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Helicobacter pylori OipA による
樹状細胞の in vitro での抑制
抄　訳
松尾　祐一、山岡　吉生（大分大学医学部環境・予防医学）
In Vitro Suppression of Dendritic Cells by Helicobacter pylori OipA
Omid Teymournejad,* Ashraf M. Mobarez,* Zuhair M. Hassan,† Seyed M. Moazzeni† and Hassan N. Ahmadabad†
*Department
†Department
of Bacteriology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran,
of Immunology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
要　約
背景：Outer inflammatory protein A（OipA）は Helicobacter pylori（H. pylori ）の重要な病原因子である。
本研究では、OipA を精製し、樹状細胞（DCs）に対するサイトカインの誘導と成熟度への影響を明らかにし
た。
対象と方法：pET28a ベクターを用いて OipA 発現ベクターを構築し、Escherichia coli BL21（DE3）株
を使用して OipA を発現させた。その後 Ni-NTA アフィニティー精製を行うことで、OipA を精製した。未成熟
樹状細胞（DC）は 90% 以上の純度で近交系 C57/BL6 マウスの脾臓から分離し、様々な濃度の OipA 精製
標品とオーバーナイトで共培養した。共培養後の DC の成熟度表面マーカー（CD86、CD40 および MHC-II）
をフローサイトメトリーで評価し、インターロイキン（IL）-10 と IL-12 の産生量を酵素結合免疫吸着検定
（ELISA）法で測定した。
結果：対照群と比較して 10 µg/mL と 20 µg/mL OipA と共培養後の DC の成熟度マーカー（CD86、
CD40 および MHC-II）の発現は抑制されていた。5 µg/mL で OipA 濃度依存的に IL-10 の産生量は減少した
が、IL-12 の産生量には影響しなかった。
結論：H. pylori は免疫防御機構を有しており、これにより胃での定着を可能としている。DC は自然免疫
と獲得免疫の中心的役割を担っており、DC が産生するサイトカインにより調節されている。過去の研究によ
り、H. pylori は DC に対して免疫寛容の状態を引き起こすことで、長期間にわたり胃に定着することが示さ
れている。本研究では、OipA が DC の成熟と IL-10 の産生を抑制することで、H. pylori 感染の慢性化を成立
させていることが明らかとなった。
キーワード：樹状細胞、Helicobacter pylori 、OipA、抑制
対象と方法
Escherichia coli（E. coli ）BL21（DE3）株を使用
動物：8 ～ 10 週齢のメスの近交系 C57/BL6 マウス
して発現させた。精製は 8M 尿素の変性条件下で行
OipA の作成
い、尿素除去で OipA のリフォールディングを行った。
Helicobacter pylori（H. pylori ）26,695 株につい
て outer inflammatory protein A（oipA）遺伝子の
クローニングを行い、pET28a ベクターを用いて
OipA 発現ベクターを構築した。そしてこれを
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 19: 136–143
32
抗 OipA 抗体を用いたウエスタンブロットで、精製標
品に OipA が含まれることを確認した。
Helicobacter pylori OipA よる樹状細胞の in vitro での抑制
マウス脾臓由来樹状細胞（DC）の分離
統計解析
近交系 C57/BL6 マウス脾臓の単核細胞懸濁液か
p 値＜ 0.05 を統計学的有意差とした。
ら抗 CD11c 磁気ビーズで DC を分離し、フローサイ
結　果
トメトリーで純度の評価を行った。
OipA の精製
DC と OipA との共培養
DC Suppression by H. pylori OipA
96 ウェルプレートで 2 × 105DCs/0.2 mL と OipA
A
質（ 5、10 および 20 µg/mL）を RPMI 1640 培地を
全長OipA 遺伝子の 783bpを用いて、組換え
OipA
Teymournejad et al.
を精製した。精製した OipA は 30kDa で、約 95% の
純度の精製標品が得られた。
使用して、オーバーナイトで培養した。また、形質
転換を行っていない E. coli BL21（DE3）の精製標
品を陰性対照群とした。
マウス脾臓由来 DC の分離
分離した細胞を PE 抱合体の抗 CD11c 抗体で標
識後、フローサイトメトリーにより 90% 以上の純度
B
フローサイトメトリー
の DC が得られた。
DC の表現型解析には PE 抱合体の抗 CD11c と
FITC 抱合体の抗 CD86 抗体、抗 CD40 抗体、抗
OipA と共培養した DC の成熟度表面マーカーの
MHC-II 抗体を使用した。共培養後の DC をこれら
発現
の抗体で標識後、フローサイトメトリーで解析した。
10 µg/mL および 20 µg/mL OipA と共培養後の
DC における CD86 および CD40 の発現量は陰性対
Figure 5 Representative flow cytometry dot plots showing the level
of dendritic
cells’ purity. Upper left part of image shows more than
サイトカインの測定
90% dendritic cell (DC) purity.
照群と比較して有意に減少していた（図 1A、B、
培養上清のインターロイキン（IL）-10、IL-12 濃
p ＜on0.05）
。また、20 µg/ml
Figure 7いずれも
Effect of OipA
surface
CD86 expression by OipA
splenic と共培養
den-
A OipA
n by H. pylori
cells (DCs). DCs were
purified (>90%)
from spleen of C57BL/6
Teymournejad
後の DC における
MHCet-al.
II の発現量も有意に減少し
mice and cultured overnight
in
the
presence
of
Teymournejad et al. various concentrations
ていた（
図The
1Csurface
、p ＜CD86
0.05）
。
of OipA (1–20
lg/mL).
expression
of DCs was determined by anti-CD86-FITC, and the level of purification was verified by
anti-CD11c-PE. (A) Representative
flow cytometry dot plots showing
A
the level of CD86 expression on the double-positive-stained cells in
the upper right. (B) The results were expressed as mean of
n = 6 SD, and statistically significant differences in the negative
control are indicated as *(p < .05). Protein purification method was
C
performed on untransformed Escherichia
coli BL21 (DE3), and purified
materials were used as negative control.
dritic
度を酵素結合免疫吸着検定（ELISA）法で測定し
た。
A
B
A
B
B
sentative flow cytometry dot plots showing the level
s’ purity. Upper left part of image shows more than
ll (DC) purity.
B
concentrations of OipA resulted in decreased IL-10
secretion by DCs. Indeed by increasing OipA concentration to 5 lg/mL, statistically significant difference
(p < .05) was observed compared with negative
control. No change was detected in IL-12 production
between OipA-treated DCs and negative control (Figs 9
and 10).
Figure
8 Effect
of OipA on surface MHC-II expression by splenic denFigure
Effect of
OipA on
CD86 expression
by splenic
den-IIsurface
Figure 6 図
Effect
OipA onDC
surface
CD40 expression
by7発現（B）
splenic
den1．of
脾臓由来
の CD40（A）
、CD86
、MHC
発現（C）に対する
OipA
の影響
Discussion
dritic
cells
(DCs).
DCs were purified (>90%) from spleen of C57BL/6
dritic
cells
(DCs).
DCs
were
purified
(>90%)
from
spleen
of
C57BL/6
dritic cellsDC
(DCs).
DCs were purified (>90%) from spleen of C57BL/6
は 90% 以上の純度で近交系 C57/BL6 マウス脾臓から分離し、様々な濃度の OipA（1 ～ 20 µg/mL）とオーバーナイトで共培養を行った。
mice
andiscultured
overnight in the presence of various concentrations
mice and
cultured overnight
in the presence
of various
concentrations
Helicobacter
pylori
OipA
an
inflammation-related
mice and CD40、CD86
cultured overnight
in
the
presence
of
various
concentrations
および MHC-II はそれぞれ FITC 抱合体の抗 CD40 抗体、CD86 抗体および MHC-II 抗体で標識した。DC 純度の確認には PE 抱合体
of DCs
OipAwas
(1–20
lg/mL).
surface MHC-II
of OipA
(1–20
surface
CD86
expression
deterof OipA (1–20
The surface CD40 expression
of DCs
was lg/mL).
deter- The outer
protein,
which
is an The
important
viru- expression of DCs was
の抗 lg/mL).
CD11c 抗体を使用した。グラフは平均値±標準偏差を表している
（n ＝membrane
6）。
determined
by by
anti-MHC-II-FITC, and the level of purification was veriminedwas
by anti-CD86-FITC,
and
the
level
of
purification
was
verified
mined by ＊：陰性対照群と比較して統計学的有意差があることを示している（
anti-CD40-FITC, and the level of purification
verified by
p ＜ 0.05）
。形質転換を行っていない
E. coli BL21（DE3）株の精製標品を陰
lence
factor
associated with enhanced
IL-8 secretion.
fied plots
by anti-CD11c-PE.
(A) Representative flow cytometry dot plots
(A) Representative flow cytometry dot
showing
anti-CD11c-PE.
(A) Representative flow cytometryanti-CD11c-PE.
dot plots showing
性対照群とした。
It results in increased
incidence
of
inflammation
in
showing the
level
the level of CD86
expression on the double-positive-stained
cells
in of MHC-II expression on the double-positive-stained
the level of CD40 expression on the double-positive-stained
cells in
vivo,
which
has
been
connected
to
peptic
ulcer,
gascells as
in the
upper
the upper
right. of(B) The results were expressed
mean
of right. (B) The results were expressed as mean of
the upper right. (B) The results were expressed
as mean
tric significant
cancer, differences
and increased
neutrophil
infiltration
n in
= 6the
SD,
and statistically
significant[30].
differences with the negative
n =with
6 the
SD, negative
and statistically
negative
n = 6 SD, and statistically significant differences
are indicated
*(p <of.05).
Protein
Recent
have control
demonstrated
OipA
in purification method was
control are
indicated
< .05). studies
Protein purification
method
was theasrole
control are indicated as *(p < .05). Protein purification
method
was as *(p
performed
on
untransformed
Escherichia
coli BL21 (DE3), and purified
performed
onpurified
untransformed
coli BL21
and purified
theEscherichia
induction
of (DE3),
mucosal
cytokines
such
as IL-1,
performed on untransformed Escherichia coli BL21
(DE3), and
materials were used as negative control.
materials were used as negative
materials were used as negative control.
IL-17,control.
and TNF-a [31].
In the present study, we reported, for the first time,
the effect of OipA on maturation markers and cytokine
concentrations
resulted
in decreased
Secretion of IL-10 and IL-12 was assessed
by theof OipA
secretion
patterns
of murine IL-10
DCs. The obtained results
secretion
by
DCs.
Indeed
by
increasing
OipA concenELISA. Overnight treatment of DCs with different
showed that OipA significantly
inhibits the expression
Secretion of IL-10 and IL-12 by OipA-treated DCs
33
determined by anti-MHC-II-FITC, and the level of purification was verified by anti-CD11c-PE. (A) Representative flow cytometry dot plots
showing the level of MHC-II expression on the double-positive-stained
cells in the upper right. (B) The results were expressed as mean of
n = 6 SD, and statistically significant differences with the negative
control are indicated as *(p < .05). Protein purification method was
performed on untransformed Escherichia coli BL21 (DE3), and purified
materials were used as negative control.
OipA と共培養した DCs の IL-10 および IL-12 産
生量
5 µg/mL、10 µg/mL および 0 µg/mL の OipA と
共培養後の DC における IL-10 産生量は陰性対照
群と比較して有意に減少していた（図2、p ＜0.05）
。
一方、IL-12 では有意差はなかった。
考　察
本論文は OipA のマウス DC に対する、サイトカ
イン産生誘導と DC の成熟に関する初めての報告で
ある。OipA と共培養後の DC の成熟度表面マーカー
を解析したところ、MHC-II と補助刺激分子である
CD86 および CD40 の発現量が低下しており、
IL-10 の産生量が低下していた。このことから、
OipA はナイーブ T 細胞を制御性 T 細胞へと分化さ
せる tolerogenic DC へと誘導する可能性が示唆さ
れた。また、他の報告から OipA は Toll 様受容体 2
を介して DC の成熟を抑制していることが考えられ
Figure
Effect ofDC
OipA
IL-10産生に対する
secretion by OipA
splenicの影響
dendritic cells
図 2．9脾臓由来
の on
IL-10
(DCs). DCs were purified (>90%) from spleen of C57BL/6 mice and
DC は 90% 以上の純度で近交系 C57/BL6 マウス脾臓から分離した。
cultured
overnight in the
presence
of various concentration of OipA
そして、様々な濃度の
OipA（1
～ 20 µg/mL）とオーバーナイトで共
(1–20
lg/mL). Concentrations
IL-10 ELISA
in the
supernatants were
培養を行った。培養上清の
IL-10of濃度は
で測定した。グラフは
determined
by
ELISA,
and
the
results
are
expressed
as mean of
平均値±標準偏差を表している（n ＝ 3）。
n＊：陰性対照群と比較して統計学的有意差があることを示している
= 3 SD, and statistically significant differences with the negative
control
are 。形質転換を行っていない
indicated as *(p < .05). Protein
method was
p ＜ 0.05）
E. coli purification
BL21（DE3）株の精製
（
performed
on untransformed Escherichia coli BL21 (DE3), and purified
標品を陰性対照群とした。
materials were used as negative control.
る。
以上により、抗原提示細胞の 1 つである DC の成
熟が OipA により抑制されることが明らかとなった。
本論文は Outer inflammatory protein A（OipA）
いると考えられる。
まだまだ仮説の段階であると思われる。また、本論文
の樹状細胞（DC）への影響に関する初めての報告であ
の結果では Th1 細胞を誘導するインターロイキン -12
る。OipA と共培養後の DC の解析結果から OipA が
の産生量には影響がなかったことから、tolrogenic
tolerogenic DC を誘導する可能性を示唆し、さらに、
DC であるかどうかについては検討の余地が残る。今
他の論文の報告から OipA が Helicobacter pylori
後更なる OipA の自然免疫への影響に関する報告が望
（H. pylori ）感染の慢性化の要因となることを考察して
いる。しかし、あくまで他の論文の結果からの考察で
34
このことは、H. pylori 感染の慢性化の要因となって
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 19: 136–143
まれる。
levels of m
including C
MHC-II mo
We also sho
by DCs alth
by these ce
Followin
increasing
costimulato
CD86; the
T cells.
pro-inflamm
IFN-b [32,3
particularly
maturation
ing chronic
phenotype
cules and a
ogenic DCs
cells [36,37
pared with
lower exp
enhanced e
IL-10, and
IL-23 [38,3
notypic ana
to be in goo
DCs. Howe
show a sim
is a DC su
genic DC, a

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