論文審査の要旨および担当者 学位申請者 西山 啓 太 （ 3DZ12001 環境生物化学） 乳 酸 菌 の 宿 主 定 着 性 に 寄 与 す る 細 胞 表 層 タ 学位論文題目 ンパク質に関する研究 主査 北里大学教授 有原 圭三 副査 北里大学教授 佐藤 久聡 副査 和洋女子大学教授 中島 肇 副査 北里大学准教授 柏本 孝茂 担当者 論文審査の要旨 腸内細菌叢を構成する細菌のひとつである乳酸菌の主な棲息域である 十二指腸から小腸下部の粘膜は，粘性のムチン糖タンパク質に覆われて おり，これに付着することで消化管での定着の足掛かりとしていると考 えられている。特に，硫酸化されたムチン（スルホムチン）は消化管粘 膜に豊富に存在することから乳酸菌の受容体分子として重要視されてき た。一方，乳酸菌にとって外部環境との接点となる菌体表層タンパク質 は，宿主との相互作用を理解する上で重要であり，これら幾つかの菌体 表層タンパク質は，付着因子として機能することが知られている。しか し乳酸菌におけるスルホムチンとの詳細な相互作用は未だ見いだされて いない。申請者らの研究グループは，スルホムチンと類似の糖鎖構造を も つ 複 合 糖 脂 質 ス ル フ ァ チ ド に 付 着 性 を 示 す 乳 酸 菌 と し て Lactobacillus reuteri JCM1081 株 を 選 抜 し ， さ ら に オ ク チ ル グ ル コ シ ド に よ り 抽 出 さ れ た 推 定 分 子 量 47kDa の 細 胞 表 層 タ ン パ ク 質（ P47）を 硫 酸 １ 化 糖 鎖 結 合 因 子 と し て 推 察 し て き た 。こ れ を 踏 ま え 、本 研 究 は ，L. reuteri JCM1081 の 消 化 管 で の 生 存 戦 略 に お け る P47 の 付 着 因 子 と し て の 機 能 的 役割を明らかにすることを目的として行われた。 硫酸化糖鎖結合タンパク質の同定とその結合特性の解析 ムチンは，乳酸菌の付着性の評価に広く用いられるが，粘性の性質ゆ え に 多 く の 莢 雑 物 を 含 む 。ま ず ，申 請 者 は ，P47 と ム チ ン 糖 鎖 の 相 互 作 用 を評価するために，ブタの消化管からムチン層を剥離し，ゲル濾過クロ マトグラフィーと密度勾配超遠心分離を組み合わせた手法により，高純 度なムチンを精製することに成功した。また，種々のレクチンおよび抗 ム チ ン モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た ELISA 法 に よ り ， ブ タ 大 腸 ム チ ン に 硫 酸 化 血 液 型 糖 鎖 あ る い は Sd a タ イ プ 血 液 型 糖 鎖 構 造 を 含 む ス ル ホ ム チ ンやシアロムチンが含まれることを明らかにした。 次 に ，P47 の N 末 端 と 内 部 ア ミ ノ 酸 配 列 に 基 づ き 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し ， 配 列 を 解 析 し た 結 果 ， P47 は 翻 訳 伸 長 因 子 （ EF-Tu） で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 そ こ で ， 組 み 換 え EF-Tu タ ン パ ク 質 （ His 6 -EF-Tu） を 作 製 し ， His 6 -EF-Tu の 複 合 糖 脂 質 に 対 す る 結 合 特 性 を 解 析 し た 。 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 に よ る 解 析 か ら ， His 6 -EF-Tu は ， １ ） 非 還 元 末 端 が 硫 酸 化 ガ ラクトシル基の複合糖脂質に結合すること，２）スルファチドに対して ナ ノ モ ル オ ー ダ ー の 解 離 定 数 （ KD ） を 示 す こ と ， ３ ） 非 還 元 末 端 が ガ ラ クトシル基あるいは負の電荷をもつシアル酸には結合しないことを示し， EF-Tu は 硫 酸 化 糖 鎖 と 特 異 的 な 相 互 作 用 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。そ こ で ，EF-Tu の ム チ ン 糖 鎖 へ の 結 合 性 に つ い て も 解 析 を 行 っ た 。ム チ ン オ リ ゴ 糖 を 競 合 体 と し て ム チ ン へ の His 6 -EF-Tu の 結 合 を 競 合 ELISA に よ り 評 価 し た 。 酸 性 オ リ ゴ 糖 画 分 の 添 加 は His 6 -EF-Tu の 結 合 を 濃 度 依 存 的 に 阻 ２ 害したが，中性オリゴ糖画分による阻害は認められなかった。また，ブ タ 胃 底 部 粘 膜 組 織 の 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 で は HID 染 色 と His 6 -EF-Tu の 反 応 部 位 が 類 似 し た 。以 上 よ り ，EF-Tu は 複 雑 な 糖 鎖 構 造 を も つ ム チ ン に お いても，硫酸化糖鎖に対して特異な結合性をもつことが示された。 続 い て ， L. reuteri に お け る EF-Tu の 局 在 と 付 着 因 子 と し て の 機 能 を 評 価 し た 。抗 EF- Tu 抗 体 を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り ，L. reuteri JCM1081 を 含 む L. reuteri ５ 菌 株 に お い て EF-Tu が 菌 体 表 層 に 局 在 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た ， L. reuteri の ム チ ン へ の 付 着 性 は ， 抗 EF-Tu 抗 体 の 処 理 に よ り 濃 度 依 存 的 に 阻 害 さ れ た 。 以 上 よ り ， EF-Tu は ， L. reuteri の 付 着 因 子 と し て 機 能 す る こ と が 示 さ れ た 。 EF-Tu を 介 し た 付 着 機 構 か ら ス ル ホ ム チ ン は 確 か な 乳 酸 菌 の 受 容 体 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。ま た ，ビ フ ィ ズ ス 菌（ Bifidobacterium ）は ， ほ乳類の大腸において優勢菌種であり，プロバイオティクスとして利用 価 値 の 高 い 菌 種 で あ る 。そ こ で ビ フ ィ ズ ス 菌 22 菌 株 の ム チ ン へ の 付 着 性 を評価した結果，スルホムチンに付着性を示す幾つかの菌株が存在する こ と を 見 出 し た 。 ま た ， こ れ ら の 菌 株 に お い て も EF-Tu の 細 胞 表 層 局 在 が確認され，付着因子として機能することが推察された。 EF-Tu の 分 泌 機 構 の 解 明 EF-Tu が 乳 酸 菌 の 菌 体 表 層 に 存 在 し ，ス ル ホ ム チ ン へ の 付 着 因 子 と し て 機 能 す る こ と を 明 ら か に し た 。一 方 ，EF-Tu に は ，分 泌 に 必 要 な 既 知 の 分 泌シグナル配列が保存されていないにもかかわらず，乳酸菌を含めた 様 々 な 細 菌 で 細 胞 外 へ の 分 泌 が 確 認 さ れ て い る 。し か し ，EF -Tu の 分 泌 機 構 は 全 く 不 明 で あ る 。 そ こ で L. reuteri に お け る EF-Tu の 分 泌 機 構 の 全 容を明らかにすることを目的とした。 ３ L. reuteri JCM1081 に 対 し て ATPase 阻 害 剤 で あ る ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム を 添 加 し た と こ ろ EF-Tu の 分 泌 は 著 し く 低 下 し た 。 ま た ， 自 己 溶 菌 や 膜 小 胞体を介した分泌でないことを示唆するデータが得られたことから， EF-Tu の 細 胞 外 へ の 移 行 に 能 動 的 分 泌 機 構 が 関 与 し て い る 可 能 性 を 考 え た 。そ こ で ATPase 活 性 依 存 性 の Sec 輸 送 経 路 に 着 目 し た 。膜 チ ャ ネ ル 複 合 体 の 構 成 因 子 で あ る secY 欠 損 株 を 作 出 し ，分 泌 を 評 価 し た 結 果 ，EF-Tu の 分 泌 は 殆 ど 確 認 さ れ な く な っ た 。以 上 よ り ，EF-Tu の 分 泌 に Sec 輸 送 経 路の関与が強く推察された。 Sec 輸 送 経 路 に よ り 分 泌 さ れ る タ ン パ ク 質 の N 末 端 に は 高 度 に 保 存 さ れ た シ グ ナ ル 配 列 が 存 在 す る 。そ こ で ，分 泌 シ グ ナ ル を 探 索 す る た め に ， EF-Tu の 幾 つ か の ア ミ ノ 酸 残 基 を 欠 損 ま た は 置 換 さ せ た 変 異 EF-Tu F L A G を プ ラ ス ミ ド に 導 入 し ，EF-Tu の 分 泌 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。そ の 結 果 ， C 末 端 の 35 ア ミ ノ 酸 残 基 の 欠 損 に よ り EF-Tu の 分 泌 は 著 し く 低 下 した。また，本領域のアミノ酸置換により，特定の塩基性または疎水性 アミノ酸が分泌に関与する可能性が示された。 次 に ，本 領 域 の 分 泌 シ グ ナ ル と し て の 機 能 を 評 価 す る た め ，C 末 端 を 欠 損 し た 変 異 EF-Tu F L A G を 用 い て ， プ ル ダ ウ ン 法 に よ り Sec 輸 送 経 路 の モ ー タ ー タ ン パ ク 質 SecA と の 相 互 作 用 を 評 価 し た 。 EF-Tu は C 末 端 領 域 を 介 し て 組 み 換 え SecA タ ン パ ク 質（ His 6 -SecA ）と 相 互 作 用 し ，さ ら に ，EF-Tu は His 6 -SecA の ATPase 活 性 を 高 め る こ と が 示 さ れ た 。 以 上 よ り ， EF-Tu の C 末 端 領 域 が Sec 依 存 性 の 分 泌 シ グ ナ ル と し て 機 能 す る こ と が 強 く 推 察された。 以 上 の 研 究 に よ り ，以 下 の 点 が 明 ら か に な っ た 。① EF-Tu は ，硫 酸 化 糖 鎖 を エ ピ ト ー プ と す る 乳 酸 菌 の 付 着 因 子 で あ る 。② EF-Tu の 分 泌 に は ，Sec ４ 輸送経路が関与し，既知の分泌シグナルとは異なる C 末端の特定の配列 依 存 的 に 細 胞 外 へ と 移 行 す る 。こ れ に よ り ，EF-Tu が 新 た な 分 泌 機 構 に よ り細胞外へと分泌され，消化管内において硫酸化糖鎖への付着因子とし て重要な役割を演じていることを明らかにした。なお、本論文における 一連の研究成果は、すでに２報の学術雑誌掲載論文として公表されてい る。 審 査 員 一 同 は 、本 論 文 が 多 く の 優 れ た 新 知 見 を 含 み 、当 該 学 問 領 域 の 発 展 に 寄 与 す る と 共 に 、プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 利 用 の 新 た な 展 開 に も 貢 献 を す る も の と の 認 識 で 一 致 し た 。さ ら に 、著 者 は 真 摯 な 研 究 態 度 と 豊 か な 人 間 性 を 備 え て お り 、博 士（ 農 学 ）の 学 位 を 授 与 す る に 相 応 し い と 判 断した。 ５
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