Title Journal URL (1)学長奨励研究助成成果報告 歯科学報, 115(1): 1-7 http://hdl.handle.net/10130/3555 Right Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/ １ 平成２５年度 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ 研究成果報告 ⑴学長奨励研究助成成果報告 ① スタチン系薬剤の局所的投与は老人性骨粗 にすることを目的とした。 ２．材料および方法 鬆症の骨質改善に有効か？ 本 実 験 で は，正 常 加 齢 モ デ ル マ ウ ス と し て 口腔インプラント学講座 佐々木穂高 Senescence-accelerated mouse resistant；SAMR １，老人性骨粗鬆症モデルとして老化促進モデルマ ウ ス で あ る Senescence-accelerated mouse prone １．研究背景 加齢に伴う骨代謝障害によって生じる骨粗鬆症 ６；SAMP６を用いた。全身麻酔下にて，２５週齢， は，インプラント治療のリスクファクターであるこ 雄性の各モデルマウスの大腿骨に直径１mm の骨欠 とが知られている。骨粗鬆症は，閉経によるエスト 損を形成し，実験群には骨欠損に対してフルバスタ ロゲン分泌低下に伴う高代謝回転型骨粗鬆症（閉経 チン（Toronto Research Chemicals 社） 含有ゼラチ 後骨粗鬆症） と，骨代謝機能の低下によって生じる ン キ ャ リ ア（１２５μM 含 有＝F１２５，２５０μM＝F２５０， 低代謝回転型骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症） に分類され ５００μM＝F５００） を 填 塞 し，対 照 群 は 骨 欠 損 の み る。老人性骨粗鬆症は，骨髄細胞から骨芽細胞への （Cont） と し た。２種 の モ デ ル マ ウ ス，実 験 群３ 分化能が低下していることが報告されており，また 種，対 照 群１種 の 計４種 の 条 件 に 対 し て 術 後 女性のみならず男性にも生じることから，安全かつ ０，１，２，３，４週例に対して，放射線学的，組 確実なインプラント治療を確立していくのに重要な 織形態学的，分子生物学的に評価を行った。 課題となっている。 放射線学的評価では，同一個体を経時的に撮影， 高脂血症治療薬の HMG-CoA 還元酵素阻害薬で 比較検討を可能する動物実験用マイク ロ CT （R_ あるスタチン系薬剤は，骨形成タンパク（BMP２） MCT，リガク社） を用いて，術後０日例を基準とし を発現させ，骨芽細胞の分化促進や骨粗鬆症患者の た各週例の新生骨の差分量を三次元骨量構造計測ソ 全身的な骨量の増加に効果があることが示唆されて フト（TRI／３D-BON，ラットック社）にて計測し， １） いる 。また in vivo 研究においてスタチン系薬剤 多重比較検定（Bonferroni 法） にて比較検討を行っ の局所的投与による骨治癒の促進の効果について報 た。組織形態学的評価では，各週例毎に屠殺，大腿 ２） 告がされている 。しかしながら，スタチン系薬剤 骨を摘出し，通法に従ってパラフィン包埋後に薄切 が老人性骨粗鬆症の骨治癒過程に対して，どのよう 標本を作成し，ヘマトキシリンーエオジン染色後に な影響があるのかは知られていない。 光学顕微鏡にて観察を行った。分子生物学的評価で そこで我々は，老人性骨粗鬆症患者に対するイン は，術後１週例の組織標本に対し DAB 染色による プラント治療において，顎骨のインプラント埋入部 免疫組織化学染色法にて BMP２の発現ならびに局 や骨造成部に対してスタチン系薬剤を局所的に投与 在性の検討を行った（Fig． １） 。本実験は，東京歯科 し，機能低下を伴った骨髄細胞の分化を促進させる 大学動物実験倫理委員会の承認を得て実施した（承 ことで，より成功率の高いインプラント治療法が確 認番号：２４３００６） 。 立出来ると考えた。本研究では，老人性骨粗鬆症モ ３．結 果 デルマウスである SAMP６を用いて，大腿骨の骨 放射線学的評価として骨欠損部のマイクロ CT 像 欠損部に対してスタチン系薬剤の局所的投与よる骨 では，SAMR１の術後２，３週例では Cont と比較 形成への影響を比較・検討していくことで，老人性 して F１２５，F２５０では皮質骨の連続性と海綿骨領域 骨粗鬆症に対するスタチン系薬剤の有用性を明らか の新生骨形成を示す不透過像が観察された。一方， ― 1 ― ２ 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ SAMP６の 術 後２，３週 例 で Cont と 比 較 し て F と比較して F１２５，F２５０では新生骨量が有意に多い １２５，F２５０において海綿骨領域の新生骨形成，皮質 傾向を示した（P＜０． ０１） 。一方，F５００は F１２５， F２５０ 骨の連続性は３週例以降で認められた。術後０日例 より低い傾向を示し，Cont と有意 な 差 を 認 め な を基準とした各週齢の新生骨の差分量の比較検討で かった。また，SAMR１では F１２５と比較して F２５０ は，SAMR１，SAMP６ともに２，３週例では Cont の新生骨量が有意に高いにの対して，SAMP６では Fig.１ Fig.２ 実験の流れ 新生骨量の差分計測 ― 2 ― 歯科学報 Vol．１１５，No．１（２０１５） F２５０の 方 が F１２５よ り 有 意 に 高 い 傾 向 を 示 し た ３ ないことが知られている。フルバスタチンの局所投 与においても至適濃度が存在し，SAMR１と SAMP （Fig． ２） 。 組織形態学的評価として SAMR１では，F２５０は ６では異なる可能性が示唆された。 ２週例，F１２５は３週例で骨欠損部の皮質骨の連続 本研究より，フルバスタチンの局所投与は一定の 性が形成され，４週例では皮質骨の緻密化がみられ 濃度（１２５μM，２５０μM） において，老人性骨粗鬆症 たのに対して，Cont，F５００では４週例においても モデルマウス（SAMP６） の大腿骨骨欠損に対し治癒 皮質骨は梁状を呈していた。SAMP６では，Cont を促進することが明らかとなった。 と比較して F１２５，F２５０では２週例で梁状の新生骨 ５．謝 辞 形成が認められるものの，３週例でも皮質骨の形成 本研究は，東京歯科大学学長奨励助成を受けたも が認められなかった。また，F５００は４週例での皮 のです。本研究に際して様々なご指導を頂きました 質骨の連続性形成がみられなかった。 本学口腔科学研究センター兼歯科理工学講座教授の 分 子 生 物 学 的 評 価 と し て 術 後１週 例 に お け る 吉成正雄先生，口腔インプラント学講座教授の矢島 BMP２の免疫組織化学染色では，Cont と比較して 安朝先生に深謝致します。また，研究分担者として F１２５，F２５０では骨断端部の骨膜と骨欠損部の海綿 協力を頂きました口腔科学研究センター兼薬理学講 骨領域内に強い陽性像を認められた。 座助教の田辺耕士先生，実験の主な実施・解析を ４．考 担ってくれた口腔インプラント学講座大学院生の大 察 正常加齢モデルマウス；SAMR１，老人性骨粗鬆 平貴士先生に感謝致します。 症モデルマウス；SAMP６の両方において，Cont と比較して F１２５，F２５０では新生骨の形成量が有意 文 献 に多く，欠損部皮質骨の緻密化がみられた。また， １）Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen F１２５，F２５０では骨形成タンパクである BMP２の発 D, Rossini G, Boyce B, Zhao M, Gutierrez G : 現増加が認められた。従来の報告から，スタチン系 Stimulation of bone formation in vitro and in ro- 薬剤は骨芽細胞に対し BMP-２を発現誘導し，分化 dents by statins. Science，２８６ （５４４６） ：１９４６− １， ３） 促進する事が知られている 。また，SAMP６では 骨髄間質細胞の異常により骨形成能の低下を示すこ ４） １９４９，１９９９． ２）Tanabe K, Nomoto H, Okumori N, Miura T, とが知られているが ，一方で骨膜細胞では SAMR Yoshinari M : Osteogenic effect of fluvastatin １と同等のアルカリフォスファターゼ活性や石灰化 combined with biodegradable gelatin-hydrogel. ５） 能を有していることが報告されている 。免疫組織 Dent Mater J，３１⑶：４８９−４９３，２０１２． 化学染色の結果より BMP２の発現が骨断端部の骨 ３）Yamashita M, Otsuka F, Mukai T, Otani H, 膜に強い陽性反応がみられたことから，フルバスタ Inagaki K, Miyoshi T, Goto J, Yamamura M, チンの局所投与が骨膜細胞を分化させ，SAMP６に Makino H : Simvastatin antagonizes tumor ne- おいても新生骨の形成や皮質骨の緻密化を促進させ crosis factor-alpha inhibition of bone morphoge- たことが示唆された。 netic proteins-２-induced osteoblast differentia- フルバスタチン投与群のうち F５００は SAMR１， tion by regulating Smad signaling and Ras/Rho- SAMP６ともに骨治癒の促進がみられなかった。ま mitogen-activated protein kinase pathway. J En- た，術 後２，３週 例 に お い て SAMR１は F２５０， docrinol，１９６⑶：６０１−６１３，２００８． SAMP６は F１２５が多く新生骨量を形成する傾向が ４）Yoshida A, Sasaki H, Furuya Y, Yoshinari M, みられた。従来の研究から，培養骨芽細胞に対する Yajima Y : Effect of low-intensity pulsed ultra- スタチン系薬剤は高濃度よりも低濃度で分化が促進 sound on bone-healing process in murine low- ６） したことや ，スタチン系薬剤の経口投与により大 turnover osteoporosis model. J Hard Tissue Biol, 腿骨骨密度は高濃度で増加し低濃度では低下するこ ２２：３０１−３１０，２０１３． ７） とが報告されており ，その効果は濃度依存的では ― 3 ― ５）Egermann M, Heil P, Tami A, Ito K, Janicki P, ４ 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ Von Rechenberg B, Hofstetter W, Richards PJ : カルシウムシグナルを調節する膜タンパク質であ Influence of defective bone marrow osteogenesis る。今回，骨芽細胞において，アドレノメデュリン on fracture repair in an experimental model of やカルシトニン遺伝子関連ペプチドが VDCCs の働 senile osteoporosis. J Orthop Res，２８⑹：７９８− きを促進することが明らかになったので報告する。 ８０４，２０１０． 緒 言 ６）Maeda T, Matsunuma A, Kawane T, Horiuchi 骨のリモデリングは，骨芽細胞による骨形成と， N : Simvastatin promotes osteoblast differentia- 破骨細胞による骨吸収のバランスによって行われて tion and mineralization in MC3T3-E1 cells. Bio- いる。さらに，このリモデリングがホルモンによっ chem Biophys Res Commun，２８０⑶：８７４−８７７， て調節されている。甲状腺の傍濾胞細胞から分泌さ ２００１． れるカルシトニン（以下，CT） によって骨形成が促 ７）Maritz FJ, Conradie MM, Hulley PA, Gopal R, Hough S : Effect of statins on bone mineral den- 進され，副甲状腺から分泌されるパラトルモンに よって骨吸収が促進される１）。 sity and bone histomorphometry in rodents. Ar- 電位依存性カルシウムチャネル（以下，VDCCs） terioscler Thromb Vasc Biol，２１⑽：１６３６−１６４１, は，形質膜の脱分極を感知して活性化開口し，細胞 ２００１． 外から細胞内へカルシウムイオンを選択的に透過さ せるイオンチャネルであり，細胞の電気的興奮をカ ルシウムイオン依存的な生理応答に変換する役割を 担う２）。このチャネルは，細胞内へのカルシウムイ ② 白板症の癌化能を予測するための総合診断 システムの構築 オンの流入だけでなく，遺伝子発現の促進，細胞の How to predict malignant risk for low- 分化・増殖，細胞の生存など，多くの細胞機能を調 grade oral epithelial dysplasia 節することで知られている３−６）。そのために当講座 の研究のメインテーマとなっている。 口腔外科学講座 当講座において，骨芽細胞の VDCCs の生理作用 野村武史 の詳細が明らかにされている７）。開口する電位によ −本研究の概要は，歯科学報第１１４巻第６号（２０１４） に二次出版で掲載済み− り VDCC は，高 電 位（∼−２０mV） で活性化する L 型（Cav１） お よ び 非 L 型（Cav２） と 低 電 位（∼−６０ mV） で活性する T 型（Cav３） に大別される。 また，活性型ビタミン D３も骨形成を促進するホ ③ 骨芽細胞におけるカルシトニンファミリー ルモンとして知られている。我々は以前，活性型ビ タミン D３が骨芽細胞の VDCCs を促進し，骨芽細 のカルシウム調節機構の解析 胞内にカルシウム流入を促進することにより骨形成 生理学講座 遠藤隆行 を促進する，ということを明らかにした８）。その他 のホルモンの骨のリモデリング調節についての研究 抄 を当講座で解明を進めている。 録 カルシトニンは骨形成ホルモンとして知られてい CT の働きは，破骨細胞の CT 受容体に結合し， るが，骨芽細胞にその受容体は無く，破骨細胞のカ この細胞の骨吸収作用を抑制することにより，骨形 ルシトニン受容体を介して破骨細胞の働きを抑制す 成を促進する，と考えられていた。事実，学生講義 ることにより，骨形成に関与すると知られている。 でもそのように教え，CT の受容体は骨芽細胞には カルシトニンにはサブファミリーが存在し，それに 存在しないというのが今までの一般的な見解であっ はアドレノメデュリンやカルシトニン遺伝子関連ペ た。 プチドが含まれる。電位依存性カルシウムチャネル CT に構造の似たペプチドが発見され，CT ファ （VDCCs） は細胞内カルシウムイオンの濃度および ミリーと名付けられた。この中には，アドレノメ ― 4 ― 歯科学報 Vol．１１５，No．１（２０１５） ５ デュリン（ADM） やカルシトニン遺伝子関連ペプチ MC３T３-E１細胞にパッチクランプ法を適用す ド（CGRP） が含まれる９，１０）。骨芽細胞に ADM の受容 る直前に，アデニル酸シクラーゼ阻害薬である１０ 体が存在することが報告されている１１）。 μM の SQ２２５３６により３０分間前処理をして，上記と 様 々 な 細 胞 に お い て，CGRP お よ び ADM が １２−１４） VDCCs を活性化することが報告されている 同様に ADM および CGRP を投与すると，ADM お 。 よび CGRP の L 型 VDCCs 電流促進作用が減少し 当講座からも，脳幹孤束核細胞において CGRP お た。タンパクキナーゼ A 阻害薬である２０μM の PKI よび ADM が VDCCs を活性化することを 報 告 し （５-２４） を７分間，細胞内に投与することによって １５） タンパクキナーゼ A を阻害した細胞に ADM およ た 。しかし，骨芽細胞での働きの報告は無い。 今回の研究の目的は，骨芽細胞に ADM および び CGRP を 投 与 し て も，ADM お よ び CGRP の L CGRP の受容体が存在するか，するとしたら VDCCs 型 VDCCs 電流促進作用が減少した。U-７３１２２がホ の調節を行うかどうか，を調べることである。 スフォリパーゼ C の特異的阻害薬であることが報 研究方法 告されている１７，１８）。アデニル酸シクラーゼと同様 培養骨芽細胞である MC３T３-E１細胞に全細胞 １６） に，ホスフォリパーゼ C 阻害薬である１０μM の U- 膜記録型パッチクランプ法 を適用し，細胞外液を ７３１２２により１５分間前 処 理 を し て，上 記 と 同 様 に テトラエチルアンモニウム溶液で潅流し，細胞内に ADM および CGRP を投与したが，この条件下では セシウムイオンを充填し，全細胞膜記録法パッチク L 型 VDCCs 電流促進作用は減少しなかった。タン ランプ法を適用し，電位固定法で膜電位を−８０mV パクキナーゼ C 阻害薬である１０μM の GF１０９２０３X に固定し，＋１０mV への脱分極刺激を与えることに により３０分間前処理をして，上記と同様に ADM お より，全細胞膜を流れる L 型 VDCCs 電流を記録し よ び CGRP を 投 与 し た が，こ の 条 件 下 で は L 型 た。電位刺激はアクソン社コンピュータソフトウェ VDCCs 電流促進作用は減少しなかった。 ア「pCLAMP ver１０」で 与 え ら れ，ヘ カ・エ レ ク ミトゲン活性化タンパクキナーゼ阻害薬である１０ トロン社増幅器「L/M-EPC７」を介して細胞に与 μM の PD９８， ０５９により２分間前処理をして，上記 えた。イオン電流の解 析 は「pCLAMP ver１０」で と同様に ADM および CGRP を投与したが，この 行った。CGRP および ADM は灌流液を介して投与 条件下では L 型 VDCCs 電流促進作用は減少しな した。GTP 結合タンパク質抗体はガラス管電極を かった。 介して細胞内に投与した。各種セカンドメッセン こ れ ら の 研 究 結 果 か ら，ADM，CGRP の L 型 ジャー阻害薬，カルシウムチャネル阻害薬は細胞外 VDCCs 電流促進作用のセカンドメッセンジャーシ 液に添加することにより投与した。 グナル経路としてアデニル酸シクラーゼ→サイク 結果および考察 リック AMP→タンパクキナーゼ A 経路を介してい ADM および CGRP を骨芽細胞に投与したとこ ることが明らかになった。ADM 受容体からサイク ろ，骨芽細胞上の ADM および CGRP 受容体と結 リック AMP→タンパクキナーゼ A 経路へと至るシ 合し，L 型 VDCCs 電流を促進することが明らかに グナル伝達系は他の細胞でも報告されてい なった。また，細胞内電位を−８０mV に保持し，１０ る９，１９，２０）。以前，我々は顎下神経節細胞において， mV ずつの階段電位を与えていくことにより，電 ADM，CGRP が ア デ ニ ル 酸 シ ク ラ ー ゼ→サ イ ク 流・電圧関係を記録し，ADM および CGRP を投与 リック AMP→タンパクキナーゼ A 経路を介して することにより，この L 型 VDCCs 電流促進作用が VDCCs を活性化することを報告している２１）。 電位依存性を持たないことを明らかにした。 今後は本研究で得られた知見を元に，臨床的に骨 さ ら に，ADM，CGRP 共 に１nM か ら１０μM の 形成を促進する薬剤などの開発などに発展していく 範囲内で濃度依存性の L 型 VDCCs 電流促進作用を ことを望んでいる。 有することが明らかになった。 結 論 続いて，この ADM，CGRP の L 型 VDCCs 電流 骨 芽 細 胞 に お い て，ADM，CGRP が MAP キ 促進作用のセカンドメッセンジャー経路を調べた。 ナーゼを介してアデニル酸シクラーゼ→サイクリッ ― 5 ― ６ 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ク AMP→タンパクキナーゼ A 経路を介して L 型 dullin : A novel hypotensive peptide isolated VDCCs を活性化することが明らかになった。 from human phenochromocytoma. Biochem Bio- 謝 phys Res Commun，１９２：５５３−５６０，１９９３． 辞 稿を終えるにあたり，本研究にご尽力下さいまし １０）Muff R, Born W, Fischer JA : Calcitonin, calci- た東京歯科大学生理学講座の方々に深謝致します。 tonin gene-related peptide, adrenomedullin and amylin : Homologous peptides, separate recep- 文 tors and overlapping biological actions. Eur J 献 Endocrinol，１３３：１７−２０，１９９５． １）Amara SG, Jonas V, Rosenfeld MG, Ong ES, Evans RM : Alternative RNA processing in cal- １１）Naot D, Callon KE, Grey A, Cooper GJ, Reid citonin gene expression generates mRNAs en- IR, Cornish J : A potential role for adrenome- coding different polypeptide products. Nature， dullin as a local regulator of bone growth. Endo- ２９８：２４０−２４４，１９８２． crinology，１４２：１８４９−１８５７，２００１． ２）Miller RJ : Multiple calcium channels and neu- １２）Nakazawa K, Saito H, Matsuki N : Effects of calcitonin gene-related peptide（CGRP）on Ca2+- ronal function. 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