヒ 50 ロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流において行われ、上 ( 31 ) JP 59 2015-519076 A 2015.7.9 60 記第二の改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子 １つの態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａ 座を逆位させるように、上記内因性免疫グロブリン重鎖 ｂ）２ を作製するための、本明細書に記載のマウスの使 遺伝子座を転座させるように、または上記内因性免疫グ 用を提供する。 ロブリン重鎖遺伝子座を作動可能な連結の外側に配置す 【０２３８】 るように行われる。 １つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明 【０２３３】 細書に記載のマウスの使用を提供する。 １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法 【０２３９】 を提供し、この方法は、非ヒト免疫グロブリン遺伝子セ １つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを グメントと非ヒトＡＤＡＭ６（または雄非ヒト動物にお 作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供 いて機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは 10 する。 断片）ヌクレオチド配列とを含む非ヒト動物ヌクレオチ 【０２４０】 ド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む １つの態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変 配列で置換して、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程 領域を含有するファージライブラリーを作製するための 、その後、非ヒトＡＤＡＭ６コード配列（またはそのオ 、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。 ルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコード 【０２４１】 する配列）を含む配列を、上記ヒト免疫グロブリン遺伝 １つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配 子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝 列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４ 子座を形成する工程を含む。 １、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列 【０２３４】 番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５ １つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は 20 、配列番号５７および配列番号５９から選択される配列 、ヒト免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ ）遺伝子セグメン を含むヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントに由来する。 トを含む。１つの実施形態において、上記第二のキメラ 【０２４２】 遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ ）遺伝 １つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配 子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記第 列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４ 二のキメラ遺伝子座は、ヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよ ４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列 びヒトＪＨ 遺伝子セグメントに作動可能に連結されてい 番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８ るヒトＶＨ 遺伝子セグメントまたはヒトＶＬ 遺伝子セグ 、配列番号６０および配列番号６２から選択される配列 メントを含む。さらなる特定の実施形態において、上記 を含むヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントに由来する。 第二のキメラ遺伝子座は、マウスＣＨ ２＋ＣＨ ３配列と 【０２４３】 融合されているヒトＣＨ １配列、またはヒトＣＨ １およ 30 １つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配 びヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可 列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６ 能に連結されている。 ９および配列番号７１から選択される配列を含むヒトＶ 【０２３５】 Ｈ １つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウ 【０２４４】 スＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオ １つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配 チド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、上 列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７ 記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む上記異所 ０および配列番号７２から選択される配列を含むヒトＶ 性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性マウ Ｈ スＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠いているマウスと 【０２４５】 交配させること、および該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座も 40 １つの態様では、ヒト抗体を作製するための可変領域配 しくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得 列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を ること、または該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配 提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを 列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される 対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫し 妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得るこ たマウスからリンパ球を単離すること、（ｃ）上記リン とを含む。 パ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記 【０２３６】 対象となる抗原に結合できるリンパ球を同定すること、 １つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド および（ｅ）上記リンパ球からの１つ以上の可変領域核 配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用 酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成する を提供する。 ことを含む。 【０２３７】 50 １−２遺伝子セグメントにすべて由来する。 １−２遺伝子セグメントに由来する。 【０２４６】 ( 32 ) JP 61 2015-519076 A 2015.7.9 62 １つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの脾臓 、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記 、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免 マウスのリンパ節に由来する。１つの実施形態では、上 疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから骨髄を 記リンパ球を上記マウスの骨髄に由来する。 単離すること、（ｃ）上記骨髄からのＢリンパ球を１つ 【０２４７】 以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる １つの実施形態において、上記標識抗体は、蛍光団結合 抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、 体化抗体である。１つの実施形態において、１つ以上の および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配 上記蛍光団結合体化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／ま 列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによっ たはその組み合わせから選択される。 【０２４８】 て該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成 10 することを含む。様々な実施形態において、上記１つ以 １つの実施形態において、上記リンパ球は、Ｂ細胞であ 上の標識抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組 る。 み合わせから選択される。 【０２４９】 【０２５３】 １つの実施形態において、上記１つ以上の可変領域核酸 様々な実施形態において、上記対象となる抗原は、例え 配列は、重鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態にお ば、ウイルス抗原を含め、ヒト被験体が罹患する病原体 いて、上記１つ以上の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領 である。例示的なウイルス性病原体としては、例えば、 域配列を含む。１つの特定の実施形態において、上記軽 主に、アデノウイルス科、細菌ピコルナウイルス科、ヘ 鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列 ルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイル である。１つの実施形態において、上記１つ以上の可変 ス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パ 領域核酸配列は、重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領 20 ラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウ 域配列を含む。 イルス、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科のも 【０２５０】 のが挙げられる。かかる例示的なウイルスは典型的に、 １つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可 長さが２０∼３００ナノメートルの間の範囲にある。様 変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための 々な実施形態において、上記対象となる抗原は、肝炎ウ 、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は イルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶなど）、ヒト免疫不全 、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免 ウイルス（ＨＩＶ）、またはインフルエンザウイルスか 疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから脾臓を ら選択されるウイルス抗原である。 単離すること、（ｃ）上記脾臓からのＢリンパ球を１つ 【０２５４】 以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる 様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖お 抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、 30 よびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配 記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅重鎖お 列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによっ よび軽鎖可変領域配列をヒト重鎖および軽鎖定常領域配 て該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成 列に融合させること、融合した重鎖および軽鎖配列を細 することを含む。 胞において発現させること、および発現された重鎖およ 【０２５１】 び軽鎖配列を回収し、それによってヒト抗体を産生させ １つの実施形態において、ヒト抗体を作製するための重 ることをさらに含む。 鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するた 【０２５５】 めの、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使 様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、Ｉ 用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原 ｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧから選択さ で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから１ 40 れる。様々な特定の実施形態において、上記ＩｇＧは、 つ以上のリンパ節を単離すること、（ｃ）上記１つ以上 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択 のリンパ節からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝 される。様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領 露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ 域は、ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３、ＣＨ ４または ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂ その組み合わせを含む。様々な実施形態において、上記 リンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変 軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。 領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配 様々な実施形態において、上記細胞は、ＨｅＬａ細胞、 列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。 ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｍ 【０２５２】 ＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、 １つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可 ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経 変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための 50 芽腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ ( 33 ) JP 63 2015-519076 A 2015.7.9 64 細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例え セグメントを含有する重鎖可変ドメインを含む。 ば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）およびＭＣ３Ｔ３細胞 【０２６３】 から選択される。特定の実施形態において、上記細胞は 様々な実施形態において、上記対象となる抗原での免疫 、ＣＨＯ細胞である。 を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合 【０２５６】 わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。 １つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な 【０２６４】 逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生させるための方法を １つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断 提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原 片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラマウ 記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、 ス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細 10 上記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合 胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ 断片を作製する。１つの実施形態では、上記マウスを使 マウス−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培 用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗 養する工程、および該抗体を得る工程を含む。 体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー 【０２５７】 、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨ １つの実施形態において、上記逆キメラマウス−ヒト抗 Ｈ 体は、マウス重鎖定常遺伝子またはラット重鎖定常遺伝 ち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（ 子と融合されたヒト重鎖可変ドメイン、およびマウス軽 すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）また 鎖定常遺伝子またはラット軽鎖定常遺伝子またはヒト軽 は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆ 鎖定常遺伝子と融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含む ｉｃ 。特定の実施形態において、上記ヒト重鎖可変ドメイン 20 選択される抗原結合タンパク質を作製する。 は、再構成ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントまたはヒ 【０２６５】 トＶＨ １−２遺伝子セグメントを含有する。 １つの態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するた 【０２５８】 めの方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作非ヒト １つの実施形態において、上記抗原に対して特異的な上 動物を、対象となる抗原に曝露する工程と、上記ヒト動 記逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生する少なくとも１ 物が上記抗原に対する免疫応答を開始するようにする工 つの細胞の培養は、上記マウスから単離された少なくと 程と、上記非ヒト動物から、上記対象となる抗原に特異 も１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリ 的に結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可 ドーマ細胞で行う。 変ドメインの核酸配列を得る工程と、上記重鎖可変ドメ 【０２５９】 インの核酸配列を、ヒト定常領域配列に融合する工程と １つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な 30 、哺乳動物細胞内で、上記ヒト重鎖可変ドメイン配列お 完全ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方 よび上記ヒト定常領域配列を含む抗体を発現させる工程 法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程 とを含む方法を提供する。１つの実施形態において、上 、該抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体 記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。１つの実施形態 を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する において、上記非ヒト動物は、必要に応じてその２つ以 工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ齧歯動物−ヒ 上の多型変異体で存在する単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメ ト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも１ ントから本質的になるヒトＶＨ 遺伝子セグメントのレパ つの細胞を産生させる工程、および該完全ヒト抗体を産 ートリーであって、１つ以上のヒトＤセグメントおよび 生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該 ／またはヒトＪセグメントに作動可能に連結されたヒト 完全ヒト抗体を得る工程を含む。 【０２６０】 、ＶＬ 、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２ 、ＤＶＤ（すなわ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から ＶＨ 遺伝子セグメントのレパートリーを含む。１つの実 40 施形態において、上記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントのレパ 様々な実施形態において、上記抗原に対して特異的な逆 ートリーは、内因性非ヒトＶＨ 遺伝子セグメントの遺伝 キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから単離さ 子座にある。１つの実施形態において、上記ヒトＶＨ 遺 れる少なくとも１つの細胞は、脾細胞またはＢ細胞であ 伝子セグメントのレパートリーは、内因性ＶＨ 遺伝子セ る。 グメントの遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実 【０２６１】 施形態において、上記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントはヒト 様々な実施形態において、上記抗体は、モノクローナル ＤセグメントおよびヒトＪセグメントと共に再構成して 抗体である。 、ヒト配列および齧歯動物配列（例えば、マウス配列ま 【０２６２】 たはラット配列またはハムスター配列）から選択される 様々な実施形態において、上記抗体は、再構成ヒトＶＨ 定常領域配列に作動可能に連結された再構成ヒトＶＤＪ １−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ １−２遺伝子 50 遺伝子を形成する。１つの実施形態において、上記定常 ( 34 ) JP 65 2015-519076 A 2015.7.9 66 領域配列は、ＣＨ １、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３、および となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコー その組み合わせから選択される配列を含む；特定の実施 ドするヌクレオチド配列を、上記二重特異性抗体の作製 形態において、上記定常領域配列は、ＣＨ １、ヒンジ、 において使用する工程とを含む。特定の実施形態におい ＣＨ ２、およびＣＨ ３を含む。１つの実施形態において て、上記ヒト重鎖可変領域は、再構成ＶＨ １−２または 、上記ヒト可変ドメインおよび上記定常配列を、同じマ ＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含む。 ウスから得られる同種のヒト軽鎖可変ドメイン（例えば 【０２７１】 、上記ヒト可変ドメイン配列と同じＢ細胞から得られる １つの実施形態において、工程（ａ）∼（ｃ）を、１回 配列）と共に哺乳動物細胞内で発現させる；１つの実施 目は、第一のヒト重鎖可変領域配列を生成するために、 形態において、次いで、上記マウスから得られるヒト軽 第一の対象となる抗原に対して実施し、工程（ａ）∼（ 鎖可変ドメインをコードする配列を、ヒト軽鎖定常配列 10 ｃ）を、２回目は、第二のヒト重鎖可変領域配列を生成 をコードする配列と融合させ、上記軽鎖配列および上記 するために、第二の対象となる抗原に対して実施し、第 重鎖配列を哺乳動物細胞内で発現させる。 一のヒト重鎖定常領域と融合された上記第一のヒト重鎖 【０２６６】 可変領域配列を発現させて、第一のヒト重鎖を形成し、 １つの態様では、対象となる抗原に結合する抗体重鎖可 第二のヒト重鎖定常領域と融合された上記第二のヒト重 変ドメインを作製するための方法であって、単一の細胞 鎖可変領域配列を発現させて、第二のヒト重鎖を形成し 内で、（ａ）本明細書に記載の免疫した非ヒト動物の第 、上記第一のヒト重鎖および上記第二のヒト重鎖を、再 一のＶＨ 配列であって、ＣＨ 遺伝子配列と融合された第 構成ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ 一のＶＨ 配列、および（ｂ）本明細書に記載の免疫した ３−２０遺伝子セグメントから発現される単一のヒト軽 非ヒト動物のＶＬ 遺伝子配列であって、ヒトＣＬ 遺伝子 鎖の存在下で発現させる。特定の実施形態において、上 配列と融合されたＶＬ 遺伝子配列を発現させる工程と； 20 記単一のヒト軽鎖は、生殖細胞系配列を含む。 上記細胞を、抗体を発現させるのに十分な条件下で維持 【０２７２】 する工程と；上記抗体重鎖可変ドメインを単離する工程 １つの実施形態において、上記方法は、（ａ）第一の対 とを含む方法を提供する。１つの実施形態において、Ｖ 象となる抗原に曝露された本明細書に記載の非ヒト動物 Ｌ 遺伝子配列は、第一のＶＨ 配列と同種である。 のＢ細胞、および同じ非ヒト動物、または遺伝的に同じ 【０２６７】 で第二の対象となる抗原に曝露された異なる非ヒト動物 １つの実施形態において、上記細胞は、本明細書に記載 のＢ細胞から重鎖可変領域をクローニングする工程と、 の免疫した非ヒト動物の第二のＶＨ 遺伝子配列を含み、 （ｂ）（ａ）の上記重鎖可変領域を、上記同じ重鎖定常 上記第二のＶＨ 遺伝子配列は、ＣＨ 遺伝子配列と融合さ 領域および上記同じ軽鎖と共に細胞内で発現させて、二 れ、上記第一のＶＨ 遺伝子配列は、第一のエピトープに 重特異性抗体を作製する工程とを含む。 特異的に結合するＶＨ ドメインをコードし、上記第二の 30 【０２７３】 ＶＨ 遺伝子配列は、第二のエピトープに特異的に結合す １つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核 るＶＨ ドメインをコードし、上記第一のエピトープと上 酸配列を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使 記第二のエピトープとが同一でない。 用を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可変 【０２６８】 ドメインは、ＶＨ １−２、およびＶＨ １−６９から選択 １つの実施形態において、上記定常領域配列は、すべて される再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。 のヒト定常領域配列である。 【０２７４】 【０２６９】 １つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする細 １つの態様では、ヒト二重特異性抗体を作製するための 胞を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を 方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物のＢ細胞の 提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可変ドメ ヒト可変領域遺伝子配列を用いて二重特異性抗体を作製 40 インは、ＶＨ １−２、およびＶＨ １−６９から選択され する工程を含む方法を提供する。 る再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。 【０２７０】 【０２７５】 １つの実施形態において、上記方法は、（ａ）対象とな １つの態様において、ヒト抗体可変ドメインを作製する る抗原に曝露されて上記対象となる抗原に対する免疫応 ための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する 答を発生するようにされた非ヒト動物のクローン選択リ 。１つの態様において、ヒト抗体を作製するための、本 ンパ球を同定する工程であって、上記リンパ球が、上記 明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実 対象となる抗原に特異的に結合する抗体を発現する工程 施形態において、上記ヒト抗体は、ヒト二重特異性抗体 と、（ｂ）上記リンパ球または上記抗体から、上記対象 である。様々な実施形態において、上記可変ドメインお となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコー よび／または上記抗体は、ＶＨ １−２およびＶＨ １−６ ドするヌクレオチド配列を得る工程と、（ｃ）上記対象 50 ９から選択される再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含 ( 35 ) JP 67 2015-519076 A 2015.7.9 68 む。 減させるまたは除去する。 【０２７６】 【０２８２】 １つの態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメ １つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノ インを選択するための、本明細書に記載の非ヒト動物の ムの異所位置に組み込む。１つの実施形態では、上記核 使用を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可 酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺 変ドメインは、ＶＨ １−２およびＶＨ １−６９から選択 伝子座に組み込む。特定の実施形態において、上記内因 される再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。 性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１ 【０２７７】 つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノム １つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列が の内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む 無いマウスに異所性ＡＤＡＭ６配列を導入するための、 10 。 本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、 【０２８３】 本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性マウスＡＤ １つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、 ＡＭ６配列が無いマウスとを交配させることを含む。 薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための 【０２７８】 、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配 １つの態様では、異所性ＡＤＡＭ６配列を有するマウス 列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載 を作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝 のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、 子材料の使用を提供する。１つの実施形態において、上 医薬の上記可変配列は、多型ヒトＶＨ 遺伝子セグメント 記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用す を含む。１つの実施形態において、医薬の上記可変配列 る核移植を含む。１つの実施形態において、上記使用は は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含む。１つの 、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する 20 実施形態において、医薬の上記可変配列は、ヒトＶＨ １ 動物を産生するためにクローングすることを含む。１つ −２遺伝子セグメントを含む。 の実施形態において、上記使用は、上記異所性ＡＤＡＭ 【０２８４】 ６配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける １つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製 、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含 される免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構 む。 築物を提供する。１つの実施形態において、上記可変ド 【０２７９】 メインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態に １つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含 おいて、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ １−２、ＶＨ １ む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性 −６９、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２−７０、またはＶＨ ３− 免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む第一のマウス ２３から選択されるヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。 生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ 30 もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメ 遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは インは、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントを含む。もう 断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程；受 １つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメイン 精細胞を形成する工程；上記受精細胞を胚へと発生させ は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含む。 る工程；および代理母において上記胚を妊娠させてマウ 【０２８５】 スを得る工程を含む方法を提供する。 １つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可 【０２８０】 変ドメインである。特定の実施形態において、上記可変 １つの実施形態において、上記受精は、雄マウスと雌マ ドメインは、再構成ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメント ウスを交配させることによって達成される。１つの実施 を含むヒト重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメイ 形態では、上記雌マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子または ンである。特定の実施形態において、上記可変ドメイン そのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。 40 は、再構成ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントを含むヒト １つの実施形態では、上記雄マウスが上記ＡＤＡＭ６遺 重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメインである。 伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断 【０２８６】 片を含む。 １つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコ 【０２８１】 ードする核酸構築物を作製するための、本明細書に記載 １つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、 含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強 上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。１つの 化するための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその 実施形態において、上記可変ドメインは、Ｖκ４−１、 オルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６ Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖ タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を κ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ 提供し、この場合の改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能を低 50 ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３ ( 36 ) JP 69 2015-519076 A 2015.7.9 70 、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１ に禁止されていない限り、様々な態様および実施形態を −１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、 併用することができる。 Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２− 【図面の簡単な説明】 ２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖ 【０２９１】 κ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３ 【図１】図１は、単一のヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメ １、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ ント、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、および６のヒ １−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８ トＪＨ 遺伝子セグメントを、内因性免疫グロブリン重鎖 、Ｖκ１−３９、およびＶκ２−４０から選択される再 遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築する 構成ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメイ ンである。 ためのターゲティングベクターを作製するために使用さ 10 れる、一連のターゲティング工程および分子操作工程の 【０２８７】 一般説明図（縮尺不定）を示すものである。 １つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可 【０２９２】 変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖 【図２】図２は、単一のヒトＶＨ １−２遺伝子セグメン 可変ドメインは、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２− ト、２７のヒトＤＨ 、および６のヒトＪＨ 遺伝子セグメ ２６、ＶＨ ２−７０、またはＶＨ ３−２３から選択され ントを、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含 る再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。特定の実施 有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティン 形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶ グベクターを作製するために使用される、一連のターゲ １−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態に ティング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不 Ｈ おいて、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ １− ２遺伝子セグメントを含む。 定）を示すものである。 20 【０２９３】 【０２８８】 【図３】図３は、単一のヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメ １つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインを作 ント、２７のヒトＤＨ 、６のヒトＪＨ 遺伝子セグメント 製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供す 、およびマウスＡＤＡＭ６をコードする異所性ゲノム断 る。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽 片を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有 鎖可変ドメインである。１つの実施形態において、上記 する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティング 可変ドメインは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３ ベクターを作製するために使用される、一連のターゲテ 、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、 ィング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定 Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１ ）を示すものである。 、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３ 【０２９４】 −１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、 30 【図４】図４は、単一のヒトＶＨ １−２遺伝子セグメン Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１− ト、２７のヒトＤＨ 、６のヒトＪＨ 遺伝子セグメント、 ２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖ およびマウスＡＤＡＭ６をコードする異所性ゲノム断片 κ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２ を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有す ９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ る改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベ １−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６ クターを作製するために使用される、一連のターゲティ 、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、および ング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定） Ｖκ２−４０から選択される再構成ヒトＶκ遺伝子セグ を示すものである。 メントを含むκ軽鎖可変ドメインである。 【０２９５】 【０２８９】 【図５】図５は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子について報告 １つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可 40 される１３の対立遺伝子の各々について、第二のエクソ 変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖 ンのヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字 可変ドメインは、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２− の塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差 ２６、ＶＨ ２−７０、またはＶＨ ３−２３から選択され 違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りの る再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含む。特定の実施 ボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメント 形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶ のための人為的ギャップを示す。ＶＨ １−６９＊０１（ １−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態に 配列番号３７）；ＶＨ １−６９＊０２（配列番号３９） おいて、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ １− ；ＶＨ １−６９＊０３（配列番号４１）；ＶＨ １−６９ ２遺伝子セグメントを含む。 ＊０４（配列番号４３）；ＶＨ １−６９＊０５（配列番 【０２９０】 号４５）；ＶＨ １−６９＊０６（配列番号４７）；ＶＨ 特に明確な注記がない限り、または併用が文脈上明らか 50 １−６９＊０７（配列番号４９）；ＶＨ １−６９＊０８ Ｈ ( 37 ) JP 71 2015-519076 A 2015.7.9 72 （配列番号５１）；ＶＨ １−６９＊０９（配列番号５３ 示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボッ ）；ＶＨ １−６９＊１０（配列番号５５）；ＶＨ １−６ クスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのた ９＊１１（配列番号５７）；ＶＨ １−６９＊１２（配列 めの人為的ギャップを示す。ＶＨ １−２＊０１（配列番 番号５９）；ＶＨ １−６９＊１３（配列番号６１）。 号６４）；ＶＨ １−２＊０２（配列番号６６）；ＶＨ １ 【０２９６】 −２＊０３（配列番号６８）；ＶＨ １−２＊０４（配列 【図６】図６は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子について報告 番号７０）；ＶＨ １−２＊０５（配列番号７２）。 される１３の対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変 【０３００】 遺伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。 【図１０】図１０は、ヒトＶＨ １−２遺伝子について報 小文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違 告される５つの対立遺伝子の各々について、成熟可変遺 を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボ 10 伝子のアラインメントされたタンパク質配列のための、 ックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントの 同一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す ための人為的ギャップを示す。ＶＨ １−６９＊０１（配 図である。ＶＨ １−２対立遺伝子間の同一性パーセント 列番号３８）；ＶＨ １−６９＊０２（配列番号４０）； は、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセン ＶＨ １−６９＊０３（配列番号４２）；ＶＨ １−６９＊ トは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パーセ ０４（配列番号４４）；ＶＨ １−６９＊０５（配列番号 ントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅｃ ４６）；ＶＨ １−６９＊０６（配列番号４８）；ＶＨ １ ｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．、 −６９＊０７（配列番号５０）；ＶＨ １−６９＊０８（ Ｎｏｒｔｈ 配列番号５２）；ＶＨ １−６９＊０９（配列番号５４） ｌＷ（Ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア付 ；ＶＨ １−６９＊１０（配列番号５６）；ＶＨ １−６９ けした。 ＊１１（配列番号５８）；ＶＨ １−６９＊１２（配列番 20 【発明を実施するための形態】 号６０）；ＶＨ １−６９＊１３（配列番号６２）。 【０３０１】 【０２９７】 詳細な説明 【図７】図７は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子について報告 本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定さ される１３の対立遺伝子の各々について、成熟可変遺伝 れない。かかる方法および条件は変わることがあるから 子のアラインメントされたタンパク質配列のための、同 である。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義す 一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す図 るので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実 である。ＶＨ １−６９の対立遺伝子間の同一性パーセン 施形態を説明することのみを目的としたものであり、限 トは、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセ 定することを意図したものではないことを理解されたい ントは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パー 。 セントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅ 30 【０３０２】 ｃｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ． 別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべて 、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔ の用語および句は、その用語または句が用いられている ａｌＷ（ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア 文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に 付けした。 分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野に 【０２９８】 おいて獲得している意味を含む。本明細書に記載するも 【図８】図８は、ヒトＶＨ １−２遺伝子について報告さ のに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発 れる５つの対立遺伝子の各々について、第二のエクソン 明の実施または試験に用いることができるが、今は特定 のヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字の の方法および材料を記載する。 塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差違 【０３０３】 を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボ 40 遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実 ックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントの 質的な」または「実質的に」（例えば、「実質的にすべ ための人為的ギャップを示す。ＶＨ １−２＊０１（配列 ての」Ｖ遺伝子セグメント）は、機能的遺伝子セグメン 番号６３）；ＶＨ １−２＊０２（配列番号６５）；ＶＨ トと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様 １−２＊０３（配列番号６７）；ＶＨ １−２＊０４（配 々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメ 列番号６９）；ＶＨ １−２＊０５（配列番号７１）。 ントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以 【０２９９】 上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％ 【図９】図９は、ヒトＶＨ １−２遺伝子について報告さ 以上を含む；様々な実施形態において、「実質的にすべ れる５つの対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変遺 ての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的（すなわち 伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。小 、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの少なくとも９５％、 文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違を 50 ９６％、９７％、９８％または９９％を含む。 Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔａ ( 38 ) JP 73 2015-519076 A 2015.7.9 74 【０３０４】 ックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎ 用語「置換」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝 ｏｃｋｏｕｔ−ｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ 子座において異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配 ｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒ 列）で置換するようなやり方でＤＮＡ配列を細胞のゲノ ト化する努力は、上記内因性遺伝子の欠失（すなわち、 ムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置さ ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込ま れたＤＮＡは、そのようにして配置された配列を得るた れたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要と めに使用した源ＤＮＡの一部である１つ以上の調節配列 した（例えば、Ｂｒｉｌら、２００６、Ｔｏｌｅｒａｎ （例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３ ｃｅ ’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）を含み ａｎｓｇｅｎｉｃ 得る。例えば、様々な実施形態において、上記置換は、 10 ｔｏ ｆａｃｔｏｒ ｈｕｍａｎ ＶＩＩＩ ｍｏｕｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ａ ｔｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ そのように置かれた（ｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ配列（異種 ａｒｒｙｉｎｇ 配列を含む）から遺伝子産物の産生をもたらす結果とな ｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂ る、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、 ｍｏｓｔ 該内因性配列の発現ではない；上記置換は、内因性ゲノ 、２００６、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされてい ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ るタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコード ｄｅｌｓ するＤＮＡ配列による置換である（例えば、上記内因性 ｅｄｉａｔｅ ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインを ｄｉｓｅａｓｅ、ＢＭＣ コードしており、上記ＤＮＡ断片は、一つ以上のヒト免 ３；Ｊａｍｓａｉら、２００６、Ａ 疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする）。様 20 ｄ ＢＡＣ 々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は ａｎ ｈｕ Ａｒｇ（５９３） ｔｏ ｃ Ｃｙ Ｈａｅ ９５：３４１−３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓら ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ｍａｐｌｅ ａｎｄ ｃｈａｒ ｍｏ ａｎｄｉｎｔｅｒｍ ｓｙｒｕｐ ｕｒｉｎｅ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ７：３ ｈｕｍａｎｉｚｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＨｂＥ／ｂｅｔａ 、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対 −ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性 ３）：３０９−１５；Ｐａｎら、２００６、Ｄｉｆｆｅ 遺伝子もしくは断片のオルソログである、置換される内 ｒｅｎｔ ｒｏｌｅ 因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置換 ｕｍａｎ ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ される内因性遺伝子もしくは断片と構造および／もしく ｅｒｏｄｉｍｅｒｉｎ は機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺 ｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａ 伝子または断片である。 ｎ ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ ｈｅｔｅｒｏ 【０３０５】 ｄｉｍｅｒ ｄｅｆｅｃｔ 遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよ 30 ｉｖｅ びノックアウト技術によって大きく向上され、これらの ３ｇａｍｍａ− 技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効 −ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ 果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわ ｏｌ らず、上記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完 らの努力は、サイズ制限によって妨げられた；従来のノ 全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するま ックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大 たはそれらを作製するための不完全なプラットホームに きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十 ならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト 分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにそ 遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅ の遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で） ｒｓｔｏｎら、２００２、Ｉｎｉｔｉａｌ ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子 ｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ 、Ｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ａｎａ 40 ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅＴＣＲ ａｎｄ ｐｒｅＴ ｃｅｌｌ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ８８（ ｈ ｈｅｔ ｒｅｃｅ ｉｎ ＣＤ ＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎ ４３：１７４１−１７５０参照）。しかし、これ を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、 ｇｅｎｏｍｅ 技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、 ４２０：５２０−５６２）が、可能性 直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要と のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウス し、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さお オルソログと交叉反応することができない、または不適 よび操作することができる精度が限定された。 切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択 【０３０６】 標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、 外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、 マウス遺伝子を除去して、対応するオルソロガスヒト遺 マウスの前駆体Ｂ細胞内で再構成する（Ａｌｔら、１９ 伝子配列により置換することができる（例えば、米国特 ８５、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ 許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号 ｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ および同第７，１０５，３４８号明細書）。最初、「ノ 50 Ｇｅｎｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉ ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ １：２３１−２３６）。この発見は、ヒト ( 39 ) JP 75 2015-519076 A 2015.7.9 76 抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トラン ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ スジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に ｃ ａｎｉｍａｌｓ、Ｎａｔ 活用された（Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ ２３：１１１７−１１２５；Ｍａｋｅｒら、２００５、 −ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｕｍｏｒ ｌ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＹＡＣｓ、 ｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ７：１３−２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｈ ｎ ２：ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎ ３６８：８５６−８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｌｌｙ ｆｉｒｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ、Ｎａｔ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ／ＩＩ Ｏｎｃｏｌ ｓｔｕｄｙ、Ａｎ １２：１００５−１０１６ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｉｔｈ ｔ ｌｏｗ ｂｏｎｅ ｉｔｙ、Ｎｅｗ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ， ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ ｐｈａｓｅ ｎ Ｓｕｒｇ ｔｒｅａ ；ＭｃＣｌｕｎｇら、２００６、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａ ｔｓら、２００７、Ｆｒｏｍ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ ４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｍｉｃｅ 10 ａｎｄ ａｕｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｅｄ Ｇｅｎｅｔ ｅｎｉｃ ｉｎ Ｉｇ ｈｅ ａｎｄ ｉｂｏｄｙ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ Ｎａｔ ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｗｉｔｈ ａｖｙ ｕｍａｎ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉ ｗｏｍｅｎ ｍｉｎｅｒａｌ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ｗ ｄｅｎｓ ３５４：８２ １−８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマ ａｎｔ ウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発 ｔｒａｎｓｇ 生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完 ２５：１１３４−１１４３）。マウス免疫グロブリン重 全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する 鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、 20 。上記不全は、 各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続 ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因 いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大き する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素 な導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒ 免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化さ ｅｔｔら、２００５、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ れた（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００、Ｄｏｕｂｌｅ ｔｅｃｔｕｒｅ ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ ｍｉｃｅ： ａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｉｎｄｉｖｉｄ ｕａｌ ｈｕｍａｎ ｏｆ ｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｗｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｋａｐｐａ ｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｉ ｆｕｌｌｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＰＮＡＳ Ｉｇ ｍ ３’ｅｎｄ ｆｒａｇ ｏｆ ａｎｄ ｅｘｐｒｅ 30 ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｎｔｉ ｔ ａｎｄ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｂ−Ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔ ＣＴＣＦ ＵＳＡ ９７：７２２−７２ ＩｇＨ ｍｏｄｕｌａｒ ｄｕｒｉｎｇ ａｒｃｈｉ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｖｅｓ ｈｅａｖｙ ｎｅａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｓｉｔｅｓ、Ｍｏｌ ａ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ ２５：１５１１−１５２５；Ｍａｎｉｓら、２００ ７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴 ３、Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗 ｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ３’Ｉｇ 体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をも Ｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ たらした（Ｇｉｂｓｏｎら、２００６、Ｒａｎｄｏｍｉ ｍｍｕｎｏｌ ｚｅｄ ｔｓ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｉｃ ｒｅｇｉｏｎ、Ｍｏｌ ｒｅｓｕｌ ｋｙら、２００６、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｕｌｌｙ ｆ ａ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｔ １；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍら、２ ｎｄｉｎｇ ００７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａ、Ｊ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｃｕｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＵ．１， ５’ｆｌａｎ ｍｏｕｓｅ Ｉ ｂｙ ｐｒｏ−Ｂ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ６：２９−３ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｗｉｔｈｉｎ ｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎ ｇＨ ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｎｏｃｌ 40 Ｉ ３９：７５３−７６０；Ｐａｗｌｉｔｚ ｔｒｉａｌ ｆａｃｔｏｒ ｏｎａｌ ｄｏｗｎｓｔ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａ ｈｕｍａｎ ｗｔｈ ＩＩＩ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｗｉｔｈ ｂｉ Ｐａｘ５，ａｎｄＥ２ １７６：６８３９−６８５１ ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）：ｔｗ ）； ｏ Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグ Ｐｈａｓｅ ｒａｃｔｏｒｙ ＩＩ ｓｔｕｄｉｅｓ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｒｅｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面 １０９（１１）：４６ ５５−６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５、Ｈｕｍａｎ のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の 50 非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈら、１９９０、 ( 40 ) JP 77 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘｏｆ 、Ｎａｔｕｒｅ A 2015.7.9 78 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒ 2015-519076 ｔ ）免疫グロブリン配列による挿入または置換を含む遺伝 ｒｅｃｅｐｔｏ 子改変動物を作製することができる。上記異種免疫グロ ｔｈｅ ＩｇＭ ｏｆ ｃｌａｓｓ ３４３：７６０−７６２）；および ブリン重鎖配列が由来する種は多種多様であり得、免疫 グロブリン軽鎖配列置換に利用される免疫グロブリン軽 親和性選択（Ｒａｏら、２００２、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ 鎖配列、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に関して ｉａｌ も多種多様であり得る。例示的な異種免疫グロブリン重 ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ ｂｉｔｏｒｙ ＩｇＧ ｇａｍｍａＲＩＩＢ ｔｅｒ ｏｒ Ｆｃ ｏｎ ｃｅｌｌｓ： ｉｎｈｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｒｍｉｎａｌ Ｆｃ ｃｅｎ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｎｉｔｙ ｔｈｅ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ、Ｊ ｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉ 10 【０３０８】 様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸 配列、例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントは、 １６ ヒトまたは非ヒト動物から得られる。Ｖ、Ｄおよび／ま ９：１８５９−１８６８）および免疫グロブリン血清濃 たはＪセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、 度（Ｂｒａｍｂｅｌｌら、１９６４、Ａ Ｔｈｅｏｒｅ 例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生 ｏｆ Ｇａｍｍａ−Ｇｌｏｂ 類、爬虫類、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）が挙げ ｔｉｃａｌ ｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ 鎖配列としては、ヒト配列が挙げられる Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｎａｔｕｒｅ ３：１３５２−１３５４；Ｊｕｎｇｈａｎｓ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９６、Ｔｈｅ ｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｏｌｉｓｍ ｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔ ＩｇＧ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ られる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げら れる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、 ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、 ｃａｔａ バッファロー）、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯 ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏ 動物および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、オラ ｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔａｌ ２０ ａｎｄ ｎｅｏｎａ 20 ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＮＡＳＵＳＡ ンウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ ）が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウス ９３：５５１２− およびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択 ５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍら、２００ される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマ ６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌ ウスである。この文脈から明白であるように、様々な非 ａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏ ヒト動物（例えば、サメ、エイ、哺乳類、例えば、ラク Ｉｍｍｕｎｏｌ ６４：１７ ダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット）を可変ドメ Ｒａｖｅ インまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用す ｏｆ ｔｈｅ ｎｓｅ、Ｓｃａｎｄ Ｊ ７−１８４；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ ｔｃｈ、２００７、Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｆ ａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ａｄ ９６：１７９−２０４）を低減さ 30 ることができる。 【０３０９】 上記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグ せ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体 メントと併用される定常領域配列の源としても使用され の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不 る。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連 全は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座におけるその天然 結される導入遺伝子（例えば、齧歯動物、例えばマウス の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域 もしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可 のみのｉｎ ｓｉｔｕヒト化によって修正することがで 能に連結されたヒトまたは非ヒト霊長類可変配列）にお きる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環 いて齧歯動物定常配列を使用することができる。したが 境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメ って、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄおよび／ま ラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマ たはＪセグメントを齧歯動物（例えば、マウスまたはラ ウスを有効に生じさせる結果となるであろう。この方法 ットまたはハムスター）定常領域遺伝子配列に作動可能 を用いることにより、所望のキメラ遺伝子座の複雑性に 40 に連結させる。一部の実施形態では、上記ヒトＶ、Ｄお 基づいて、ヒト化遺伝子座の特定のバージョンを構築す よび／またはＪセグメント（または１つ以上の再構成Ｖ ることができる。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療 ＤＪもしくはＶＪ遺伝子）を、例えば内因性免疫グロブ のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる リン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝 。 子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺 【０３０７】 伝子配列に作動可能に連結または融合させる。 内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における挿入または 【０３１０】 置換と共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子（例 特定の実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺 えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完 伝子座におけるＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ 遺伝子セグメント 全ヒト完全マウスなど）と共に、上記内因性免疫グロブ の、単一のヒトＶＨ 、１つ以上のＤＨ および１つ以上の リン重鎖遺伝子座における異種（例えば、別の種からの 50 ＪＨ 遺伝子セグメントによる置換を含み、該単一のヒト ( 41 ) JP 79 2015-519076 A 2015.7.9 80 ＶＨ 、１つ以上のＤＨ および１つ以上のＪＨ 遺伝子セグ せる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖 メントが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能 遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変 に連結されているものであるマウスを提供し、この場合 としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫 のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝 産生能力の喪失を挙げることができる。様々な実施形態 子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまた において、マウスゲノム内におけるヒト免疫グロブリン はラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結された非 配列の操作は、改変マウス系統に無いと有害な内因性配 再構成または再構成ヒトＶＬ およびヒトＪＬ 遺伝子セグ 列を維持する方法を含む。例示的な有害効果としては、 メントを含む。様々な実施形態において、上記単一のヒ 改変系統の繁殖不能、必須遺伝子の機能喪失、ポリペプ トＶＨ 遺伝子セグメントは、多型遺伝子セグメントであ チドの発現不能などを挙げることができる。かかる有害 る。１つの実施形態において、上記単一のヒトＶＨ 遺伝 10 効果は、上記マウスゲノムに行われる改変に直接的また 子セグメントは、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントま は間接的に関係する場合がある。 たはヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントである。 【０３１４】 【０３１１】 免疫グロブリン遺伝子座がヒト化されたマウスにおいて 子孫を産生するマウスの能力を維持しながら、限定され 観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず たヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖遺伝子座での、マ 、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部の ウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座 アプローチでは遭遇しない、免疫グロブリン配列の直接 のｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子置換、およびヒト生殖細胞系免 置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒ 疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座での、マウス生殖細胞系免 トの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は 疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座のｉｎ 、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウス ｓｉｔ ｕ遺伝子置換のための方法を記載する。具体的には、上 20 の繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的 記マウス定常領域をインタクトで残しながら、６メガ塩 には、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウ 基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子 スＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免 遺伝子座の両方をヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖 疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在 配列で正確に置換することを記載する。結果として、マ する。 ウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫 【０３１５】 グロブリン可変レパートリーすべてがヒト生殖細胞系免 すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座の転写制御 疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み 領域を含め、ハイブリッド遺伝子座内の隣接するマウス 出した。上記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させ 配列はインタクト、かつ、機能的のままとしながら、６ て、再構成して生理的に適切なレベルで発現するキメラ メガ塩基のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＶＨ − ヒト−マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現 30 ＤＨ −ＪＨ ）可変領域の、限定されたヒト免疫グロブリ する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらは ン重鎖遺伝子座による、ｉｎ ヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。 置換を実施した（図１および図８）。さらに、操作工程 【０３１２】 を実施して、野生型マウスと幾分同程度に交配して子孫 本明細書に記載の遺伝子改変マウスは、完全に機能的な を生む能力をマウスに付与するマウス配列を維持した（ 体液性免疫系を示し、病原性抗原、例えばウイルス抗原 図９および図１０）。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮ と闘うために有効である薬学的に許容され得る抗体およ Ｅ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６ び他の抗原結合タンパク質を作製するための自然親和性 ，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、 成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を ２００３，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ ｇｅｎｏ 提供する。 【０３１３】 40 ｍｅ ｏｆ ｃｏｕｐｌｅｄ ｓｉｔｕにおける正確な ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏ マウスゲノム内の正確な位置（例えば、内因性マウス免 ｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 疫グロブリン遺伝子座）におけるヒト免疫グロブリンの ｓ，Ｎａｔ 操作は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の ５９参照）を用いて、キメラＢＡＣターゲティングベク 分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免 ターを介し、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、２７の 疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マ ヒトＤＨ 遺伝子セグメント、および６のヒトＪＨ 遺伝子 ウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能 セグメントおよびマウスＡＤＡＭ６遺伝子を、マウスＥ 的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グ Ｓ細胞に導入した。 ロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウ 限定された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントを ス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化ま 有するマウス たは操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさ 50 【０３１６】 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ａｎａｌｙｓｉ ２１：６５２−６ ( 42 ) JP 81 2015-519076 A 2015.7.9 82 限られた数のＶＨ 遺伝子、および１つ以上のＤ遺伝子お あり、ＩｇＭレベルが野生型の５∼１０％であり、Ｉｇ よび１つ以上のＪ遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子座 Ｇ１レベルは野生型の０．１∼１％に過ぎない。観察さ を含む非ヒト動物を、それらを作製する方法およびそれ れたＩｇＭレパートリーは、高度に限定された接合部の らを用いる方法と同様に、提供する。対象となる抗原で 多様性を明らかにした。完全ヒト重鎖は、大部分が抗原 免疫されると、上記非ヒト動物は、予め限定された選択 をわたって同一のＣＤＲ３の長さ、抗原をわたって同じ ＶＨ 遺伝子またはＶＨ 遺伝子のセット（例えば、予め選 ＪＨ （ＪＨ ２）の使用、および最初の接合部のＱ残基を 択されたＶＨ 遺伝子およびその変異体）のみに由来する 提示し、したがって、ＣＤＲ３の多様性のある程度の欠 抗体の可変領域を有するＢ細胞集団を生成する。様々な 如を反映する。完全マウスλ軽鎖はほぼすべてが、Ｊλ 実施形態において、ヒト重鎖可変ドメインであるヒト抗 １内に最初の接合部残基としてのＷ９６Ｌ置換を有した 体可変ドメインを、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に 10 。報告によれば、マウスは、細菌性多糖に対するいかな 発現するＢ細胞集団を生成する非ヒト動物を提供する。 る抗体を生成することもできない。ヒト可変ドメインを 様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、非再構成 マウス軽鎖とカップリングさせるため、ヒト可変領域の 非ヒト可変領域配列の、非再構成ヒト可変領域配列によ 有用性は、大きく制限される。 る置換または挿入を含む改変内因性マウス免疫グロブリ 【０３１９】 ン遺伝子座に由来するヒト重鎖可変遺伝子セグメントお 単一のヒトＶＨ ３−２３遺伝子だけ、ヒトＤＨ 遺伝子お よびヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを再構成する。 よびヒトＪＨ 遺伝子、およびマウス軽鎖遺伝子を有する 【０３１７】 他のマウスが報告されているが、これらは、ヒトＶＨ ド 免疫グロブリン遺伝子の組織化、構造、および機能につ メインとマウスＶＬ ドメインとの誤対合の可能性（例え いての初期の研究は、内因性遺伝子座を無能とし、部分 ば、Ｍａｇｅｅｄら、２００１，Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍ 的なヒト免疫グロブリン遺伝子、例えば、ヒト定常遺伝 20 ｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ 子と連結されたヒト重鎖遺伝子の部分的なレパートリー ａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ であって、ヒト軽鎖導入遺伝子の存在下または非存在下 Ｖ３−２３ で、ゲノムにランダムに挿入されたレパートリーを有す ｅｎｅｒａｔｅｓ るトランスジェニック遺伝子座（ランダムに配置された ｉｖｅ ｗｉｔｈ ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ ａｎｔｉｇ ）を有するように操作されたマウスについて部分的にな ｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＶＨ ＣＤＲ された。これらのマウスは、有用な高親和性抗体を作製 ３ ａｎｄ するには何らかの点で最適に満たなかったが、免疫グロ ｔｏ ブリン遺伝子座についての特定の機能的な解析を容易と ｅ ｒｅｇｉｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ した。これらのマウスのうちの一部は、２つもしくは３ ．１２３：１−５参照）に部分的に起因して、多様性の つ程度、なおまたは単一の重鎖可変遺伝子だけという少 30 制限を呈示する（したがって、有用性の制限も呈示する 数の重鎖可変遺伝子を有した。 ）。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内 【０３１８】 に、ヒトＤＨ 遺伝子およびヒトＪＨ 遺伝子と共に２つの ランダムに挿入された導入遺伝子（および無能とした内 ＶＨ 遺伝子（３−２３および６−１）を保有し（Ｂｒｕ 因性免疫グロブリン遺伝子座）上のヒトμ定常遺伝子お ｇｇｅｍａｎｎら、１９９１，Ｈｕｍａｎ よびヒトγ１定常遺伝子と共に、単一のヒトＶＨ ５−５ ｏｄｙ １遺伝子および１０のヒトＤＨ 遺伝子および６のヒトＪ ｉｃ Ｈ 遺伝子に由来する完全ヒト免疫グロブリン重鎖を発現 するマウスが報告されている（Ｘｕ ａｎｄ ｓ，２０００，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ＤＲ３ Ｉｓ Ｓｕｆｆｉ 40 Ｒｅｇｉｏｎ ｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｏｆ Ｍｏｓｔ ＶＨ Ｄａｖｉ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃ Ｓ １３： ｈｕｍａｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ １ ＩｇＨ ｌｏｃ てそれらを発現するマウスは、誤対合によるレパートリ ーの制限を呈示し得る（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ−Ｙｏｕｎ ｇら、２００３，Ｔｈｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｅ ｈｕｍａｎ ｌｉｎ Ｊλ１またはＶλ２−Ｊλ２のみ）と共に発現され、κ ｒｅｇｉｏｎ 軽鎖を発現することができない（これらのマウスは、Ｉ ｎｏｌ．１３４：４２０−４２５）。 である）。これらのマウスは、Ｂ細胞の発生 ｆｒｏｍ −１３２６）、マウス軽鎖を有するヒトＩｇＭ鎖におい る２つの完全マウスλ軽鎖だけのうちの１つ（Ｖλ１− − ａｎｔｉｂ ｕｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３ ン重鎖は大半が、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に由来す ／ ｒｅａｃｔ ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎ ｅｎ − ｍｉｃｅｇ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｍｉｃｅ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ００ｋｂ ｇｅｎｅ ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌ ３７−４５）。これらのマウスの完全ヒト免疫グロブリ ｇκ ｈｅａｖｙ ｃｈ ｒｅｇｉｏｎ Ｖ３−２３ ｈｅａｖｙ ｏｆ ａｎｔｉｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕ 【０３２０】 および抗体の発現において重度に異常な機能不全を呈示 また、ゲノム内にランダムに挿入されたヒト導入遺伝子 する。報告によれば、Ｂ細胞数が野生型の５∼１０％で 50 からＶＨ が限定された完全ヒト重鎖を発現する他のトラ ( 43 ) JP 83 2015-519076 A 2015.7.9 84 ンスジェニックマウスであって、ランダムに挿入された 遺伝子セグメント（例えば、Ｖ遺伝子）の生殖細胞系配 完全ヒト導入遺伝子から発現するヒトλレパートリーが 列におけるバリエーションは、ヒトにおける抗体応答の 制限されたトランスジェニックマウスも報告されている 多様性に寄与する。Ｖ遺伝子配列の差違に起因する多様 （例えば、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２，Ａ ｔｒａｎｓ 性に対する相対的寄与は、Ｖ遺伝子間で変化する。多型 ｅｘｐｒｅｓｓｅ の程度は、遺伝子ファミリーにわたって変化し、ヒト集 ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅ 団における近縁個体と非近縁個体とのＶＨ ハプロタイプ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈ の差違において観察されるさらなる多様性を生成するこ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅ とが可能な複数のハプロタイプ（共遺伝多型（ｃｏｉｎ ｇｅｎｉｃ ｓ ａ ｉｃ ｔｈａｔ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｑｕｅｎｃｅ ａｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｖｙ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（２３）：６２８７− ｈｅｒｉｔｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する ６２９５；Ｗａｇｎｅｒら、１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄ 10 配列のストレッチ）に反映される（例えば、Ｓｏｕｒｏ ｉｅｓ ｕｊｏｎら、１９８９，Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉｌｏｃｉ ｉ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｈ Ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈａｉｎ Ｖ Ｒｅｇｉｏｎ ｔｈｅ ＶＨ ＩＩＩ Ｇｅｎ Ｒｅｓ．２２（８）：１３８９−１３９ ｅ Ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（２） ３参照）。しかし、マウスゲノムにランダムに組み込ま ：７０６−７１１参照）。特に、多型ヒトＶＨ 遺伝子フ れた導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現させ、内因性遺 ァミリーに由来するデータに基づき、一部の研究者は、 伝子座の損傷を含むトランスジェニックマウスは、野生 生殖細胞系におけるハプロタイプの多様性が、ヒト集団 型マウスと比較した免疫応答の実質的な差違であって、 におけるＶＨ 遺伝子の異質性に対する主要な寄与因子で かかるマウスから得ることができる抗体可変ドメインの あり、これが、ヒト集団にわたる異なる生殖細胞系ＶＨ 多様性に影響を及ぼす差違を呈示することが公知である 20 遺伝子の大きな多様性に反映されることを示唆している 。 （Ｓａｓｓｏら、１９９０，Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ 【０３２１】 ｎｄ 一部の実施形態において、ヒト抗体可変ドメインを、限 ＶＨ ３ 定されたＶＨ 遺伝子レパートリーならびに１つ以上のＤ ）：２７５１−２７５７参照）。 遺伝子および１つ以上のＪ遺伝子から発現する、多様な 【０３２４】 Ｂ細胞集団を生成する有用な非ヒト動物は、十分に多様 ヒト集団は、広範な多型に起因して、ＶＨ 遺伝子レパー な再構成可変領域遺伝子レパートリーを生成することが トリーに対して、ハプロタイプの大きな多様性を提示す 可能であることが好ましい。様々な実施形態において、 るが、ヒト集団内で観察される高頻度の（すなわち、保 多様性は、接合部の多様性、体細胞超変異、およびＶＨ 存的な）対立遺伝子には、特定の多型が反映される（Ｓ 遺伝子配列内の多型的多様性（ＶＨ 遺伝子が多型形態で 30 ａｓｓｏら、１９９０）。ＶＨ の多型は、２つの主要形 存在する実施形態の場合）を包含する。組み合わせの（ 態において記載され得る。第一の形態は、同じ遺伝子セ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）多様性は、ＶＨ 遺伝子が グメントの対立遺伝子の間のヌクレオチド配列間におけ 複数の同種のヒト軽鎖可変ドメイン（様々な実施形態に る差違に関連する対立遺伝子バリエーションから生じる おいて、接合部の多様性および／または体細胞超変異を バリエーションである。第二の形態は、免疫グロブリン 含む）のうちの１つと対合するときに生じる。 重鎖遺伝子座において生じた多数の複製、挿入、および 【０３２２】 ／または欠失から生じる。これは、複製により同一の遺 様々な実施形態において、限定されたヒトＶＨ 遺伝子レ 伝子から派生するＶＨ 遺伝子が、それらの各々の対立遺 パートリーおよび完全または実質的に完全なヒトＶＬ 遺 伝子と、１つ以上のヌクレオチド置換により異なる固有 伝子レパートリーを含む非ヒト動物は、接合部の多様性 の状況を結果としてもたらしている。これはまた、重鎖 （例えば、ＶＤＪ、ＶＪ接合、Ｐ付加、Ｎ付加）、組み 40 遺伝子座におけるＶＨ 遺伝子のコピー数にも直接影響す 合わせの多様性（例えば、ＶＨ が限定された同種のヒト る。 重鎖、ヒト軽鎖）、および体細胞超変異など、多様性の 【０３２５】 様々な供給源を反映するＢ細胞集団を生成する。ＶＨ レ ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ 遺 パートリーの、１つのヒトＶＨ 遺伝子への限定を含む実 伝子）の多型対立遺伝子は、大部分が遺伝子セグメント 施形態において、この１つのヒトＶＨ 遺伝子は、２つ以 の挿入／欠失およびコーディング領域内の単一のヌクレ 上の変異体において存在し得る。様々な実施形態におい オチド差違の結果であり、これらのいずれもが、免疫グ て、ＶＨ 遺伝子の２つ以上の多型形態が存在することに ロブリン分子に対して機能的結果を及ぼす潜在性を有す より、Ｂ細胞集団の可変ドメインの多様性が富化される る。表１は、ヒトＶＨ 遺伝子ファミリーにより列挙され 。 る機能的ＶＨ 遺伝子およびヒト免疫グロブリン重鎖遺伝 【０３２３】 50 Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５（８ 子座における各ＶＨ 遺伝子について同定された対立遺伝 ( 44 ) JP 85 2015-519076 A 2015.7.9 86 子の数を示す。多型ＶＨ 遺伝子は、例えば、関節リウマ 全長タンパク質配列を、それぞれ、配列番号４および配 チなど、特定の疾患に対する感受性に関与していること 列番号５に示す。図５および図６はそれぞれ、ＶＨ １− を示唆する知見も存在するが、他の場合には、ＶＨ と疾 ６９について報告される１３の対立遺伝子のＤＮＡアラ 患との連関がそれほど明瞭ではない。この多義性は、異 イメントおよびタンパク質アライメントを示す。ＶＨ １ なるヒト集団における様々な対立遺伝子のコピー数およ −２遺伝子の代表的なＤＮＡ配列およびタンパク質配列 び存在に帰せられている。実際、幾つかのヒトＶＨ 遺伝 を、それぞれ、配列番号６３および配列番号６４に示す 子（例えば、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−２６ 。図８および図９はそれぞれ、ＶＨ １−２について報告 、ＶＨ ２−７０、およびＶＨ ３−２３）は、コピー数の される５つの対立遺伝子のＤＮＡアライメントおよびタ 変動を示している。様々な実施形態において、限定され ンパク質アライメントを示す。 たＶＨ レパートリーを有する本明細書に記載のヒト化マ 10 図７および図１０はそれぞれ、ヒトＶＨ １−６９につい ウスは、個別のＶＨ ファミリーメンバーの複数の多型変 て報告される１３の対立遺伝子およびヒトＶＨ １−２に 異体を含む（例えば、内因性マウス遺伝子座におけるす ついて報告される５つの対立遺伝子に対応する、アライ べてのまたは実質的にすべての機能的マウスＶＨ セグメ ンメントされたタンパク質配列についての同一性／類似 ントを置換する、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２− 性のパーセントマトリクスを示す。様々な実施形態にお ２６、ＶＨ ２−７０、またはＶＨ ３−２３の２つ以上の いて、本発明の改変遺伝子座は、表１から選択される２ 多型変異体）。特定の実施形態において、本明細書に記 コピー以上の数で存在するＶＨ 遺伝子を含み、コピー数 載のマウスの２つ以上の多型変異体は、表１の対応する は、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数およ ＶＨ ファミリーメンバーについて示される数以下の数お び表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包 よびこの数を含めた数（例えば、ＶＨ １−６９には１３ 含する。１つの実施形態において、本発明の改変遺伝子 の変異体があり、ＶＨ １−２には５つの変異体があるな 20 座は、表２から選択される２コピー以上の数で存在する ど）である。 ＶＨ １−６９またはＶＨ １−２遺伝子を含み、コピー数 【０３２６】 は、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数およ 当該技術分野においては、特定のヒトＶＨ 遺伝子の一般 び表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包 に観察される変異体が公知である。例えば、ＶＨ 遺伝子 含する。 座において最も複雑な多型のうちの１つは、ＶＨ １−６ 【表１−１】 ９遺伝子に属する。ヒトＶＨ １−６９遺伝子には、１３ の対立遺伝子が報告されており（Ｓａｓｓｏら、１９９ ３，Ａ ｆｅｔａｌｌｙ ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｎｇｓ ｔｏ ａ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＶＨ １ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｌｌｅｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｌ ｓｅｔ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｍｍ ｂｅｌｏ ｏｆ ａ 30 Ｃｌｉｎｉｃａ ９１：２３５８−２ ３６７；Ｓａｓｓｏら、１９９６，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ ｏｆｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌ ｔｏ ｐｙ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ５１ｐ１ ｉｔｓ ｉｓ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｎｕｍｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｉｃａｌ ＶＨ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｃｏ Ｃｌｉｎ ９７（９）： ２０７４−２０８０）、ヒトＶＨ １−６９遺伝子は、Ｖ Ｈ １−６９遺伝子の複製を保有する少なくとも３つのハ 40 プロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのＶＨ 遺伝子の複数コピーを結果としてもたらすハプロタイプ で存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領 域（ＣＤＲ）に差違を包含し、これは、抗原の特異性に 劇的に影響し得る。表２は、ヒトＶＨ １−６９およびヒ トＶＨ １−２遺伝子について報告される対立遺伝子なら びに成熟重鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配 列の配列番号を示す。 【０３２７】 ＶＨ １−６９遺伝子の代表的なゲノムＤＮＡ配列および 50 ( 45 ) JP 87 2015-519076 A 2015.7.9 88 20 【表２】 抗原依存性重鎖可変遺伝子の使用 【表１−２】 【０３２８】 ＶＨ 遺伝子の抗原依存性の優先的使用を、臨床的に有意 義な抗原を標的とするヒト治療剤を開発するのに利用す 40 ることができる。特定のＶＨ 遺伝子を用いて抗体可変ド メインレパートリーを生成することができれば、ヒト治 療剤において用いるための高親和性の抗体可変ドメイン の探索に大きな利点をもたらすことができる。ナイーブ マウスおよび抗体可変ドメインにおけるヒトＶＨ 遺伝子 の使用についての研究は、大半の重鎖可変ドメインが、 特定の単一のＶＨ 遺伝子にも、主として用いられるＶＨ 遺伝子にも由来しないことを明らかにする。他方、特定 の抗原に対する抗体応答についての研究は、場合によっ て、特定の抗体応答は、免疫後のＢ細胞レパートリーに 50 おける特定のＶＨ 遺伝子の偏った使用を提示することを ( 46 ) JP 89 2015-519076 A 2015.7.9 90 明らかにする。 ）。ＶＨ ４ファミリーでは、メンバー４−５９および４ 【０３２９】 −４ｂ（同上）のほか、４−３９および４−３４が比較 ヒトＶＨ レパートリーは、極めて多様であるが、ＶＨ 遺 的高頻度であることが見出された（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈ 伝子のランダムな選択を仮定するある推定値によれば、 ｅｃｋら、１９９７，Ａｎａｌｙｓｉｓ 所与の任意のＶＨ 遺伝子使用の予測される頻度は、約２ Ｈｕｍａｎ ＶＨ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ％である（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５，Ａｎ ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（１０）：２４８ ａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨｅａｖｙＣｈａｉｎ ８−２５０１）。他の報告は、活性化した重鎖レパート ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐ リーが、ＶＨ ５の高度な発現およびＶＨ ３の低度な発現 Ｂ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌ を利するように偏っていることを仮定している（Ｖａｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｈｅｒａｌ ｅ−Ｃｅｌｌ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅ 10 Ｄｉｊｋ−Ｈａｒｄ ａｎｄ Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ， ａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９０− ２００２，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ２０２）。しかし、ヒトの末梢Ｂ細胞におけるＶＨ の使 ｆａｄｕｌｔ 用は、偏ったものである。一研究では、機能的Ｖ遺伝子 ｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ の存在度は、ＶＨ ３＞ＶＨ ４＞ＶＨ １＞ＶＨ ２＞ＶＨ ５ ３６−１４４）。他の研究は、成人ヒトレパートリーに ＞ＶＨ ６というパターンに従った（Ｄａｖｉｄｋｏｖａ おいて最も一般的に用いられるＶＨ 遺伝子が、ＶＨ ４− ら、１９９７，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ５９に続いて、ＶＨ ３−２３およびＶＨ ３−４８である ＶＨ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｕｓａｇｅ Ａｄｕｌｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｈｕｍａｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏ ｒｅｐ １０７：１ ことを主張している（Ａｒｎａｏｕｔら、２００１，Ｈ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃ ｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：６２−７３）。初 ｎ ｏｆ 期の一研究では、ＶＨ ３ファミリーの使用頻度が約０． 20 Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ６５であるのに対し、ＶＨ １ファミリーの使用頻度は約 Ｓ ＯＮＥ ０．１５であることが推定され、これらの観察および他 は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな の観察は、ヒトＶＨ レパートリーの生殖細胞系の複雑性 分散を呈示するが、まとめると、研究は、Ｖ遺伝子の発 は、正常の生殖細胞系ＶＨ レパートリーを有するヒトの 現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、 末梢Ｂ細胞区画では正確には反映されないという、マウ 特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況は スにおいて観察される状況（すなわち、ＶＨ 遺伝子発現 、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利で は非確率論的であるという状況）と類似する状況を示唆 あることを確立している。 する（Ｚｏｕａｌｉ 【０３３０】 Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ ＶＨ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｒａｌ Ｔｈｅｓｅ，１９９１， Ｇｅｎｅ−Ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｂ Ｃｅｌｌｓ Ｕｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏ Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，ＰＬｏ ６（８）：１０８）。使用についての研究 徐々に、特定の抗原に応答して生成したヒト重鎖可変ド Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈ 30 メインについて観察されるレパートリーは、高度に限定 ｂｙ Ｓｉｔｕ Ｈ されることが明らかとなった。一部の抗原は、有効な中 ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４ 和抗体は１つのＶＨ 遺伝子のみに本質的に由来するとい ６（８）：２８５５−２８６４）。一報告によれば、ヒ う意味で、ほとんどもっぱらある特定のＶＨ 遺伝子のみ トにおけるＶＨ 遺伝子使用は、最大から最小の順にＶＨ を有する中和抗体と会合する。臨床的に重要な多数のヒ ３＞ＶＨ ４＞ＶＨ １＞ＶＨ ５＞ＶＨ ２＞ＶＨ ６であり、 ト病原体についても同じことが当てはまる。 末梢Ｂ細胞における再構成は、ＶＨ ３ファミリーの使用 【０３３１】 は、生殖細胞系ＶＨ ３遺伝子の相対数に基づき予測され ＶＨ １−６９に由来する重鎖は、治療的に有意義である る使用より高度であることを明らかにする（Ｂｒｅｚｉ 多様な抗原特異的抗体レパートリーにおいて観察されて ｎｓｃｈｅｋら、１９９５）。別の報告によれば、ヒト いる。例えば、ＶＨ １−６９は、アトピー性疾患を有す におけるＶＨ 使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェ 40 る幼齢小児における末梢血リンパ球のＩｇＥレパートリ ンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性Ｂ細胞の解 ーの重鎖転写物において高頻度で観察された（Ｂａｎｄ 析（Ｄａｖｉｄｋｏｖａら、１９９７，Ｓｅｌｅｃｔｉ ｏら、２００４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｖｅ ｏｆ Ｕｓａｇｅ ｄｕｌｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＶＨ Ｉｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＢＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａ Ｒｅ ＶＨ ε ＰＢＬ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｐｉｃ ．４５：６２−７３）に基づくパターンＶＨ ３＞ＶＨ ５ ｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＞ＶＨ ２＞ＶＨ １＞ＶＨ ４＞ＶＨ ６に従う。一報告は、 ｅｄ 最も高頻度で用いられるＶＨ ３ファミリーメンバーの中 ｉｎ ｗｉｔｈ ａｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＶＨ １−６９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏ ｄｅｒｉｖ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｉｍｍｕｎ には、３−２３、３−３０、および３−５４があること ｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９４：９９−１０６）。 を主張している（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５ 50 Ｂ細胞リンパ腫ではまた、高度の体細胞超変異を有する ( 47 ) JP 91 ｃｅｌｌ ｅｄ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｗｉｔｈ ｒｉａｂｌｅ ｕｓｅ ｉｓ Ｂ− ｖｉｒｕｓ ｒａｉｎｅｄ ａｎｄ ｏｆ ＶＨ １−６９ ａｎｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ｖａ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｏｆ ｈｙｐｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ＶＨ ４−５９ Ｊｏｕｒｎａｌ １６２：６１１−６ ｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｕｎｏｌｏｇｙ ａｌ ｖｉｒｕｓ い）一部のＶＨ １−６９に由来する重鎖が観察されてい ｕｒｅ る（Ｐｏｓら、２００８，ＶＨ １−６９ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｍ ｔｙｐｅ ＩＩ ｍｏｄｅｌ ｌｙｍｐｈ ｏｆ Ｉｍｍ １７４：６５３２−６５３９；Ｗａｎ Ｐａｌｅｓｅ，２００９，Ｕｎｉｖｅｒｓ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ？，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ １６（３）：２３３−２３４；Ｓｕｉ ら、２００９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎ ｔｏｗａｒｄｓ ＡＤＡＭＴＳ１３ ｉｎ ｃｔｉｏｎａｌ ｂｒｏａｄ−ｓ ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｔｈ ｐｅｃｔｒｕｍ ｅｃｔｅｄ ｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｂｏｓｉｓ ｄｉｒ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ 体細胞超変異がわずかである∼体細胞超変異がみられな ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｘｐａｎｓｉ ｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ 中では、本質的に生殖細胞系配列を有する（すなわち、 ｅｎｃｏｄｅｄ ｕｎｃｏｎｓｔ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｇ ａｎｄ ｇｅｒｍｌｉ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ：Ａ ｏｆ Ｃ ｏｆ ＶＨ １−６９−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｍｏｒｙ １８）一方、血液障害を有する患者における自己抗体の 10 ｎｅ 2015.7.9 ｒｂｏｎａｒｉら、２００５，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔ ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｍｕｔａｔｅｄ A 92 ＶＨ １−６９に由来する重鎖が生じる（Ｐｅｒｅｚら、 ２００９，Ｐｒｉｍａｒｙ 2015-519076 ａｎｄ ｏｆ Ｔｈｒｏｍ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７：４ 20 ａｖｉａｎ ａ Ａ ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ ｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６（ ２１−４２８）。 ３）：２６５−２７３；Ｍａｒａｓｃａら、２００１， 【０３３２】 Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ さらに、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、およびＣ型 ｉｏｎｓ 肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス抗原に対する中 ＶＨ １−６９ 和抗体であって、生殖細胞系のＶＨ １−６９に由来する ｓ ｉｎ 配列および／または体細胞変異させたＶＨ １−６９に由 ｉｔｉｖｅ 来する配列を使用する中和抗体も見出されている（Ｍｉ ｕｓ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｋｌｏｓら、２０００，Ｓａｌｉｖａｒｙ ｌ Ｚｏｎｅ ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｅｑｕｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ＶＨ ｕｓｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ，Ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｇｌａｎｄ ａｎｄ ＶＨ ４−３４ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｓｅｇｍｅｎｔ ＣＶｉｒｕｓ−Ｐｏｓ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｎｏｄａｌ Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｍｕｔａｔ Ｕｓｅ ｏｆ Ｃ Ｖｉｒ Ｍａｒｇｉｎａ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ａｍ ｌｙｍｐｈｏ ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９（１）：２５３−２６１） ｉｍｍｕｎｏ 30 。 ｓｈｏｗ Ｖ１−６９ ＣＤＲ３ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｆｒ ｗｉｔｈ 【０３３３】 ＶＨ 使用の偏向はまた、ヒトにおけるｂ型Ｈａｅｍｏｐ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ ＰＳ）に ９５（１２）：３８７８−３８８４；Ｋ 対する体液性免疫応答においても観察される。研究は、 ｕｎｅｒｔら、２００４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ ＶＨ ＩＩＩファミリー（ＶＨ ＩＩＩｂサブファミリー、 ｉｏｎ 特に、ＶＨ ９．１）が、多様なＤ遺伝子およびＪ遺伝子 ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ，ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ ｉｔｒｏ ｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＩｇＭ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｎｇ ｔｙｐｅＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｏｆ Ｂ ｎｏｒｍａｌ ｇ ｔｏ Ｃ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｕｓｅｄ Ｂ Ｒｅｔ ｉｓ ｂｙ ｈｅ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｔｈｅ ，Ｂｌｏｏｄ ４Ｅ１０，ａｎ ２０（７）：７５５−７６２；Ｃ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｄ ｖ ｎｅｕｔｒａｌｉｚ 40 ｈａｎら、２００１，ＶＨ １−６９ ｐａｔｉｔｉｓ ｉｎ ＩｇＧ ａｎ ｃｅｌｌｓ Ｅ２ ａｎｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ９７（４）：１０２３−１０２６；Ｃａ 50 と共に、Ｈｉｂ ＰＳに対するヒト体液性応答をもっぱ ら特徴づけることを示唆する（Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１ ９９１，Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｖ Ｇｅｎｅ Ｕｓａｇｅ ｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｂ Ｉｇ ｉｎ Ｈ Ｃｈａｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｃａｐｓｕｌａｒ Ｈａ Ｔｙｐｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ ｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（５）：１６６７−１ ６７４；Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１９９３，Ｒｅｓｔｒｉ ｃｔｅｄ ａｇｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ＶＤＪ ｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｅ ｂ ＶＨ Ｕｓ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｉ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｃａｐｓｕｌａｒ ｔｏ Ｈ Ｔｙｐ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ ( 48 ) JP 93 2015-519076 A 2015.7.9 94 ｄｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２７３４− ｓｋｉら、１９９６）。さらに、ＶＨ 遺伝子は一般に、 ２７４３）。ヒトＪＨ 遺伝子もまた、偏向性の使用を提 個体においてすべての多型形態では存在せず、特定の集 示し、ＪＨ ４およびＪＨ ６は、ヒトの末梢Ｂ細胞中の約 団内の特定の個体が１つの変異体を保有するのに対し、 ３８∼４１％で観察されている（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅ 他の集団内の個体は異なる変異体を保有する。したがっ ｋら、１９９５）。 て、様々な実施形態において、単一のＶＨ 遺伝子および 【０３３４】 その変異体に限定された生物系が利用可能であれば、限 ＨＩＶ−１に感染したヒトにおけるＶＨ 使用は、ＶＨ ３ 定されたＶＨ 遺伝子に基づき抗体の可変領域（例えば、 使用に対して不利に偏向し、ＶＨ １およびＶＨ ４遺伝子 ヒト重鎖および軽鎖の同種のドメイン）を生成するため ファミリーに有利である（Ｗｉｓｎｅｗｓｋｉら、１９ の、これまで利用されなかった多様性の供給源がもたら ９６，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ される。 ｅ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｉｏｎ −１ Ｖａｒｉａｂｌ 10 Ｕｓａｇｅｉｎ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓ＆Ｈｕｍａｎ 【０３３７】 Ｉ 限定されたＶＨ 遺伝子セグメントを使用してヒト重鎖可 Ｓｙｎｄｒｏｍｅ 変領域を発現する遺伝子改変マウスは、接合部が多様で Ｒｅｔｒｏｖｉｏｌｏｇｙ １１（１ あり、組み合わせが多様であり、体細胞変異させた、高 ）：３１−３８）。しかし、罹患した患者に由来する骨 親和性ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の比較的大きな 髄のｃＤＮＡ解析は、機能的Ｂ細胞レパートリーでは発 レパートリーを、他の点では限定されたレパートリーか 現しない有意なＶＨ ３使用を明らかにし、そこでは、Ｖ ら生成するのに有用である。この場合、限定されたレパ ｖｉｔｒｏにおけ ートリーは、予め選択されたＶ遺伝子以外のいかなるＶ る有効なＨＩＶ−１の中和を呈示した（同上）。ＨＩＶ 遺伝子に由来する再構成重鎖遺伝子も形成できないマウ −１感染に対する体液性免疫応答はおそらくＶＨ におけ 20 スを結果としてもたらす、生殖細胞系遺伝子の所定の制 る限定に起因して減衰するので、本明細書に記載の改変 限を指す。予め選択されたＶ遺伝子は使用するが、予め 非ヒト動物（ＨＩＶ−１により感染可能でない）は、本 選択されたＤ遺伝子および／またはＪ遺伝子は使用しな 明細書に記載の遺伝子改変動物において存在する特定の い実施形態において、レパートリーは、Ｖ遺伝子の正体 ＶＨ 遺伝子に由来するが、罹患したヒトの限定されたレ に関しては限定されるが、Ｄ遺伝子および／またはＪ遺 パートリーにおいて観察されるＶＨ 遺伝子とは異なるＶ 伝子の正体に関しては限定されない。予め選択されたＶ 遺伝子に由来する中和抗体ドメインを生成するのに有 遺伝子（ならびに任意の予め選択されたＤ遺伝子および Ｈ Ｈ ３使用を反映するＦａｂが、ｉｎ 用となり得ることを仮定し得る。 ／またはＪ遺伝子）の正体は、いかなる特定のＶ遺伝子 【０３３５】 にも制限されない。 したがって、例えば、ＨＩＶ−１で免疫された、ＶＨ が 【０３３８】 限定されたマウス（例えば、ＶＨ ３ファミリーメンバー 30 マウスが、単一のＶＨ 遺伝子（単一のセグメントまたは およびその（１つ以上の）多型に限定されたマウス）に 変異体のセットとして存在する）を、多様なヒトＤおよ おいて、高親和性ヒト抗体可変ドメインを生成すること びＪ遺伝子セグメント（例えば、ＤＨ セグメントおよび ができれば、かかる免疫したマウスの限定された（例え ＪＨ セグメント）と共に再構成するように、マウスをデ ば、ＶＨ ３ファミリーメンバーまたはその（１つ以上の ザインすることにより、ｉｎ ）変異体に限定された）レパートリーを徹底的に発掘す 部多様性／組み合わせ多様性／体細胞超変異の並べ替え ることにより、ＨＩＶ−１を中和する有効なヒト治療剤 機構であって、結果として得られる再構成重鎖可変領域 をデザインするための豊富な資源を提供し得る。 配列（場合によって、例えば、Ｖ／Ｄ／ＪまたはＶ／Ｊ 【０３３６】 ）における変異を繰り返すのに用いられ得る並べ替え機 ヒト抗体応答の、特定の病原体への限定は、抗体の可変 構がもたらされる。かかるマウスでは、単一の予め選択 領域であって、病原体に対する高親和性の中和抗体をデ 40 されたＶＨ 遺伝子（またはその変異体）に基づくクロー ザインするための足がかりとして機能し得る可変領域を ン選択工程を行って、対象となる抗原に結合する適切な 、罹患したヒトから得る可能性を低減し得る。例えば、 可変領域を選択する。マウスのクローン選択成分は、単 ＨＩＶ−１感染に対するヒト免疫応答は、ＨＩＶ−１感 一の予め選択されたＶＨ 遺伝子セグメントに基づく選択 染を通じて、かつ、ＡＩＤＳへの進行においてクローン に使われる（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）ため、バックグラウ 的に限定される（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９３，Ｂ−ｃｅ ンドノイズは大部分が根絶される。ＶＨ 遺伝子セグメン ｌｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｃｔｅｄ ＨＩＶ−１ ａｎｄ ｖｉｖｏにおける、接合 ｉｎ ＡＩＤＳ： トを慎重に選択することにより、クローン的に選択され ｃｌｏｎａｌｌｙ ｒｅｓｔｒ る比較的多数の抗原特異的抗体を、Ｖセグメントの多様 ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３２７−３３４；Ｗｉｓｎｅｗ 50 性が大きなマウスによる場合より短い期間でスクリーニ ングすることができる。 【０３３９】 ( 49 ) JP 95 2015-519076 A 2015.7.9 96 様々な実施形態において、マウスを予め選択して単一の 鎖配列に関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置換に Ｖセグメントに限定することにより、Ｖ／Ｄ／Ｊ接合部 関してホモ接合性の雌と交配させて、上記限定されたヒ を、Ｄ領域およびＪ領域で組み換えるためのＶセグメン ト重鎖可変配列に関してヘテロ接合性の後代を産生し、 トが単一ではなくて最高４０以上あるマウスにおいて観 その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させる。上 察される速度より速い速度で並べ替えるための系がもた 記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は らされる。他のＶセグメントを除去することにより、遺 、ホモ接合型雄マウスにおいて機能的ＡＤＡＭ６タンパ 伝子座は、予め選択されたＶセグメントに対して、他の ク質が存在しないことによると本発明者らは決定した。 Ｖセグメントを除去しない場合に観察されるＶ／Ｄ／Ｊ 【０３４２】 の組み合わせより多くのＶ／Ｄ／Ｊの組み合わせを形成 様々な態様において、損傷した（すなわち、非機能的ま するように解放される。予め選択されたＶの、複数のＤ 10 たはわずかに機能的な）ＡＤＡＭ６遺伝子を含む雄マウ セグメントのうちの１つおよび複数のＪセグメントのう スは、妊性の低減または除去を示す。マウス（および他 ちの１つによる組換えから生じる転写物数が増大すると の齧歯動物）ではＡＤＡＭ６遺伝子が免疫グロブリン重 、これらの転写物は、プレＢ細胞の形態にあるクローン 鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、ヒト化された免 選択系に供給され、このため、クローン選択系は、予め 疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを繁殖させるた 選択されたＶ領域を発現するＢ細胞の循環に使われる。 めに、または該マウスの系統を作り、維持するために、 このようにして、予め選択されたＶセグメントに由来す 様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決 るＶ領域であって、所与の時間量において他の形で可能 定した。ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座 となるより固有性の高い領域を、生物体を介してスクリ に関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性 ーニングすることができる。 は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々 【０３４０】 20 な実施形態において、上記系統の維持は、上記ヒト化重 様々な態様では、予め選択されたＶ領域についての、接 鎖遺伝子座に関してホモ接合性の雄マウスによって示さ 合部におけるＶ／Ｄ組換えの多様性を増強するマウスが れる不妊問題の回避を含む。 記載される。なぜなら、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子 【０３４３】 座のすべてのまたは実質的にすべての組換えは、かかる １つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持 マウスにおいて配置される、予め選択されたＶセグメン するための方法を提供する。マウスの上記系統は、異所 トおよびＤセグメントおよびＪセグメントの組換えであ 性ＡＤＡＭ６配列を含む必要がなく、様々な実施形態に るためであるしたがって、マウスは、ベースのＶＨ 遺伝 おいて、マウスの上記系統は、ＡＤＡＭ６のノックアウ 子レパートリーまたは限定されたＶＨ 遺伝子レパートリ ト（例えば、機能的ノックアウト）に関してホモ接合性 ーを用いて、ＣＤＲ３セグメントの多様性を生成するた またはヘテロ接合性である。 めの方法をもたらす。 30 【０３４４】 マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能 上記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または 【０３４１】 喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖 いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力 遺伝子座の改変を含む。１つの実施形態において、上記 が無い雄マウスは、驚くべきことに、交配して子孫を産 改変は、ＡＤＡＭ６遺伝子の調節領域および／またはコ 生する該マウスの能力の欠陥を示す。これらのマウスに ーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において は、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブ 、上記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減さ リン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セ せるまたは除去する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（調節領域 グメントで置換することによって機能的ＡＤＡＭ６タン および／またはコーディング領域）の改変を含む；特定 パク質を発現する能力が無い。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、 の実施形態において、上記改変は、その改変に関してホ ＤＨ 遺伝子セグメントの上流にあるＶＨ 遺伝子セグメン 40 モ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは除去 ト遺伝子座の３’末端の近位の、上記内因性マウス免疫 する。 グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にある 【０３４５】 ため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。 １つの実施形態において、上記マウス系統は、ＡＤＡＭ すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変 ６遺伝子のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト 配列の、限定されたヒト重鎖可変配列による置換に関し ）または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性で てホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞ ある。 れが該限定されたヒト重鎖配列に関してホモ接合性であ 【０３４６】 り、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に １つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性また 厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、頻度が低 はヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、 く、サイズが小さい。その代り、上記限定されたヒト重 50 および宿主胚において上記ドナー細胞を用いること、お ( 50 ) JP 97 2015-519076 A 2015.7.9 98 よび代理母において上記宿主胚およびドナー細胞を妊娠 交配させて、上記系統において上記遺伝子改変を維持す させること、および上記遺伝子改変を含む後代を上記代 る方法を提供する。 理母から得ることによって、上記マウス系統を維持する 特定の実施形態において、上記系統は、ホモ接合性雄と 。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、ＥＳ細 野生型雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性も 胞である。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は しくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維 、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。 持されない。 【０３４７】 【０３５２】 １つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性また 上記ＡＤＡＭ６タンパク質は、ディスインテグリンおよ はヘテロ接合性であるマウスから、上記改変を含む核酸 びメタロプロテアーゼ（Ａ 配列を単離すること、および上記核酸配列を宿主核に導 10 Ａｎｄ 入すること、および好適な動物において上記核酸配列お ）タンパク質ファミリーのメンバーであり、これは、細 よび上記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、 胞接着をはじめとする多様な機能を有するタンパク質の 上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記 ラージファミリーである。ＡＤＡＭファミリーの一部の 核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。 メンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、 【０３４８】 ＡＤＡＭ２は、精子−卵子相互作用に関与するタンパク １つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性また 質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡ はヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、お Ｍ３、すなわちシリテスチンは、透明帯への精子の結合 よび上記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動 に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３ 物において上記核および宿主細胞を妊娠させて、上記改 いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤ 変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を 20 ＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細 得ることによって、上記マウス系統を維持する。 胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。ヒト免 【０３４９】 疫グロブリン重鎖遺伝子座においてヒトＶＨ 遺伝子セグ １つの実施形態では、上記遺伝子改変を含む雄マウスか メントＶＨ １−２とＶＨ ６−１の間で通常見出されるヒ らの精液を用いる、雌マウス（野生型、上記改変に関し トカウンターパート遺伝子（ヒトＡＤＡＭ６）は、偽遺 てホモ接合性、または上記改変に関してヘテロ接合性） 伝子であるようである。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺 のｉｎ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＡＤＡＭ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を用いることによっ 伝子−ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ−があり、これ て、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態におい らは、マウスＶＨ 遺伝子セグメントとＤＨ 遺伝子セグメ て、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してヘテロ接 ントの間の遺伝子間領域において見出され、上記マウス 合性である。１つの実施形態において、上記雄マウスは において、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子およびＡＤＡＭ６ｂ遺伝 、上記遺伝子改変に関してホモ接合性である。 30 子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものと 【０３５０】 は反対の転写配向に配向する。マウスの場合、正常な受 １つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接 精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される 合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、上記遺伝 。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内 子改変を含む後代を得ること、上記遺伝子改変を含む雄 因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは非機能的内 および雌後代を同定すること、および上記遺伝子改変に 因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示さ 関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、上記遺 れる大幅に低減された受精を補うまたはレスキューする 伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性 ことができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。 である雌との交配に用いて、上記遺伝子改変を含む後代 【０３５３】 を得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つ ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウス の実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性 40 における上記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖 の雄と、野生型雌、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合 を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせ 性の雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌 る。ＶＨ 遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換す とを交配させる工程を繰り返して、上記マウス系統での るとき、またはＤＨ 遺伝子セグメントを欠失させるもし 上記遺伝子改変を維持する。 くは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の 【０３５１】 妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために １つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子 、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡ 遺伝子座の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖配列に ＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌク よる置換を含むマウス系統を維持するための方法であっ レオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実 て、上記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウ 施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損 スを産生する工程を含み、上記ヘテロ接合性雄マウスを 50 をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ ( 51 ) JP 99 2015-519076 A 2015.7.9 100 ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは された１つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主 機能的断片をコードするものである。あるいは、上記マ 種からのＣＤ１９遺伝子（Ｂ細胞特異的遺伝子）のプロ ウスＡＤＡＭ６遺伝子座に隣接する内因性免疫グロブリ モーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリン ン重鎖配列が機能的内因性重鎖可変領域をコードするよ が発現する正確な発生段階でのＢ細胞特異的発現が実現 うに再構成できないようにしながら、内因性ＡＤＡＭ６ される。 遺伝子座を保持する適切な方法を用いることができる。 【０３５７】 例示的な代替方法は、上記内因性免疫グロブリン重鎖可 挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するた 変領域遺伝子座を配置するマウス染色体の大部分が、内 めのさらにもう１つの方法は、構成的プロモーターの利 因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結された機能的重鎖 用である。例示的構成的プロモーターとしては、ＳＶ４ 可変領域をコードするように再構成できないように、そ 10 ０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫおよびＣＡＧＧ れらを操作することを含む。様々な実施形態において、 が挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択 上記方法は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメン された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それ トを含有するマウス染色体断片の逆位および／または転 により、該ヌクレオチド配列によってコードされている 座を含む。 タンパク質（単数または複数）の高い発現レベルが得ら 【０３５４】 れる。 妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を任意の好 【０３５８】 適な位置に配置することができる。上記配列を上記遺伝 用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への 子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意 転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野 の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することが 生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置 できる。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を 20 への配置）を含むことを意図したものである。様々な実 、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入 施形態において、この用語は、その対象がその正常なま することができる。 たは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例え １つの実施形態では、上記配列をエピソームで、すなわ ば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」と ちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持するこ いう句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌ とができる。好適な位置としては、転写許容性または活 クレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タン 性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｚａｍ パク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性 ｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４ の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもし ：３７８９−３７９４）、ＢＴ−５遺伝子座（Ｍｉｃｈ くは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合 ａｅｌら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５− 、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置 ４７）またはＯｃｔ４遺伝子座（Ｗａｌｌａｃｅら、２ 30 とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることが ０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｒｅｓ．２８： ある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異な １４５５−１４６４）が挙げられる。転写活性遺伝子座 Ａｃｉｄｓ るマウスのゲノム内の位置に上記配列を配置することに へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国 より、マウス配列の新規配列接合部を生み出すこととな 特許第７，４７３，５５７号明細書に記載されている。 る。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソロ 【０３５５】 グは、ＡＤＡＭ６ あるいは、妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列 喪失（例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能 を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細 力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的 胞および／または組織、例えば生殖組織、での最適な発 ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸 現を促進することができる。例示的誘導性プロモーター 配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配 としては、物理的手段によって活性化されるプロモータ 40 列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９ ー（例えば、熱ショックプロモーター）および／または ９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡ 化学的手段によって活性化されるプロモーター（例えば Ｍ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノック 、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン）が挙げられる。 アウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配す 【０３５６】 る能力を補うまたはレスキューすることができるタンパ さらに、上記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関 ク質を含む。 連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現 【０３５９】 を実現することができる。かかる発現は、上記ヌクレオ 上記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含 チド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモ 有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこ ーターと作動可能に連結させることによって実現するこ でもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例え とができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製 50 ば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがそ − ／ − マウスにおいて観察される妊性 ( 52 ) JP 101 2015-519076 A 2015.7.9 102 の天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改 た（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列の接合により作られ 変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメ る、結果として生ずる配列接合部は、野生型マウスのゲ ント間、またはマウスＶ−Ｄ遺伝子間配列内の異なる位 ノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものに 置における）その場所に近い（しかし、正確に同じでは なる。 ない）位置であってもよい。異所性配置の一例は、上記 【０３６１】 周囲の内因性重鎖遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常 様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６またはそのオルソ 領域を含有する機能的重鎖をコードするように再構成で ログもしくはホモログが無い非ヒト動物を提供し、この きるようにしながら、野生型マウスにおいて上記内因性 欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の 免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に通常見出される位置を 妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、 維持することである。この例では、例えば、上記可変領 10 上記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ 域遺伝子座に隣接する位置に配置された操作された部位 欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起 特異的組換え部位を使用して、上記内因性免疫グロブリ 因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性（例えば、 ン重鎖可変遺伝子座を含有する染色体断片の逆位によっ 交配頻度、同腹子あたりの子、１年あたりの同腹子、な て、これを達成することができる。したがって、組換え ど）の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％また の際に、上記内因性重鎖可変領域遺伝子座を上記内因性 は９５％またはそれより多くの低減である。様々な実施 重鎖定常領域遺伝子から遠距離に配置することにより、 形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウス 内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードする ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモロ 再構成を防止する。本開示を読むことにより、および／ グもしくは機能的断片を上記非ヒト動物に補充し、この または当該技術分野において公知の方法と組み合わせて 補充されたＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもし 、当業者であれば、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を維持し 20 くはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全 ながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝 部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的 子座の機能的サイレンシングを達成する他の例示的な方 部分のレスキューは、例えば、上記非ヒト動物が、非改 法が明らかである。上記内因性重鎖遺伝子座のかかる配 変（すなわち、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログ 置により、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は維持され、上 もしくはホモログへの改変を有さない動物）重鎖遺伝子 記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は機能的にサイレ 座と比較して少なくとも７０％、８０％または９０％ま ンシングされる。 たはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。 【０３６０】 【０３６２】 異所性配置の別の例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝 様々な実施形態において、上記遺伝子改変動物（すなわ 子座内への配置である。例えば、１つ以上の内因性ＶＨ ち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因し 遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント 30 て、機能的ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホ による置換であって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する モログが無い動物）に付与する配列は、ＡＤＡＭ６遺伝 置換を含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列が、上記単 子またはそのオルソログもしくはホモログから選択され 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントとヒトＤＨ 遺伝子セグメ る。例えば、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、 ントとの間にある遺伝子間配列内に配置されるように操 １つの実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子の付加に 作することができる。異所性配置の別の例は、上記マウ よってレスキューされる。１つの実施形態において、マ スＡＤＡＭ６配列が、上記ヒトＶＨ 遺伝子セグメントに ウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、マウス、例えば 対して（単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントの転写方向に 齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統また 対して）５’の位置にある配置である。上記単一のヒト は種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソ ＶＨ遺伝子セグメントに対する５’の位置は、上記ヒト ログまたはホモログを付加することによってレスキュー ＶＨ 遺伝子セグメントに対して、例えば数百塩基対∼数 40 され、この場合、上記マウスのオルソログまたはホモロ ｋｂにごく接近しているか、または例えば数ｋｂ∼数百 グの付加により、ＡＤＡＭ６機能の喪失またはＡＤＡＭ ｋｂもしくはさらにメガ塩基以上離れている場合がある ６遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされ 。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内にまた る。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な はそれに隣接してまたはさらにそれと同じ染色体上に（ 実施形態において系統発生的に関連した種から選択され 異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり 、および様々な実施形態において、約８０％以上、８５ 、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（ ％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上または９ 異所性）配置は、マウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわ ７％以上である内因性ＡＤＡＭ６（またはオルソログ） ち、Ｖ−Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合がある。マウス との同一性パーセントを示し、およびＡＤＡＭ６に関連 の生殖細胞系内のヒト遺伝子配列（例えば、免疫グロブ したまたは（非マウスの場合は）ＡＤＡＭ６オルソログ リン遺伝子配列）内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接し 50 に関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ＡＤＡ ( 53 ) JP 103 2015-519076 A 2015.7.9 104 Ｍ６機能が無い遺伝子改変雄ラット（例えば、ヒト免疫 もしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科 グロブリン重鎖可変領域で置換された内因性免疫グロブ （ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ リン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グ ものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変 ロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット）の場 動物は、ネズミ上科からのものであり、上記ＡＤＡＭ６ 合、そのラットの妊性の喪失は、ラットＡＤＡＭ６の付 オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、 加によって、または一部の実施形態ではラットＡＤＡＭ トビネズミ上科からのものである。 ６のオルソログ（例えば、別のラット系統もしくは種か 【０３６５】 らの、または１つの実施形態ではマウスからの、ＡＤＡ １つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は齧歯動 Ｍ６オルソログ）の付加によってレスキューされる。 【０３６３】 Ｍｕｒｏｉｄｅａ）からの 物である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、 10 ネズミ上科から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログま このように、様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６タン たはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのもので パク質（またはそのオルソログもしくはホモログ）をコ ある。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は ードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結 、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ された調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは ）（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科 妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補う （Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世 または回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪 界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕ 失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる ｒｉｄａｅ）（純種のマウスおよびラット、アレチネズ 系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からの ミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科 ものである。様々な実施形態において、上記補足性核酸 （Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウ 配列は、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたは 20 ス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマ その機能的断片である。様々な実施形態において、上記 ウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉ 補足性ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはそ ｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ）およびメクラネズミ科 の機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に （例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ 近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、上記 ）から選択される科からのものであり；および上記ＡＤ 遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ＡＤ ＡＭ６オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種 ＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断 から選択される。特定の実施形態において、上記遺伝子 片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種の 改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科 マウスから得ることができる。 ）から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモ １つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子 ログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネ 改変動物が齧歯目（ｏｒｄｅｒ ズミから選択される種からのものである。１つの実施形 Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の 30 ものである場合、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホ 態において、上記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメン モログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物から バーからのものであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソロ のものである。１つの実施形態において、上記妊性の欠 グまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのもので 陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目（ｓｕｂｏｒｄ ある。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動 ｅｒ Ｍｙｏｍｏｒｏｐｈａ）（例えば、トビネズミ（ 物は、ネズミ科のマウスであり、および上記ＡＤＡＭ６ ｊｅｒｂｏａｓ）、ジャンピングマウス（ｊｕｍｐｉｎ オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレ ｇ チネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのもの ｍｉｃｅ）、カンガルーハムスター、ハムスター、 新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウス である。 およびラット（ｔｒｕｅ 【０３６６】 ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔ） 、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボ 40 様々な実施形態において、１つの科の中の齧歯動物の１ リマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガス つ以上の齧歯動物ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモロ カルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タ グまたはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６オルソログまた ケネズミ、モグラネズミ）のものであり、上記ＡＤＡＭ はホモログが無い同じ科（例えば、キヌゲネズミ科（例 ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネ 、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択され ズミ）；ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット る。 、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ））の遺 【０３６４】 伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。 １つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、トビ 【０３６７】 ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ 様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６オルソログ、ホモ Ｄｉｐｏｄｏｉ ｄｅａ）からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログ 50 ログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは ( 54 ) JP 105 2015-519076 A 2015.7.9 106 断片が、ＡＤＡＭ６活性が無い遺伝子改変雄非ヒト動物 （ＢＡＣ）の開発により、今や、比較的大きいゲノム断 （例えば、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログのノックア 片の組換えが可能である。ＢＡＣ工学は、マウスＥＳ細 ウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット）に妊 胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるよ 性を回復させるかどうか確認することにより、機能性に うにした。 ついて評価する。様々な実施形態において、機能性は、 【０３７１】 内因性ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモロ ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能 グが無い遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同 になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義され 重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数 る。 【０３６８】 の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、 10 損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生 様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マ は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様 ウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモロ 々な相違に起因し得る。 グまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク 【０３７２】 質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内 ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存 因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウ 置換を含むマウスを作製することができる。上記異所性 スプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作 ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異 用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受 なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモロ 容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウス グまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク は、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ 質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵 20 受容体を発現する。 、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加 結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細 、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および 胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まな ／またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させ い、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座 る雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド 制御要素を含まない。 配列が挙げられる。 【０３７３】 【０３６９】 完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化 １つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６は、マウスＡ されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み ＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一 、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含 である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤ むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな ＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホ 30 場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロ モログまたはオルソログである。１つの実施形態におい ブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再構 て、上記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ 成できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発 ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡ 生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完 Ｍ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびそ 全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができ の組み合わせから独立して選択される１つ以上のタンパ る。 ク質をコードする。１つの実施形態において、上記ホモ 【０３７４】 ログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／ ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざる またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡ を得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好 ＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９ ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、 ％以上同一であるように改変されているラット、ハムス 40 この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト ター、マウス、またはモルモットタンパク質である。１ 可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結 つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログ 果をもたらすには好ましいものではない。この機序によ は、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ り、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソ ６ｂと同一であるか、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／また タイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタ はマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも９０％、９１％、９ イプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重 ２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８ 鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝 ％または９９％同一である。 子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスで 【０３７０】 の過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容 ヒト化重鎖マウスにおける異所性ＡＤＡＭ６ 易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにや 遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体 50 はり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたまま ( 55 ) JP 107 2015-519076 A 2015.7.9 108 である。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に はない――明らかにそれらはそうではない。しかし、そ 関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランス の遺伝子座は、すべてのＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ 遺伝子セ スイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそ グメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス らく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイ 配列を、限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有する連続す プスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因 るヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝 性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがっ 子遺伝子座におけるヒト化を達成することができるほど て、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製された に類似する。 マウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するため 【０３７８】 にトランススイッチ機序を選択する場合であっても、そ 一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列 の戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分 10 の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換（例えば、マウス である。 ＣＨ １配列の、ヒトＣＨ １での置換、およびマウスＣＬ 【０３７５】 配列の、ヒトＣＬ 配列による置換）により、結果として 抗体ベースのヒト治療薬、例えば抗病原体抗体の作製に 、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作 おける主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識 製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有 し、望ましい親和性で、通常は−常にではないが−高い する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子 親和性で、そのエピトープに結合する有用な可変ドメイ 座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブ ンを同定することである。マウス免疫グロブリン重鎖可 リン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグ 変領域の、内因性マウス遺伝子座における限られた数の メント再構成、正常な体細胞超変異頻度および正常なク ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントでの正確 ラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウス な置換を含有する本明細書に記載のマウスは、ほぼ野生 20 と区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスに 型のＢ細胞発生を示し、免疫に応答して生成される可変 ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーが無 領域は完全にヒトのものであり、上記重鎖は単一のヒト い場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段 ＶＨ 遺伝子セグメントに由来する。したがって、かかる 階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これら マウスは、所与の抗原、例えば、病原性ウイルスへの結 のマウスを免疫することにより、多種多様な重鎖ＣＤＲ 合に特異的に指向性を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤ および軽鎖可変遺伝子セグメントの使用を示す頑強な体 Ｒ）のパネルを作製するためのプラットホームを提供す 液性応答が得られる。 る。 【０３７９】 【０３７６】 マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置 本明細書に記載のマウスは、内因性遺伝子座におけるマ 換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマ ウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）の生殖細胞系可変遺 30 ウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝 伝子遺伝子座の、限定されたヒト免疫グロブリン重鎖可 子座は、再構成し、超変異し、正常にクラススイッチす 変遺伝子座での、および免疫グロブリン軽鎖（例えば、 るため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グ κ軽鎖、Ｉｇκ）の、等価のヒト免疫グロブリンκ軽鎖 ロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領 可変遺伝子遺伝子座での正確な大規模置換を含有する。 域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニン この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマ グして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好 ウス定常領域とを有する重鎖および軽鎖を作製するハイ 適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎ ブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得ら ｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部が れる。マウスＶＨ −ＤＨ −ＪＨ およびＶκ−Ｊκセグメ ヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得 ントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクト ることができる。 なままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン 40 【０３８０】 遺伝子座に残す。上記マウスの体液性免疫系は、野生型 リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウ マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいかなる ス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変して、マウスＶＨ 、ＤＨ お 重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると上記マ よびＪＨ 遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メ ウスにおいてヒト重鎖ＣＤＲの体細胞変異パネルが産生 ガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、単 される。 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ 遺伝子 【０３７７】 セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグメントを含む 本明細書に記載のマウスは、重鎖およびκ軽鎖について 限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有するヒトゲノム配列 の免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウス で正確に置換した。本質的にすべてのヒトＶκおよびＪ において同様に再構成するので実現可能であるのだが、 κ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方 その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけで 50 を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメント ( 56 ) JP 109 2015-519076 A 2015.7.9 110 を使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの 【０３８４】 本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖 マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくは 遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置換した。 ホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する 【０３８１】 機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足す かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、 る現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡ マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶＨ Ｍ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用 遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ 遺伝子セグメント できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重 の間で通常は見出される内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子 鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマ 座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内 ウスを本発明の組成物および方法でレスキューすること 因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または除 10 ができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機 去をもたらし得る。 能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変 ヒト重鎖レパートリーの最も３’側のＶＨ 遺伝子セグメ を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細 ントの一方または両方を限定されたヒト重鎖遺伝子座の 書に提供する。記載するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録 構築に使用すると、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子であるよう 商標）マウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物およ に見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのＶ び方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を Ｈ 遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトＶＨ １−２とＶ 多種多様な方法で改変するときに用いることができる。 Ｈ １−６との間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間 【０３８５】 配列を含む雄マウスは、妊性の低減を示す（米国特許出 １つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（または 願第１３／４０４，０７５号参照）。 そのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片） 【０３８２】 20 をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは 上記の限定されたヒト重鎖および等価のヒトκ軽鎖遺伝 実質的にすべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つ 子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸 のＶＨ 遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは 配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示す 実質的にすべてのマウスＤＨ 遺伝子セグメントおよびＪ マウスを記載する。１つの実施形態において、上記異所 Ｈ 性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトＶ びヒトＪＨ 遺伝子セグメントによる置換とを含むマウス 遺伝子セグメントの、ヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよ １−６９とヒトＤＨ １−１との間に配置されたマウス であって、ＣＨ １領域および／またはヒンジ領域が無い ＡＤＡＭ６ａ配列および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ配 マウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウ 列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態におい スは、（ａ）ヒトＶＨ −マウスＣＨ １−マウスＣＨ ２− て、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座に マウスＣＨ ３；（ｂ）ヒトＶＨ −マウスヒンジ−マウス おけるヒトＶＨ １−６９とヒトＤＨ １−１のと間に配置 30 ＣＨ ２−マウスＣＨ ３；および（ｃ）ヒトＶＨ −マウス された配列番号７７である。配列番号７７のＡＤＡＭ６ ＣＨ ２−マウスＣＨ ３から選択される免疫グロブリン鎖 遺伝子の転写方向は、周囲のヒト遺伝子セグメントの転 の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製 写方向に関して逆である。１つの実施形態において、上 する。 記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座における 【０３８６】 ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントの上流（または５’） １つの態様では、１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖 に配置されたマウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはマウ 可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ 、ｍＤＨ および／または スＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片を含む。１つ ｍＪＨ ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺 の実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因 伝子セグメント（ｈＶＨ 、ｈＤＨ および／またはｈＪＨ 性重鎖遺伝子座におけるヒトＶＨ １−２遺伝子セグメン ）での置換を有するマウスであって、１つ以上のマウス トの上流（または５’）に配置された配列番号７３であ 40 免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκお る。配列番号７３のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周 よび／またはｍＪκ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリ 囲のヒト遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶＨ １−２遺 ンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／または 伝子セグメント）の転写方向に関して逆である。 ｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性を 【０３８３】 レスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン 本明細書における例は、示されるヒト遺伝子セグメント 重鎖可変領域配列の上流（または５’）（例えば、ヒト 間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキュー ＶＨ １−２またはＶＨ １−６９遺伝子セグメントの上流 を示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝 ）に配置する。 子座への（またはさらには染色体外に）異所性配列の配 【０３８７】 置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想され １つの態様では、１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖 Ｈ ることは、当業者であれば認める。 50 可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ 、ｍＤＨ および／または ( 57 ) JP 111 2015-519076 A 2015.7.9 112 ｍＪＨ ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺 のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの間に配置する 伝子セグメント（ｈＶＨ 、ｈＤＨ および／またはｈＪＨ 。特定の実施形態において、上記２つのヒト免疫グロブ ）での置換を有するマウスであって、１つ以上のマウス リン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである 免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκお 。１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列をヒ よび／またはｍＪκ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリ トＶＨ １−６９遺伝子セグメントとヒトＤＨ １−１遺伝 ンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／または 子セグメントとの間に配置する。１つの実施形態におい ｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性を て、上記ヌクレオチド配列をヒトＶＨ １２遺伝子セグメ レスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン ントとヒトＤＨ １−１遺伝子セグメントとの間に配置す 重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶＨ １−６９または る。１つの実施形態において、そのように改変されたマ ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントとヒトＤＨ １−１遺伝 10 ウスは、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、２７のヒト 子セグメントとの間）に配置する。 ＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグメ 【０３８８】 ントでのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメン １つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グ トの置換、および少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグ ロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基の メントおよび５のヒトＪκ遺伝子セグメントでのマウス マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施 免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントの置換を含 形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリン重 む。 鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖 【０３９１】 遺伝子座の少なくとも８９のＶＨ 遺伝子セグメント、少 １つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座 なくとも１３のＤＨ 遺伝子セグメント、少なくとも４の （またはそのオルソログもしくはホモログもしくはその ＪＨ 遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。 20 機能的断片）は、内因性重鎖定常領域を含有する機能的 １つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロ 重鎖をコードするように再構成できない内因性マウス重 ブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリ 鎖可変領域遺伝子座に存在するマウス遺伝子セグメント ン重鎖遺伝子座の限られた数の（例えば、１つ、２つま の中央に存在する。１つの実施形態において、上記内因 たは３つの）ＶＨ 遺伝子セグメント、少なくとも２７の 性マウス重鎖遺伝子座は、少なくとも１つ、かつ８９以 ＤＨ 遺伝子セグメント、少なくとも６のＪＨ 遺伝子セグ 下のＶＨ 遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３ メントまたはその組み合わせを含む。特定の実施形態に 以下のＤＨ 遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４ おいて、上記限られた数のヒトＶＨ 遺伝子セグメントは 以下のＪＨ 遺伝子セグメント、およびその組み合わせを １つである。 含む。様々な実施形態において、機能的マウスＡＤＡＭ 【０３８９】 ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログも １つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グ 30 しくはその機能的断片）は、上記マウスにおいて機能的 ロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基 である１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、上 のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの 記１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質は、配列番号１、配 実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリ 列番号２および／またはその組み合わせを含む。 ンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリ 【０３９２】 ンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも１３７のＶκ遺伝子セグ １つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座 メント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはそ （またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能 の組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記１ 的断片）は、内因性マウス遺伝子セグメントを置換する つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメン ヒト遺伝子セグメントの中央に存在する。１つの実施形 トは、約二分の一メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖 態において、少なくとも８９のマウスＶＨ 遺伝子セグメ 遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記１つ以 40 ントを除去し、１つ、２つまたは３つのヒトＶＨ 遺伝子 上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座 、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の（免疫グロブリ は、ヒトＶＨ 遺伝子セグメントの３’末端に直ぐ隣接し ンκ定常領域に関して）近位リピートを含む。１つの実 て存在するか、２つのヒトＶＨ 遺伝子セグメント間に存 施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ 在する。１つの実施形態において、少なくとも８９のマ 軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽 ウスＶＨ 遺伝子セグメントを除去し、単一のヒトＶＨ 遺 鎖遺伝子座の少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメント、 伝子セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝 少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合 子座は、ヒトＶＨ 遺伝子セグメントの３’末端に直ぐ隣 わせを含む。 接して存在する。特定の実施形態において、上記マウス 【０３９０】 ＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ 遺伝子セグ １つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列を２つ 50 メントの３’末端の約２０キロ塩基（ｋｂ）から約４０ ( 58 ) JP 113 2015-519076 A 2015.7.9 114 キロ塩基（ｋｂ）以内のＶＨ 遺伝子セグメントの３’に 該ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントの５’末端から約３ 存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡ ２，８３３ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の Ｍ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ 遺伝子セグメント ３’末端は、該ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントの５’ の３’末端の約２９ｋｂから約３１ｋｂ以内のＶＨ 遺伝 末端から約１８，０７８ｂｐである。特定の実施形態に 子セグメントの３’に存在する。特定の実施形態におい おいて、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細 て、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒト 胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号３またはその ＶＨ 遺伝子セグメントの３’末端の約３０ｋｂ以内に存 断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤ 在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ ＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ 遺伝子セグメントの ３’末端の約３０，１８４ｂｐ以内に存在する。 付与する配列番号７３またはその断片を含む。特定の実 10 施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マ 【０３９３】 ウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７７ 特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグ またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態におい メントＶＨ １−６９およびＤＨ １−１を含み、上記マウ て、ヒト遺伝子セグメントの構成は、以下のものである スＡＤＡＭ６遺伝子座は、該ＶＨ １−６９遺伝子セグメ （ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下 ントの下流かつ該ＤＨ １−１遺伝子セグメントの上流に 流に）：マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＨ １−２− 存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡ ヒトＤＨ １−１。１つの実施形態において、転写方向に Ｍ６遺伝子座は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントと 関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ ヒトＤＨ １−１遺伝子セグメントとの間に存在し、この ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は 場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’末端は、該ヒ 、ヒト遺伝子セグメントについての配向と比較して逆で トＶＨ １−６９遺伝子セグメントの３’末端から約２５ 20 ある。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、単一の ８ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の３’末端 ヒトＶＨ 遺伝子セグメントに対して３’またはその下流 は、該ヒトＤＨ １−１遺伝子セグメントの約３，２６３ に存在する。 ｂｐ５’側に存在する。特定の実施形態において、上記 【０３９５】 マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡ 同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス Ｍ６機能を付与する配列番号３またはその断片を含む。 ＶＨ 遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト 特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子 ＶＬ 遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメ 座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列 ント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例 番号７３またはその断片を含む。特定の実施形態におい えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片 て、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内 を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベ にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７７またはその断 30 クターを利用することにより、内因性マウスＡＤＡＭ６ 片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒト遺伝 遺伝子座を維持するように改変することができ、あるい 子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子 は２つのヒトＶＬ 遺伝子セグメント間に、またはヒトＶ セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒト Ｌ ＶＨ １−６９−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＤＨ １ トであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈ −１。１つの実施形態において、転写方向に関して、マ ＤＨ ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろ ウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマ うとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋ＪＨ ）に位置す ウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒト遺伝 る異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置換する 子セグメントについての配向と比較して逆である。ある ように改変することができる。１つの実施形態において いは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、単一のヒトＶＨ 遺 、上記置換は、２つ以上のヒトＶＬ 遺伝子セグメントを 伝子セグメントに対して５’またはその上流に存在する 40 含み、および上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその 。 機能的断片は、２つの最も３’側のＶＬ 遺伝子セグメン 【０３９４】 ト間に存在する。そこで、特定の実施形態において、ヒ 特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグ トＶＬ 遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ メントＶＨ １−２およびＤＨ １−１を含み、上記マウス ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流 ＡＤＡＭ６遺伝子座は、該ＶＨ １−２遺伝子セグメント に）：ヒトＶＬ ３’−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座− の上流かつ該ＤＨ １−１遺伝子セグメントの上流に存在 ヒトＶＬ ３’。１つの実施形態において、転写方向に関 する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａ 遺伝子座は、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントとヒトＤ およびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、 １−１遺伝子セグメントの上流または５’に存在し、 ヒトＶＬ 遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。 Ｈ この場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’末端は、 50 遺伝子セグメントとＤＨ 遺伝子セグメントとの間（ヒ あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側の ( 59 ) JP 115 2015-519076 A 2015.7.9 116 ヒトＶＬ 遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ 遺伝子セ の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。 グメントの間の遺伝子間領域に存在する。 【０３９９】 最も５’側のＤＨ セグメントがマウスであろうと、ヒト マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列ま であろうとこのとおりであるはずである。 たはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたら 【０３９６】 す実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする １つの態様では、１つ以上の内因性マウスＶＨ 遺伝子セ 異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ グメントの置換を有する、および少なくとも１つの内因 ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブ 性マウスＤＨ 遺伝子セグメントを含むマウスを提供する リン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有 。かかるマウスにおいて、上記内因性マウスＶＨ 遺伝子 用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する セグメントの改変は、最も５’側のＤＨ 遺伝子セグメン 10 抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、 トではなく、最も３’側のＶＨ 遺伝子セグメントの１つ かかるマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を破壊 以上についての改変を含み得、この場合、上記１つ以上 する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、 の最も３’側のＶＨ 遺伝子セグメントの改変が、上記内 マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を 因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまた 含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは は非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実 、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス 施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的 免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一 にすべての内因性マウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つ 部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有する のヒトＶＨ 遺伝子セグメントによる置換を含み、および マウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。 上記マウスは、１つ以上の内因性ＤＨ 遺伝子セグメント 【０４００】 および機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。 20 一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス 【０３９７】 、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソ もう１つの実施形態において、上記マウスは、最も３’ ログもしくはホモログもしくは断片）と１つ以上のヒト 側の内因性マウスＶＨ 遺伝子セグメントの改変、および 免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグ １つ以上の内因性マウスＤＨ 遺伝子セグメントの改変を メントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実 含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的な 施形態において、マウスにおいて機能的である他のＡＤ ままである程度まで該内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座 ＡＭ６遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、 の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改 ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含 変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機 み得る。 能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含 【０４０１】 む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベク 30 １つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコード ターを利用して、最も３’側の内因性マウスＶＨ 遺伝子 する異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的に セグメントを１つのヒトＶＨ 遺伝子セグメントで置換す すべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つのヒトＶ る工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべ Ｈ てまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有す 的にすべてのマウスＤＨ 遺伝子セグメントの、１つ以上 るターゲティングベクターで内因性マウスＤＨ 遺伝子セ のヒトＤＨ 遺伝子セグメントによる置換と、すべてのま グメントを置換する工程。 たは実質的にすべてのマウスＪＨ 遺伝子セグメントの、 【０３９８】 １つ以上のヒトＪＨ 遺伝子セグメントによる置換とを含 様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の むマウスを提供する。 機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質また 【０４０２】 はそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモ 40 １つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ １ ログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は ヌクレオチド配列の、ヒトＣＨ １ヌクレオチド配列によ 有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確 る置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マ 率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うと ウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジ き、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周 ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。１つの実施 囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマ 形態において、上記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変 ウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしく 遺伝子座（ＶＬ およびＪＬ ）の、ヒト免疫グロブリン軽 は一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が 鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。１つの実施形態 （例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置換されている免 において、上記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定 疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製すると 常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定 きに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載 50 常領域ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。特定 遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質 ( 60 ) JP 117 2015-519076 A 2015.7.9 118 の実施形態において、上記ＶＬ 、ＪＬ およびＣＬ は、免 成の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変す 疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態におい る。 て、上記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣＨ １配列と 【０４０６】 融合したマウスＣＨ ２およびマウスＣＨ ３免疫グロブリ １つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（または ン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺 そのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片） 伝子座が再構成して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣＨ １ をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは 領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣＨ ２およびマウ 実質的にすべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つ スＣＨ ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメイン 以上のヒトＶＬ 遺伝子セグメントによる置換と、すべて およびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコード のもしくは実質的にすべてのＤＨ 遺伝子セグメントおよ する遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子 10 びＪＨ 遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ 遺伝子セグメント を形成する。 による置換とを含むマウスであって、ＣＨ １および／ま 【０４０３】 たはヒンジ領域が無いマウスを提供する。 １つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコード 【０４０７】 する異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的に １つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ １ドメイ すべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つ以上のヒ ンをコードする配列が無い。１つの実施形態において、 トＶＬ 遺伝子セグメントによる置換と、必要に応じて、 上記マウスにはヒンジ領域をコードする配列が無い。１ すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ 遺伝子セグメン つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ １ドメイン トおよび／もしくはＪＨ 遺伝子セグメントの、１つ以上 およびヒンジ領域をコードする配列が無い。 のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪＨ 【０４０８】 遺伝子セグメントによる置換と、または必要に応じて、 20 特定の実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ ３ すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ 遺伝子セグメン ドメインに結合しているマウスＣＨ ２ドメインに融合し トおよびＪＨ 遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪＬ ているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたは 遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する κ）を含む結合タンパク質を発現する 。 【０４０９】 【０４０４】 １つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（または １つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまた そのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片） は実質的にすべてのマウスＶＨ 、ＤＨ およびＪＨ 遺伝子 をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは セグメントの、１つ以上のＶＬ 、１つ以上のＤＨ 、およ 実質的にすべてのマウスＶＨ 遺伝子セグメントの、１つ び１つ以上のＪ遺伝子セグメント（例えば、Ｊκまたは 以上のヒトＶＬ 遺伝子セグメントによる置換と、すべて Ｊλ）での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、 30 のもしくは実質的にすべてのマウスＤＨ およびＪＨ 遺伝 内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、 子セグメントの、ヒトＪＬ 遺伝子セグメントによる置換 該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶＬ − とを含むマウスを提供する。 ヒトまたはマウスＤＨ −ヒトまたはマウスＪ−マウスヒ 【０４１０】 ンジ−マウスＣＨ ２−マウスＣＨ ３を含有する再構成免 １つの実施形態において、上記マウスは、ＣＨ １領域、 疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態にお ヒンジ領域、ＣＨ １およびヒンジ領域、またはＣＨ １領 いて、上記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施 域およびヒンジ領域およびＣＨ ２領域をコードする免疫 形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪＨ 領域である。１ グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。 つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域で 【０４１１】 ある。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ 領域は、 ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。 １つの実施形態において、上記マウスは、以下のものか 40 ら選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タ 【０４０５】 ンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶＬ −マウスＣＨ １− 特定の実施形態において、上記マウスは、マウスまたは マウスＣＨ ２−マウスＣＨ ３；（ｂ）ヒトＶＬ −マウス ヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤＨ およびヒトＪκ； ヒンジ−マウスＣＨ ２−マウスＣＨ ３；（ｃ）ヒトＶＬ ヒトＶκ、ヒトＤＨ およびヒトＪＨ ；ヒトＶλ、ヒトＤ −マウスＣＨ ２−マウスＣＨ ３。 Ｈ およびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨ およびヒトＪＨ 【０４１２】 ；ヒトＶκ、ヒトＤＨ およびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒト １つの態様では、無能化または欠失された内因性マウス ＤＨ およびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単 ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免 一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、 疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトま 列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは たはマウスまたはヒト／マウスもしくは他のキメラ抗体 列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再構 50 を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実 ( 61 ) JP 119 2015-519076 A 2015.7.9 120 施形態において、上記核酸配列は、組み込まれた導入遺 形態において、上記マウスまたはラットは、キヌゲネズ 伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにラン ミ科およびネズミ科から選択される。１つの実施形態に ダムに組み込まれている。１つの実施形態において、上 おいて、上記キメラ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインと、 記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム ヒト軽鎖可変ドメインと、マウスおよびラットから選択 （例えば、染色体）上にある。 される齧歯動物由来の定常領域配列とを含み、この場合 【０４１３】 のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖は同種のもので １つの実施形態において、上記マウスは、無能化された ある。特定の実施形態において、同種のものとしては、 内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。特定 ヒト重鎖およびヒト軽鎖可変ドメインが、該ヒト軽鎖可 の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン軽鎖遺 変ドメインと該ヒト重鎖可変ドメインを一緒に発現して 伝子座は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖遺伝子 10 その可変ドメインを個々のＢ細胞の表面に一緒に提示す 座から選択される。特定の実施形態において、上記マウ る単一Ｂ細胞からのものである、同種のものが挙げられ スは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座および無能化 る。 されたλ軽鎖遺伝子座を含み、この場合のマウスは、ヒ 【０４１７】 ト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびヒト免疫グロ １つの実施形態において、上記キメラ抗体を免疫グロブ ブリン軽鎖ドメインを含む抗体を発現する。１つの実施 リン遺伝子座から発現させる。 形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインは １つの実施形態において、上記キメラ抗体の重鎖可変ド 、ヒトκ軽鎖ドメインおよびヒトλ軽鎖ドメインから選 メインを再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から 択される。 発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体 【０４１４】 の軽鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン軽鎖 １つの態様では、キメラ抗体を発現する遺伝子改変動物 20 遺伝子座から発現させる。１つの実施形態において、上 であって、該遺伝子改変動物において機能的であるＡＤ 記キメラ抗体の重鎖可変ドメインおよび／または上記キ ＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモロ メラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子（例え グを発現する遺伝子改変動物を提供する。 ば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の、 【０４１５】 動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から １つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、マウ 誘導された再構成核酸配列）から発現させる。１つの実 スおよびラットから選択される。１つの実施形態におい 施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを て、上記遺伝子改変動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ 再構成導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝 ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは 子座以外の遺伝子座の、動物のゲノムに組み込まれてい 、該遺伝子改変動物とは異なる系統であるマウス系統か る非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列）か らのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子 30 ら発現させる。 改変動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物（例えば、ハム 【０４１８】 スター、新世界ラットまたはマウス、ハタネズミ）であ 特定の実施形態において、上記導入遺伝子を転写活性遺 り、および上記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたは 伝子座、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、例えばネズミ ホモログは、ネズミ科の齧歯動物（例えば、純種のマウ （例えばマウス）ＲＯＳＡ２６遺伝子座から発現させる スおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミ 。 ネズミ）からのものである。１つの実施形態において、 【０４１９】 上記遺伝子改変動物は、ネズミ科の齧歯動物であり、上 １つの態様では、非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロ 記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、 ブリン重鎖遺伝子座を含み、該ヒト化免疫グロブリン重 キヌゲネズミ科の齧歯動物からのものである。 【０４１６】 鎖遺伝子座が非ヒトＡＤＡＭ６配列またはそのオルソロ 40 グもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。 １つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変 【０４２０】 ドメインと齧歯動物の定常領域配列とを含む。１つの実 １つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６オルソ 施形態において、上記齧歯動物は、キヌゲネズミ科の齧 ログまたはホモログは、マウスＡＤＡＭ６配列とオルソ 歯動物およびネズミ科の齧歯動物から選択される。特定 ロガスおよび／または相同性である配列であり、そのオ の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ ルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的 科の齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態におい である。 て、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、 【０４２１】 ラットである。１つの実施形態において、上記キメラ抗 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、 体は、ヒト可変ドメインと、マウスまたはラットから選 ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である 択される動物からの定常ドメインとを含む；特定の実施 50 。 ( 62 ) JP 121 2015-519076 A 2015.7.9 122 【０４２２】 、Ｖ遺伝子セグメントに並置されている。１つの実施形 １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、 態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、２つのＶ遺 ラットおよびハムスターから選択され、上記ＡＤＡＭ６ 伝子セグメント間に位置する。１つの実施形態において オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハ 、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントと ムスターから選択される非ヒト動物からのものである。 Ｄ遺伝子セグメントとの間に並置されている。１つの実 特定の実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであ 施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝 り、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異な 子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間に位置する。 るマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動 １つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は 物からのものである。特定の実施形態において、上記非 、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間に並 ヒト動物はラットであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログま 10 置されている。 たはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムス 【０４２７】 ターから選択される齧歯動物からのものである。特定の １つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトＶＬ 実施形態において、上記非ヒト動物はハムスターであり ドメインと同種のヒトＶＨ ドメインを発現するＢ細胞を 、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なる 含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン ハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯 遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現 動物からのものである。 する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態 【０４２３】 において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、 特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、ネズミ亜 ＡＤＡＭタンパク質である。特定の実施形態において、 目からのものであり、上記ＡＤＡＭ６配列は、トビネズ 上記ＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ６タンパク質また ミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択 20 はそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片 される動物からのものである。特定の実施形態において である。 、上記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、上記Ａ 【０４２８】 ＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマ １つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物 ウスまたはラットまたはハムスターからのものである。 （例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形 【０４２４】 態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。 １つの実施形態において、上記ヒト化重鎖遺伝子座は、 １つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科 単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ のものである。特定の実施形態において、上記ネズミ上 遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪＨ 遺伝子セグ 科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。 メントを含む。特定の実施形態において、ヒトＶＨ 遺伝 【０４２９】 子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ 遺伝子セグメントお 30 １つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒト よび１つ以上のヒトＪＨ 遺伝子セグメントは、１つ以上 タンパク質は、齧歯動物タンパク質である。１つの実施 のヒト、キメラおよび／または齧歯動物（例えば、マウ 形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである スもしくはラット）定常領域遺伝子に作動可能に連結さ 。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上 れている。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝 科のものである。特定の実施形態において、上記齧歯動 子はマウスである。１つの実施形態において、上記定常 物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される 領域遺伝子はラットである。１つの実施形態において、 。 上記定常領域遺伝子はハムスターである。１つの実施形 【０４３０】 態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ ２、 １つの実施形態において、上記ヒトＶＨ およびＶＬ ドメ ＣＨ ３およびその組み合わせから選択される配列を含む インは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接または 。特定の実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒ 40 リンカーによって結合する。特定の実施形態において、 ンジ、ＣＨ ２およびＣＨ ３配列を含む。 上記定常ドメイン配列は、ヒンジ、ＣＨ ２、ＣＨ ３およ 【０４２５】 びその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実 １つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は 施形態において、上記ヒトＶＬ ドメインは、Ｖκまたは 、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に隣接する。１つの実施 Ｖλドメインから選択される。 形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫 【０４３１】 グロブリン重鎖配列内に位置する。特定の実施形態にお １つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その いて、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、Ｖ、Ｄおよ 生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト び／またはＪ遺伝子セグメントを含む。 動物の精子がｉｎ 【０４２６】 伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態におい １つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は 50 て、上記ｉｎ ｖｉｖｏ移動欠陥を特徴とする、遺 ｖｉｖｏ移動欠陥は、上記雄非ヒト動物 ( 63 ) JP 123 2015-519076 A 2015.7.9 124 の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメントは、ＶＨ １ 移動することができないことを含む。１つの実施形態に −６９である。 おいて、上記非ヒト動物には、ＡＤＡＭ６タンパク質ま 【０４３６】 たはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列が無 様々な実施形態において、上記ＶＨ 遺伝子セグメントは い。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク 、ＶＨ ６−１、ＶＨ １−２、ＶＨ １−３、ＶＨ ２−５、 質またはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６ａおよび／もし ＶＨ ３−７、ＶＨ １−８、ＶＨ ３−９、ＶＨ ３−１１、 くはＡＤＡＭ６ｂタンパク質またはその機能的断片を含 ＶＨ ３−１３、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−１６、ＶＨ １− む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動 １８、ＶＨ ３−２０、ＶＨ ３−２１、ＶＨ ３−２３、Ｖ 物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、 マウス、ラットおよびハムスターから選択される。 Ｈ 10 １−２４、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ３−３ ０、ＶＨ ４−３１、ＶＨ ３−３３、ＶＨ ４−３４、ＶＨ 【０４３２】 ３−３５、ＶＨ ３−３８、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ３−４３ １つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオル 、ＶＨ １−４５、ＶＨ １−４６、ＶＨ ３−４８、ＶＨ ３ ソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードす −４９、ＶＨ ５−５１、ＶＨ ３−５３、ＶＨ １−５８、 る非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む ＶＨ ４−５９、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ３−６４、ＶＨ ３− 非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記 ６６、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−７２、Ｖ 非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において Ｈ 、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターか 【０４３７】 ら選択される。 様々な実施形態において、上記ＶＨ 遺伝子セグメントは 【０４３３】 表１から選択され、５つ以上の対立遺伝子によって天然 １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列 20 ヒトレパートリーで表される。特定の実施形態において は、免疫グロブリン重鎖配列である。１つの実施形態に 、上記ＶＨ 遺伝子は、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ おいて、上記免疫グロブリン配列は、単一のＶＨ 遺伝子 ２−５、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−２３、 セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト ＶＨ ３−３０、ＶＨ ３−３３、ＶＨ ３−４９、ＶＨ ３− 免疫グロブリン配列は、１つ以上のＤＨ 遺伝子セグメン ６４、ＶＨ ４−４、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ４−３０−２、 トを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロ ＶＨ ４−３０−４、ＶＨ ４−３１、ＶＨ ４−３４、ＶＨ ブリン配列は、１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメントを含む ４−３９、ＶＨ ４−５９、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ５−５１ 。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配 およびＶＨ ７−４−１から選択される。 列は、単一のＶＨ 遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ 遺 【０４３８】 伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ 遺伝子セグメント １つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであ を含む。 30 ３−７３およびＶＨ ３−７４から選択される。 り、該マウスは、内因性マウスＶＨ 遺伝子セグメントの 【０４３４】 、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントによる置換を含み、 １つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、 該ヒトＶＨ 遺伝子セグメントはマウスＣＨ 領域遺伝子に 天然ヒトレパートリーにおける多型に関連づけられた単 作動可能に連結されているので、該マウスは、ヒトＶＨ 一のＶＨ 遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態にお 遺伝子セグメントを再構成し、およびヒトＶＨ ドメイン いて、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ １ とマウスＣＨ とを含む逆キメラ免疫グロブリン重鎖を発 −２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２−７０また 現する。１つの実施形態において、非再構成マウスＶＨ はＶＨ ３−２３から選択される。もう１つの特定の実施 遺伝子セグメントの９０∼１００％が、１つの非再構成 形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメントは、Ｖ ヒトＶＨ 遺伝子セグメントで置換されている。特定の実 １−２である。もう１つの特定の実施形態において、 施形態において、上記内因性マウスＶＨ 遺伝子セグメン Ｈ 上記単一のＶＨ 遺伝子セグメントは、ＶＨ １−６９であ 40 トのすべてまたは実質的にすべてが、１つの非再構成ヒ る。 トＶＨ 遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施 【０４３５】 形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ １−６９ １つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、 遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態にお 天然ヒトレパートリーにおける複数のコピー数に関連づ いて、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ １−２遺伝子セグ けられた単一のＶＨ 遺伝子セグメントを含む。特定の実 メントでのものである。１つの実施形態において、上記 施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメントは、 置換は、非再構成ヒトＶＨ ２−２６遺伝子セグメントで ヒトＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ２ のものである。１つの実施形態において、上記置換は、 −７０またはＶＨ ３−２３から選択される。もう１つの 非再構成ヒトＶＨ ２−７０遺伝子セグメントでのもので 特定の実施形態において、上記単一のＶＨ 遺伝子セグメ ある。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成 ントは、ＶＨ １−２である。もう１つの特定の実施形態 50 ヒトＶＨ ３−２３遺伝子セグメントでのものである。 ( 64 ) JP 125 2015-519076 A 2015.7.9 126 【０４３９】 実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は １つの実施形態において、上記マウスは、すべてのマウ 、少なくとも１６のＶκ遺伝子セグメントおよび５つの スＤＨ およびＪＨ セグメントの、少なくとも１つの非再 Ｊκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において 構成ヒトＤＨ セグメントおよび少なくとも１つの非再構 、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも３０ 成ヒトＪＨ セグメントによる置換を含む。１つの実施形 のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメ 態において、上記少なくとも１つの非再構成ヒトＤＨ セ ントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グ グメントは、１−１、１−７、１−２６、２−８、２− ロブリン軽鎖配列は、少なくとも４０のＶκ遺伝子セグ １５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５ メントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。様々 、５−１２、６−６、６−１３、７−２７およびその組 な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列 み合わせから選択される。１つの実施形態において、上 10 は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラ 記少なくとも１つの非再構成ヒトＪＨ セグメントは、１ ットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域 、２、３、４、５、６およびその組み合わせから選択さ と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において れる。 、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／齧歯動物、マウ 【０４４０】 ス、ラットまたはハムスター定常領域である。特定の実 様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列 施形態において、上記定常領域は、マウスまたはラット は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラ 定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領 ットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域 域は、マウスκ定常（ｍＣκ）領域またはラットκ定常 と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において （ｒＣκ）領域である。 、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／マウスまたはキ 【０４４３】 メラヒト／ラットまたはキメラヒト／ハムスター、マウ 20 １つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであ ス、ラットまたはハムスター定常領域である。１つの実 り、該マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのＶκ 施形態において、上記定常領域は、齧歯動物（例えば、 およびＪκ遺伝子セグメントの、少なくとも６のヒトＶ マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域である κ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子 。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウスま セグメントによる置換を含む。１つの実施形態では、す たはラットである。様々な実施形態において、上記定常 べてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セ 領域は、少なくともＣＨ ２ドメインおよびＣＨ ３ドメイ グメントが、少なくとも１６のヒトＶκ遺伝子セグメン ンを含む。 ト（ヒトＶκ）および少なくとも１つのＪκ遺伝子セグ 【０４４１】 メントで置換されている。１つの実施形態では、すべて １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖 のまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメ 配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス 30 ントが、少なくとも３０のヒトＶκ遺伝子セグメントお 、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における免疫 よび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換され グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態におい ている。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的に て、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物の すべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくと 生殖細胞系における非免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあ も４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１ り、この非重鎖遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。 つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実 特定の実施形態において、上記非重鎖遺伝子座は、ＲＯ 施形態において、上記少なくとも１つのＪκ遺伝子セグ ＳＡ２６遺伝子座である。 メントは、２、３、４または５つのヒトＪκ遺伝子セグ 【０４４２】 メントを含む。 様々な態様において、上記非ヒト動物は、該非ヒト動物 【０４４４】 の生殖細胞系にヒト免疫グロブリン軽鎖配列（例えば、 40 １つの実施形態において、上記ヒトＶκ遺伝子セグメン １つ以上の非再構成軽鎖ＶおよびＪ配列、または１つ以 トは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２− 上の再構成ＶＪ配列）をさらに含む。特定の実施形態に ４、Ｖκ１−５およびＶκ１−６を含む。１つの実施形 おいて、上記免疫グロブリン軽鎖配列は、免疫グロブリ 態において、上記Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７ ンκ軽鎖配列である。１つの実施形態において、上記ヒ 、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１ ト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶＬ 遺伝子セ １、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ グメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免 ３−１５およびＶκ１−１６を含む。１つの実施形態に 疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＪＬ 遺伝子セグメ おいて、上記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１ ントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グ ７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ ロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶＬ 遺伝子セグメント ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４ および１つ以上のＪＬ 遺伝子セグメントを含む。特定の 50 、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２ ( 65 ) JP 127 2015-519076 A 2015.7.9 128 −２８、Ｖκ２−２９およびＶκ２−３０を含む。１つ 、ＶＨ １−４５、ＶＨ １−４６、ＶＨ ３−４８、ＶＨ ３ の実施形態において、上記ヒトＶκ遺伝子セグメントは −４９、ＶＨ ５−５１、ＶＨ ３−５３、ＶＨ １−５８、 、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３ ＶＨ ４−５９、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ３−６４、ＶＨ ３− −３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、 ６６、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−７０、ＶＨ ３−７２、Ｖ Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０を含む Ｈ 。 トＶＨ 遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに 【０４４５】 対して特異的であるか、またはこれに結合することがで 特定の実施形態において、上記Ｖκ遺伝子セグメントは きる。 、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒト免疫グロブリ 【０４５０】 ンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリン 10 特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は κ遺伝子セグメントを含み、上記Ｊκ遺伝子セグメント 、ＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２−５、ＶＨ ２−７ は、Ｊκ１からＪκ５までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖 ０、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−２３、ＶＨ ３−３０、ＶＨ 遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。 ３−３３、ＶＨ ３−４９、ＶＨ ３−６４、ＶＨ ４−４、 【０４４６】 ＶＨ ４−２８、ＶＨ ４−３０−２、ＶＨ ４−３０−４、 １つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖 ＶＨ ４−３１、ＶＨ ４−３４、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ４− 配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリ ５９、ＶＨ ４−６１、ＶＨ ５−５１およびＶＨ ７−４− ン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記 １から選択される再構成ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含 非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺 むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、また 伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。１つ はこれに結合することができる。 の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列 20 【０４５１】 は、転写活性である非ヒト動物の生殖細胞系における非 特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は 免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態に 、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、 おいて、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２ Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖ ６遺伝子座である。 κ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２ 【０４４７】 、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１ １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に −１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、 おいて、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列 Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１− に由来する可変ドメインを含むヒト抗体を作製する方法 ２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖ を提供する。 κ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３ 【０４４８】 30 ３−７３およびＶＨ ３−７４から選択される再構成ヒ ０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７ おいて、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列 、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０から に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体を 選択される再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むヒト 作製する方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物を 軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれ 、ヒト可変ドメインを含む抗体に曝露することを含む方 に結合することができる。 法を提供する。１つの実施形態において、上記抗イディ 【０４５２】 オタイプ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインに対して特異的 特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は であるか、またはこれに結合することができる。１つの 、再構成ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含むヒト 実施形態において、上記抗体は、ヒト軽鎖可変ドメイン 軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれ に対して特異的であるか、またはこれに結合することが 40 に結合することができる。 できる。 【０４５３】 【０４４９】 特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は 特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は 、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、 、ＶＨ ６−１、ＶＨ １−２、ＶＨ １−３、ＶＨ ２−５、 Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２− ＶＨ ３−７、ＶＨ １−８、ＶＨ ３−９、ＶＨ ３−１１、 １４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖ ＶＨ ３−１３、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−１６、ＶＨ １− λ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２ １８、ＶＨ ３−２０、ＶＨ ３−２１、ＶＨ ３−２３、Ｖ ５、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−３２、Ｖλ２−３３、Ｖλ １−２４、ＶＨ ２−２６、ＶＨ ４−２８、ＶＨ ３−３ ２−３４、Ｖλ１−３６、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３ Ｈ ０、ＶＨ ４−３１、ＶＨ ３−３３、ＶＨ ４−３４、ＶＨ 、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１ ３−３５、ＶＨ ３−３８、ＶＨ ４−３９、ＶＨ ３−４３ 50 −４７、Ｖλ５−４８、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５０、 ( 66 ) JP 129 2015-519076 A 2015.7.9 130 Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ１０−５４、Ｖλ１ いて、上記抗体は、上記非ヒト動物から単離された１つ １−５５、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１ 以上の可変領域核酸配列に由来する１つ以上の可変ドメ およびＶλ４−６９から選択される再構成ヒトＶλ遺伝 インを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核 子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異 酸配列は、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む 的であるか、またはこれに結合することができる。 。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、 【０４５４】 免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。 １つの実施形態において、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメ 【実施例】 ント、２７のＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のＪＨ 遺伝 【０４５８】 子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝 以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製およ 子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされてい 10 び使用の仕方を当業者に説明するために提供するもので る１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメイン あり、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を を含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトＶＨ 制限することを意図したものではない。別の指示が無い １−６９遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメイン 限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近 に対して特異的であるか、またはこれに結合することが くである。 できる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、 実施例１ 上記非ヒト動物を、上記再構成ヒトＶＨ １−６９遺伝子 限定されたヒト化ＩｇＨ遺伝子座の構築 セグメントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒ 【０４５９】 ト動物から上記抗イディオタイプ抗体を単離することを すべてのヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ 遺伝 含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記単 子セグメントの上流にある単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメ 一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ １−２およ 20 ントを含有する、固有に操作されたヒト重鎖遺伝子座を びヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントから選択される。 、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを用いる相同組換え 【０４５５】 により構築することができる。かかる免疫グロブリン重 １つの実施形態において、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメ 鎖遺伝子座の構築に用いられる例示的なヒトＶＨ 遺伝子 ント、２７のＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のＪＨ 遺伝 セグメントとしては、コピー数の変動に関連づけられた 子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝 多型ＶＨ 遺伝子セグメントおよび／またはＶＨ 遺伝子セ 子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされてい グメント、例えばＶＨ １−２、ＶＨ １−６９、ＶＨ ２− る１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメイン ２６、ＶＨ ２−７０およびＶＨ ３−２３などが挙げられ を含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトＶκ る。数個のターゲティング構築物を使用して単一のＶＨ １−３９遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメイン を含有する重鎖遺伝子座を作るために、ＶＥＬＯＣＩＧ に対して特異的であるか、またはこれに結合することが 30 ＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用いることができ できる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、 る（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、および 上記非ヒト動物を、上記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメ Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３，Ｈｉｇ ントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒト動物 ｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ から上記抗体を単離することを含む方法を提供する。特 ｆ ｔｈｅ 定の実施形態において、上記単一のヒトＶＨ 遺伝子セグ ｄ ｗｉｔｈ メントは、ヒトＶＨ １−２およびヒトＶＨ １−６９遺伝 ｐｒｅｓｓｉｏｎ 子セグメントから選択される。 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 【０４５６】 ５９参照）。 １つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物から単離 【０４６０】 された１つ以上の可変領域核酸配列に由来する抗体また 40 ヒトＶＨ １−６９の限定されたＩｇＨ遺伝子座の例示的 は抗体断片を含むポリペプチドを含む薬学的組成物を提 な構築戦略（図１）。第一の工程では、ＶＨ １−６９、 供する。 上流選択カセット（例えば、ハイグロマイシン）、およ １つの実施形態において、上記ポリペプチドは抗体であ び５’マウスホモロジーアームを含む複数の遠位側（５ る。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、重 ’）ヒトＶＨ 遺伝子セグメントを含有する改変ヒトＢＡ 鎖のみの抗体である。１つの実施形態において、上記ポ Ｃを、やはり改変組換えシグナル配列を含有する第二の リペプチドは、一本鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）で 選択カセット（例えば、スペクチノマイシン）による相 ある。 同組換えによってターゲティングした（工程１、図１） 【０４５７】 。この改変組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により、ヒト １つの態様では、抗体を作製するための、本明細書に記 ＶＨ １−６９遺伝子の３’ＲＳＳ領域内に２つの点変異 載の非ヒト動物の使用を提供する。様々な実施形態にお 50 （ＴからＡへの変異およびＧからＡへの変異）を導入し ｍｏｕｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２１（６）：６５２−６ ( 67 ) JP 131 2015-519076 A 2015.7.9 132 、ＲＳＳ九量体を最適なコンセンサス配列に変化させた 流の約８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロ 。したがって、工程１の結果、改変３’ＲＳＳ、ＲＳＳ ジーアームを含有していた（図１）。 の約１８０ｂｐ下流の固有ＡｓｉＳＩ制限部位、および 【０４６４】 スペクチノマイシンカセットを有するヒトＶＨ １−６９ ヒトＶＨ １−２の限定されたＩｇＨ遺伝子座の例示的な 遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片が得られた 構築戦略（図２）。同様に、他の多型ＶＨ 遺伝子セグメ 。 ントをマウス重鎖定常領域との関連で使用して、限られ 【０４６１】 た数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ） 工程２には、Ｆｒｔ部位が隣接するネオマイシン（Ｎｅ の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントを有する一連のマウ ｏ）カセットを使用して、選択カセット（ハイグロマイ スであって、上記ＶセグメントがＶ遺伝子ファミリーメ シン）およびさらに上流（５’）ヒトＶＨ 遺伝子セグメ 10 ンバーの多型変異体であるマウスを構築する。例示的な ントを欠失させることが含まれていた。相同組換えによ 多型ＶＨ 遺伝子セグメントは、例えば、ＶＨ １−２、Ｖ ってヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントに対して５’に Ｈ この改変をターゲティングして、ヒトＶＨ １−６９の約 たヒトＶＨ 遺伝子セグメントに由来する。かかるヒトＶ ８．２ｋｂのプロモーター領域および５’マウスホモロ Ｈ ジーアームをインタクトにした。 ス上で利用可能な配列を用いてｄｅ 【０４６２】 えば、Ｂｌｕｅ 工程３には、固有操作制限部位（例えば、ＰＩ−Ｓｃｅ ｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）により得られる。したが ＩおよびＡｓｉＳＩ）が隣接する別の選択カセット（ス って、一部の実施形態において、各ＶＨ 遺伝子をコード ペクチノマイシン）を相同組換えによってターゲティン するＤＮＡ断片は、本明細書に記載のターゲティングベ グして、最初の３つの機能的ヒトＶＨ 遺伝子セグメント 20 クターへの組み込みとは独立に生成される。このように ならびにすべてのヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよびヒト 、マウス重鎖定常領域との関連では、限られた数のＶＨ ＪＨ 遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片にする 遺伝子セグメントを含む複数の改変免疫グロブリン重鎖 ことが含まれていた（図１）。ヒトゲノム断片は、ネオ 遺伝子座を操作する。ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメント マイシンカセットによる相同組換えによって予めターゲ 、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、および６のヒトＪ ティングされ、３’イントロンエンハンサーおよびＩｇ Ｈ Ｍ遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の５’および３’に 伝子座を作るための例示的なターゲティング戦略を図２ マウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアームおよ に示す。 び３’ホモロジーアームを含有していた。この改変によ 【０４６５】 り、５’マウスゲノム配列およびヒトＶＨ 遺伝子セグメ 簡単に言うと、３つのヒトＶＨ 遺伝子セグメント（ＶＨ ントを欠失させ、ヒトＤＨ １−１遺伝子セグメントの上 30 ６−１、ＶＨ １−２、ＶＨ １−３）、２７のヒトＤＨ 遺 流の約３．３ｋｂのＶＨ −ＤＨ 遺伝子間領域、ヒトＤＨ 伝子セグメント、および６のヒトＪＨ 遺伝子セグメント セグメントおよびヒトＪＨ セグメントのすべて、ならび を含有する改変ヒトＢＡＣクローン（２０１２年２月２ に３’イントロンエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含 ４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，０７５ 有する３’マウスゲノム断片がもたらされた（図１）。 号参照）を用いて、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントを 【０４６３】 含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を作る。この改 固有制限部位（上記）を使用して工程２および工程３か 変ＢＡＣクローンは、上記のヒト重鎖遺伝子セグメント らの２つの改変ＢＡＣを切断し、続いてライゲーション を、マウスイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領 することによって工程４を行い、最終ターゲティング構 域と機能的に連結する。限定されたヒトＶＨ １−２ベー 築物を得た。ＥＳ細胞内にヒトＶＨ １−６９遺伝子セグ スの重鎖遺伝子座は、上記の改変ヒトＢＡＣクローンを メント、すべてのヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよびすべ 40 用いて２回の相同組換えにより達成する。第一の相同組 てのヒトＪＨ 遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝 換えでは、改変ヒトＢＡＣクローン内の２０５ｂｐのヒ 子座を作るための最終ターゲティング構築物は、５’か トＶＨ ６−１遺伝子セグメント（エクソン１内のＶＨ ６ ら３’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約２０ｋ −１開始コドンの約１０ｂｐ上流（５’）からエクソン ｂのマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム ２の開始部の約６３ｂｐ下流（３’）まで）を、固有Ｐ 、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位が隣接するスペクチノマイシン（ 部位、約８．２ｋｂのヒトＶＨ １−６９プロモーター、 ａａｄＡ）カセットを用いて細菌性相同組換えにより欠 改変３’ＲＳＳを有するヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメ 失させる（図２、ＢＨＲ１）。これにより、限定された ント、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、６のヒトＪＨ 重鎖遺伝子座内の他のヒト遺伝子セグメントを破壊せず セグメント、ならびに３’イントロンエンハンサーおよ に、続いてａａｄＡカセットを除去することが可能とな びＩｇＭ遺伝子を含むマウスＪＨ 遺伝子セグメントの下 50 る。第二の相同組換えでは、ヒトＶＨ １−３遺伝子セグ ２−２６、ＶＨ ２−７０、およびＶＨ ３−２３を含め 遺伝子セグメントは、例えば、公開されたデータベー Ｈｅｒｏｎ ｎｏｖｏ合成（例 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ 遺伝子セグメントを含有する限定されたヒト化重鎖遺 ( 68 ) JP 133 2015-519076 A 2015.7.9 134 メントの全体およびこの遺伝子セグメントの約６０ｂｐ 有する限定された重鎖遺伝子座を保有するマウスを確認 下流（３’）を含む改変ヒトＢＡＣクローンの５’末端 するために用いられるプライマーおよびプローブを示す を、隣接する５’ＡｓｉＳＩ制限部位および３’Ａｓｃ 。 Ｉ制限部位を含有するハイグロマイシンカセットを用い 【０４６９】 て相同組換えにより欠失させる（図２、ＢＨＲ２）。上 ターゲティングベクターにより導入されるＦｒｔを組み 記の通り、ヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントに隣接する 込んだあらゆるネオマイシンカセットであって、例えば ２つのヒトＶＨ 遺伝子セグメントの欠失を含め、最終タ 、ＥＳ細胞期でも胚でも除去されない該ネオマイシンカ ーゲティングベクターの確認後に、スペクチノマイシン セットを除去するために、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメ カセットを必要に応じて除去する（図２、下）。例示的 ントを含有する操作された重鎖遺伝子座を保有するマウ なヒトＶＨ １−２ターゲティングベクターを配列番号７ 10 スを、ＦＬＰｅ欠失マウス系統へと繁殖させることがで ５に示す。 きる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら、（２ 【０４６６】 ０００）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ 限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座において多型Ｖ ｅｒ ｍｉｃｅ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ＦＬＰｅ ｉｓ 遺伝子セグメントを使用することは、抗体、抗体集団 ａｎ 、および単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメントに由来する多 ｘＰ． 様なＣＤＲを有する重鎖を有する抗体を発現するＢ細胞 ９−１４０参照）。必要に応じて、ネオマイシンカセッ 集団を生成するための新規アプローチの代表的なもので トは、マウスにおいて保持される。 ある。宿主動物の体細胞超変異機構を、再構成ヒト免疫 【０４７０】 グロブリン軽鎖可変ドメインと組み合わせて共に利用す 子を遺伝子型解析し、免疫グロブリン重鎖レパートリー ることにより、遺伝子改変動物の免疫レパートリーを拡 20 を特徴づけるために、内因性マウス免疫グロブリン定常 張し、ヒト病原体に対して特異的な中和抗体を作製する 遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ 遺伝子セ ためのプラットホームとして特に有用なヒト治療薬を作 グメント、すべてのヒトＤＨ セグメントおよびヒトＪＨ 製するための次世代プラットホームとしてのそれらの有 セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテ 用性を増強する固有の重鎖および固有のＶＨ ／ＶＬ 対の ロ接合性の子を選択する。 操作がもたらされる。 【表３】 Ｈ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｄｅｌｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｒｅ−ｌｏ ２５：１３ 【０４６７】 最終的な所望の遺伝子座構造に基づいて、所望のヒトＶ Ｈ 遺伝子セグメントを含有するヒトＢＡＣクローンを使 用して、他のヒトＶＨ 遺伝子セグメントの１つを同様に 置換することができる。したがって、さらなる多型ＶＨ 30 遺伝子セグメントおよび／または他の多型ＶＨ 遺伝子セ グメントをマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込 むための上記戦略を用いることにより、別の方法では宿 主免疫系を有効に回避し得るヒト病原体を中和するのに 用いられる新規抗体レパートリーの生成が可能となる。 【０４６８】 上記ターゲティングＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用 いて、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（上掲） により８細胞期のマウス胚に導入する。マウス免疫グロ ブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結された単一のヒ 40 トＶＨ 遺伝子セグメント、すべてのヒトＤＨ 遺伝子セグ メントおよびヒトＪＨ 遺伝子セグメントを含有するヒト 化重鎖遺伝子座を保有するマウスは、ネオマイシンカセ 実施例２ ット、ヒトＶＨ 遺伝子セグメント、ならびにヒトＤＨ 遺 限定されたヒト化ＩｇＨ遺伝子座へのＡＤＡＭ遺伝子の 伝子セグメントおよびヒトＪＨ 遺伝子セグメント内の領 リエンジニアリング 域、ならびに内因性重鎖配列の存在を検出する対立遺伝 【０４７１】 子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上掲）の変法を 内因性可変領域遺伝子セグメント（ＶＤＪ）が置換およ 用いて遺伝子型解析により同定する。表３は、単一のヒ び／または欠失されたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子 トＶＨ １−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ 遺伝 座を有するマウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の発現を 子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子セグメントを含 50 欠く。特に、かかるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座 ( 69 ) JP 135 2015-519076 A 2015.7.9 136 を含む雄マウスは、妊性の低減を示す。したがって、通 セットによる細菌性相同組換えによって別々にターゲテ 常の交配法を使用して改変マウス系統を持続させるため ィングした（図３、左上）。この工程の後、限定された に、ヒト化（しかし制限的）重鎖遺伝子座を有するマウ ヒト化重鎖遺伝子座、ネオマイシンおよびスペクチノマ スにＡＤＡＭ６発現能をリエンジニアリングした。 イシンカセットを含有する改変ゲノム断片、ならびにＡ 【０４７２】 ＤＡＭ６遺伝子、ハイグロマイシンおよびスペクチノマ ヒトＶＨ １−６９の限定されたＩｇＨ遺伝子座へのＡＤ イシンカセットを含有する改変マウス断片をＩ−Ｃｅｕ ＡＭ６遺伝子のリエンジニアリング（図３）。すべての ＩおよびＡｓｃＩ制限酵素で別々に消化して、ライゲー ヒトＤＨ およびＪＨ 遺伝子セグメントの上流にある単一 ション用の改変ゲノム断片を作った（図３、中央）。工 のヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメントを含有する限定さ 程５では、消化した適切なゲノム断片を精製および共に れた免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスＡＤＡＭ６ 10 ライゲーションして、単一のヒトＶＨ 遺伝子セグメント ａおよびＡＤＡＭ６ｂ（配列番号７７）をコードするゲ 、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、６のヒトＪＨ 遺伝 ノム断片を含有するように、ＢＡＣ ＤＮＡを使用して 子セグメント、ならびにネオマイシンおよびハイグロマ 相同組換えによってリエンジニアリングした。ＶＥＬＯ イシン耐性を有するＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂを ＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（上掲）によ コードする組み込まれたマウスゲノム断片を含有するリ って、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣ ＤＮＡ エンジニアリングヒト化重鎖遺伝子座を得た。最後の工 の改変を含む一連の６の工程（これにより、マウス重鎖 程（工程６）では、ＡｓｉＳＩ消化によってハイグロマ 定常領域およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子に隣接する限定 イシンカセットを欠失させ、続いて適合性末端を再ライ されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティン ゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）した。 グベクターが得られた）において、これを達成した。 【０４７５】 【０４７３】 20 この工程により、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ 第一に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子周囲の独自位置の制限 ｂ配列を限定されたヒト化重鎖遺伝子座に再挿入するた 部位に様々な選択カセットをもたらす一連の３回の細菌 めの最終ターゲティングベクターであって、５’から３ 性相同組換えによって、単一のＶＨ 遺伝子セグメントを ’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約２０ｋｂの 含有するヒト化重鎖遺伝子座への挿入のために、マウス マウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、５ ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードするマウスゲ ’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位 ノム断片を調製した（図３、工程１∼３）。第一の工程 、約８．２ｋｂのヒトＶＨ １−６９プロモーター、改変 では、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一部を含有 ３’ＲＳＳを有するヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメント するマウスＢＡＣ ＤＮＡを、組換え部位に隣接するネ 、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子（配列 オマイシンカセット（固有ＡｓｉＳＩ制限部位を含有す 番号７７）を含む約１７７１１ｂｐのマウスゲノム配列 るようにこれを操作したもの）でターゲティングした。 30 を含有するマウスゲノム断片、２７のヒトＤＨ および６ 次いで、第二の工程では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子およ のヒトＪＨ 遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片 びネオマイシンカセットを含有する改変マウス断片をタ 、ならびにイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領 ーゲティングして、マウスＤＨ およびＪＨ 遺伝子セグメ 域遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の下流に約８ｋｂの ントを欠失させ、選択遺伝子の５’に位置する固有Ａｓ マウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアームを含 ｃＩ制限部位を含有するスペクチノマイシンカセットで 有する最終ターゲティングベクターを生産した（ヒトＶ それらを置換した。第三の工程では、マウスＡＤＡＭ６ Ｈ 遺伝子とスペクチノマイシンカセットとの間に位置する ４；図３、下）。 ネオマイシンカセットを含有する二重改変マウス断片を 【０４７６】 ターゲティングして、ネオマイシンカセットをハイグロ ヒトＶＨ １−２の限定されたＩｇＨ遺伝子座へのＡＤＡ マイシンカセットに交換した。単一のＶＨ 遺伝子セグメ 40 Ｍ６遺伝子のリエンジニアリング（図４）。 ントを含有するヒト化重鎖遺伝子座に適合性ゲノム断片 【０４７７】 をライゲーションすることによって、ＡＤＡＭ６遺伝子 すべてのヒトＤＨ およびＪＨ 遺伝子セグメントの上流に を含有する改変マウスゲノム断片を挿入することができ ある単一のヒトＶＨ １−２遺伝子セグメントを含有する るように、これを行った。 限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスＡＤ 【０４７４】 ＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ（配列番号７３）をコード 工程４では、ヒトＶＨ １−６９遺伝子セグメント、２７ するゲノム断片を含有するように、ＢＡＣＤＮＡを使用 のヒトＤＨ 遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ 遺伝子 して相同組換えによってリエンジニアリングする。ＶＥ セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を、それぞれ ＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（上掲） カセットの５’および３’の場所に固有Ｉ−ＣｅｕＩお によって、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣＤＮ よびＡｓｃＩ制限部位を含有するスペクチノマイシンカ 50 Ａの改変を含む一連の工程（これにより、マウス重鎖定 １−６９／Ａ６ターゲティングベクター、配列番号７ ( 70 ) JP 137 2015-519076 A 2015.7.9 138 常領域およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子に隣接する限定さ ｂｐのオーバーラップを含有し、ＡＤＡＭ６遺伝子を含 れたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティング 有する改変マウスＢＡＣクローンのＮｏｔＩ部位および ベクターが得られた）において、これを達成した。 隣接３’配列と３０ｂｐのオーバーラップを含有する。 【０４７８】 ３’結合オリゴは、ＡＤＡＭ６遺伝子、ＡｓｃＩ部位を ハイグロマイシンカセットが５’に隣接しスペクチノマ 含有する改変マウスＢＡＣクローンのＡｓｃＩ部位の５ イシンカセットが３’に隣接する単一のヒトＶＨ １−２ ’配列と２６ｂｐのオーバーラップを含有し、ヒトＶＨ 遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ 遺伝子セグメント、 １−２を含有する改変ヒトＢＡＣクローンのＡｓｃＩ部 ６のヒトＪＨ 遺伝子セグメント、マウス重鎖イントロン 位の３’配列と３５ｂｐのオーバーラップを含有する。 エンハンサー、およびマウスＩｇＭ定常領域を含有する アセンブリ反応物を大腸菌にトランスフォームし、カナ 改変ヒトＢＡＣクローン（実施例１において上記）を、 10 マイシンおよびスペクチノマイシン選択を用いて正しい マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするゲノム断片を含有 生成物を選択する。最終ターゲティングベクターを作る するように改変した。これは、本明細書ではオリゴ媒介 ために、スペクチノマイシンカセットをＰＩ−ＳｃｅＩ 等温アセンブリ（ｏｌｉｇｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ 消化によって除去し、続いて再ライゲーションする。 ｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ）と称される改良 【０４８０】 等温ＤＮＡアセンブリ法によって達成されるが、この方 最終ターゲティングベクターは、５’から３’に向けて 法は、Ｇｉｂｓｏｎら、（２００９，Ｅｎｚｙｍａｔｉ 、２０ｋｂの遠位マウスＩｇＨホモロジーアーム、マウ ｃ スＡＤＡＭ６ａ遺伝子、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシン ｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｐ ｔｏ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ カセット、３’Ｆｒｔ部位、マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子 ｋｉｌｏｂａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ 、約１８ｋｂのヒトゲノム断片、ヒトＶＨ １−２遺伝子 ６（５）：３４３−３４５）に記載されている方法に基 20 セグメント、約４６．６ｋｂのヒトゲノム断片、不活性 づくものである。この改良法は、ライゲーションされる 化ヒトＶＨ ６−１遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ 遺 断片間の配列同一性を必要としない。代わりに、２つの 伝子セグメント、６のヒトＪＨ 遺伝子セグメント、なら 断片を結合する働きをするオリゴによって配列同一性が びにマウスＩｇＨイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ 付与される。さらに、上記オリゴは、上記断片の一方の 定常領域を含有する８ｋｂの３’マウスホモロジーアー 末端に配列同一性を与える鋳型として働く。延長された ムを含有する（配列番号７６）。 断片により、第二の断片とのハイブリダイゼーションが 【０４８１】 可能になる。具体的には、オリゴ媒介等温アセンブリを 各最終ターゲティングベクター（上記）を使用して、欠 用いて、２０ｋｂの遠位マウスＩｇＨホモロジーアーム 失した内因性遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞をエレ 、マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子、Ｆｒｔ部位が隣接するネ クトロポレートして、限定されたヒト化重鎖遺伝子座内 オマイシンカセット、およびマウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子 30 にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、 を含有するＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ断片でハイグロマイシン 異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞 カセットを置換した。 を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノ 【０４７９】 ム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標 簡単に言うと、限定されたヒトＶＨ １−２重鎖遺伝子座 ）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｅａ を含有する改変ヒトＢＡＣクローン（図４、左上）をＡ ｎｄ ｓｉＳＩおよびＡｓｃＩで消化してハイグロマイシンカ ｃｅｓ セットを除去し、マウスＡＤＡＭ６遺伝子を含有する改 ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５’ｎｕｃｌｅａｓｅ 変マウスＢＡＣ（図４、右上）をＮｏｔＩおよびＡｓｃ ｙｓ，Ｃｕｒｒ Ｉで消化して、５’マウスアームを含有する断片を除去 （１）：４３−４８）によって同定した。 し、ネオマイシンカセットに隣接するマウスＡＤＡＭ６ 40 【０４８２】 遺伝子を放出させる。続いて、消化した２つのＢＡＣ断 上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用 片を５’および３’結合（ｊｏｉｎｅｒ）オリゴヌクレ し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの操作 オチドと共に混合し、アセンブリ反応混合物（Ｔ５エキ 方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同 ソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ 第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４ ＤＴＴ、５％ＰＥ 号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。マウスＡ 、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、１０ｍＭ Ｇ８０００（ｗ／ｖ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２ および１００ｍＭ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８，Ａｄｖａｎ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｏｐｉｎ ＰＣＲ ｔ ａｓｓａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９ ＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む限られた数の Ｔ ヒト遺伝子セグメントおよび異所性マウスゲノム配列を ｒｉｓ−ＨＣｌ）中、５０℃で１時間インキュベートす 含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、上記 る。５’結合オリゴは、ヒトＶＨ １−２を含有する改変 限定されたヒト化重鎖遺伝子座およびヒト重鎖配列内の ヒトＢＡＣクローンのＡｓｉＳＩ部位の５’配列と３８ 50 マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を ( 71 ) JP 139 2015-519076 A 2015.7.9 140 検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら Ｍ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有する限 、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同 定されたヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子 定した。 を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性を特徴づけ 【０４８３】 るために選択する。 子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡ 【図１】 【図３】 【図４】 【図２】 ( 72 ) 【図５】 JP 【図７】 【図６】 【図８】 2015-519076 A 2015.7.9 ( 73 ) 【図９】 JP 【図１０】 2015-519076 A 2015.7.9 ( 74 ) 【配列表】 2015519076000001.app JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 75 ) 【国際調査報告】 JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 76 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 77 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 78 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 79 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 80 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 81 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ( 82 ) JP 2015-519076 A 2015.7.9 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,T M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,R S,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB, BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,H U,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI ,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG, US,UZ,VC (72)発明者 マクドナルド， リン アメリカ合衆国 ニューヨーク １０６０５， ホワイト プレインズ， ニューヨーク １０５９１， タリータウン， ニューヨーク １０５７０， プレザントビル， ゲッドニー ウェイ １６ (72)発明者 ミクウィルター， アメリカ合衆国 ジョン クレッセント ドライブ ２１ ５２ (72)発明者 ツー， ナクシン アメリカ合衆国 ワシントン アベニュー ５ ストリート ３ １４ (72)発明者 スティーブンズ， アメリカ合衆国 ５５ (72)発明者 ショーン カリフォルニア ９４１５８， サンフランシスコ， ベリー ナンバー４１３ マーフィー， アメリカ合衆国 アンドリュー ジェイ． ニューヨーク １０５２０， クロトン−オン−ハドソン， ト １０ Ｆターム(参考) 4B024 AA01 AA10 AA20 BA41 CA01 DA02 4B064 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 AB05 AC20 EA04 GA11 HA01 BA02 CA25 CA44 ニュートン コー
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