KU812-F

１）研究分野　小児、高齢者、遺伝子疾患等化学物質の感受性が高い集団における安全性２）課題番号 2012 PT3-01 セリンプロテアーゼインヒビター欠損　細胞を用いた化学物質過敏症の高感度　in vitro評価系の開発　副題：呼吸器アレルギー検出のための細胞を用いた in vitro系の検討中村　晃（金沢医科大学医学部免疫学講座）　① 【要　旨】［研究背景および目的］
吸入抗原による呼吸器アレルギー反応には、好塩基球と好酸球が必須
の役割を果たしている。好塩基球や好酸球は、細胞外マトリックスを破壊
するセリンプロテアーゼを分泌し、炎症を引き起こすが、これらの細胞で
の化学物質応答性については報告が殆どないのが現状である。本研究
は、ヒト好塩基球様細胞株KU812-‐Fにおいてセリンプロテアーゼを制御す
るセリンプロテアーゼインヒビターであるSerpin b1のshRNAによる欠損株
を樹立することにより高感度のin vitro評価系の開発を目的とした。
［研究結果］
樹立された恒常的Serpin b1 ノックダウン株（以下KU812F-‐T09)ではトルエ
ンジイソシアネート(TDI)刺激による IL-‐6産生が親株より約2倍となり、これ
まで親株で反応がなかった8種類の化学物質刺激でもIL-‐6産生の亢進が
認められた。またTDIおよびIgE同時刺激によりIL-‐13産生の亢進も認めら
れた。ヒト細胞株においてセリンプロテアーゼインヒビターを欠損させるこ
とにより高感度の評価系のモデル細胞となる可能性が示された。
②
【背景および目的】アレルギー反応は好塩基球、マスト細胞、
好酸球により誘導される。特に呼吸器アレルギーでは好塩基球と好酸球が関与し
ている TSLP
マスト細胞 IL-33
グランザイムB
カテプシン G
好酸球セリンプロテ
アーゼインヒ
ビターこれらの細胞が産生するセリンプロテアーゼはアレルギーの増悪化に関与するキマーゼトリプ
ターゼ IL–13
好塩基球セリンプロテアーゼはセリンプロテアーゼ
インヒビターによって制御される代表的なセリンプロテアーゼインヒビター
であるSLPIを欠損したマウス好塩基球や
好酸球は一部の化学物質に対して高反応性
を示したセリンプロテアーゼインヒビターヒト欠損細
胞株を用いた化学物質過敏症の高感度
in vitro評価系の開発を目的とする ③
【使用化学物質】検　体感作性検　体感作性 C0 塩化ナトリウム（対照） - C12 5-メチル-2,3-ヘキサンジオン Sh C1 塩化ニッケル Sah C13 安息香酸フェニル Sh C2 硫酸ニッケル Sah C14 4-エトキシメチレン-2-フェニル
-2-オキサゾリン-5-オン Sah C3 塩化コバルト Sah C15 トリメリト酸無水物 Sa C4 硫酸ベリリウム Sah C16 トルエン2,4-ジイソシアネート Sah C5 4, 4’–ジフェニルメタンジイソシアネート Sah C17 p-フェニレンジアミン Sh C6 ジニトロベンゼンスルホン酸 Sh C18 テトラメチルチウラムジスルフィド Sh C7 グルタルアルデヒド Sah C19 トリニトロクロロベンゼン Sh C8 ホルムアルデヒド Sh C20 フルオロセインイソチオシアネート Sah C9 塩化ベンゾイル Sh C21 アゾジカルボンアミド Sah C10 1–クロロ-2, 4–ジニトロベンゼン Sh C22 シクロヘキサンジカルボン酸無水物 Sah C11 エチレングリコールメタクリレート Sh C23 メチルシクロヘキサンジカルボン酸
無水物 Sah Sa : 呼吸器感作性、Sh : 皮膚感作性
Sah : 皮膚・呼吸器感作性 ④
対象株：ヒト好塩基球様細胞株KU812-F
ヒト好酸球様細胞株EoL-1
KU812-F:Human basophilc cell line (Kishi K, et al. Leuk. Res. 9: 381-390, 1985)
慢性骨髄性白血病患者より樹立された細胞株
定常状態でIgE受容体を発現している
IL-3 (20ng/ml)添加３日間で好酸球様に分化する
EoL-1: Human eosinophilic cell line (Saito H, et al. Blood 66:1233-1240,1985)
好酸球性白血病患者より樹立された細胞株
n-butylate (histone deacetylases inhibitor) 添加８日間で、
好酸球様細胞株に分化する　⑤
KU812-FおよびEoL-1におけるセリンプロテアーゼインヒビターの
定量的PCR法による発現解析 KU812-F
relative expression 15000
10000
immature
EoL-1
15000
mature
800
immature
800
600
600
400
400
200
200
0
0
mature
10000
5000
5000
0
0
ヒト好塩基球様細胞株KU812-Fのshort hairpin(sh) RNAによるSerpin b1ノックダウン株の樹立 ⑥
ノックダウン株と親株におけるIL-6産生 KU812-F-T09
C1
C2
0.5
0.25
0
0
0.75
*
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
C4
1
1
0.75
0.75
IL-6(ng/mL)
*
0.75
IL-6(ng/mL)
1
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
1
C3
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
*
*
0.5
**
**
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
5 25 125 625 (µg/mL)
0
KU812-F
C2
C1
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
1.0
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
0.5
C4
1.0
1.0
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
1.0
C3
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑦
ノックダウン株と親株におけるIL-6産生 KU812-F-T09
-2, 4–
1
1
0.75
0.75
0.75
0.5
0.25
0
0
IL-6(ng/mL)
1
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
1
**
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
C12
-2,3-
5-
IL-6(ng/mL)
1–
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
C11
C10
C9
*
0.75
*
*
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
5 25 125 625 (µg/mL)
0
KU812-F
1–
C11
-2, 4–
0
5
25 125 625 (µg/mL)
IL-6(ng/mL)
0.5
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
1.0
0.5
0
C12
-2,3-
5-
1.0
1.0
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
1.0
0
C10
IL-6(ng/mL)
C9
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑧
ノックダウン株と親株におけるIL-6産生 KU812-F-T09
C14
0.75
0.75
**
0.5
0.25
0
0
5 25 125 625 (µg/mL)
1
**
0.5
0.25
0
0
0.75
*
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
**
1
IL-6(ng/mL)
1
C16
C15
IL-6(ng/mL)
1
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
C13
0.75
*
*
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
*
0
5 25 125 625 (µg/mL)
KU812-F
C14
C13
1.0
C16
C15
**
1.0
1.0
**
1.0
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
IL-6(ng/mL)
0.5
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
**
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑨
ノックダウン株と親株におけるIL-6産生 KU812-F-T09
C19
C18
C17
C20
0.75
0.75
5 25 125 625 (µg/mL)
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
*
0.5
0.25
0
0
**
0.5
0.25
0
1
**
**
IL-6(ng/mL)
1
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
1
0.75
1
IL-6(ng/mL)
p-
*
0.5
0.25
0
0.75
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
5 25 125 625 (µg/mL)
0
KU812-F
C17
p-
0
5
25 125 625 (µg/mL)
1.0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
**
1.0
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
**
0.5
0
**
1.5
1.0
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
0.5
C20
C19
**
**
1.0
0
C18
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
0.5
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑩
ノックダウン株と親株におけるIL-6産生 KU812-F-T09
C22
C21
**
0.5
0.25
0
0
1
1
0.75
0.75
IL-6(ng/mL)
0.75
IL-6(ng/mL)
IL-6(ng/mL)
1
C23
*
0.5
0.25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
0
0.5
0.25
0
5 25 125 625(µg/mL)
0
5 25 125 625 (µg/mL)
KU812-F
C22
C21
50
25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
IL-13 (pg/mL)
75
0
100
100
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
C23
75
5 25 125 625 (µg/mL)
0
50
25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
⑪
ノックダウン株と親株におけるIL-13産生 KU812-F-T09
C5
C6
C7
4, 4’–
100
50
25
0
0
5 25 125 625 (µg/mL)
75
5 25 125 625 (µg/mL)
0
75
50
25
0
0
**
100
IL-13 (pg/mL)
75
100
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
C8
50
25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
5 25 125 625 (µg/mL)
KU812-F
C6
C5
100
75
50
25
0
5
25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
C8
100
100
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
0
C7
0
5
25 125 625 (µg/mL)
IL-13 (pg/mL)
4, 4’–
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑫
ノックダウン株と親株におけるIL-13産生 KU812-F-T09
C14
C13
25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
75
5 25 125 625 (µg/mL)
0
75
50
25
0
0
**
100
IL-13 (pg/mL)
50
IL-13 (pg/mL)
75
0
100
100
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
C16
C15
50
25
0
5 25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0 5 25 125 625 (µg/mL)
KU812-F
C14
150
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
100
50
0
100
**
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
0
5
C16
C15
25 125 625 (µg/mL)
100
IL-13 (pg/mL)
C13
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑬
ノックダウン株と親株におけるIL-13産生 KU812-F-T09
C18
C17
C20
C19
p-
25
5 25 125 625 (µg/mL)
0
75
50
25
0
0
5 25 125 625 (µg/mL)
100
IL-13 (pg/mL)
50
IL-13 (pg/mL)
75
0
100
100
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
100
75
50
25
0
0 5 25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
5 25 125 625 (µg/mL)
KU812-F
100
50
0
100
0
5
25 125 625 (µg/mL)
100
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
100
IL-13 (pg/mL)
*
IL-13 (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
*
IL-13 (pg/mL)
p150
C20
C19
C18
C17
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
75
50
25
0
0
5
25 125 625 (µg/mL)
⑭
ノックダウン株でのTDI単独・IgE同時刺激によるIL-6・13産生 IgE(-)
**
1.00
**
0.50
**
**
**
IgE(-)
250
IL-13(pg/mL)
IL-6(ng/mL)
1.50
200
150
*
100
50
0
0.00
WT
Scramble
T11
WT
T09
Scramble
IgE(+)
**
**
0.50##
0.00##
**
**
**
**
WT
Scramble
T11
T09
IL-13(pg/mL)
IL-6(ng/mL)
**
1.00##
T09
IgE(+)
250"
1.50##
T11
200"
*
150"
**
PBS
*
100"
TDI (125µg)
50"
TDI (625µg)
0"
WT
Scramble
T11
T09
⑮
【結　果】１）ノックダウン株において親株と比べて顕著にIL-6産生が亢進していた化学物質
トルエンジイソシアネート
２）ノックダウン株のみでIL-6産生が亢進していた化学物質（低濃度のみ）
塩化ニッケル・硫酸ニッケル・ホルムアルデヒド
エチレングリコールメタクリレート・5-メチル2,3ヘキサンジオン
エトキシメチレンフェニルオキサゾリンオン
テトラメチルチラウムジスルフィド・アゾジカルボンアミド
シクロへキサンジカルボン酸無水物
３）ノックダウン株のみでIL-13産生が亢進していた化学物質
低濃度のみ：ホルムアルデヒド
高濃度のみ：トルエンジイソシアネート
４）ノックダウン株・親株ともにIL-6産生が亢進していた化学物質
トリニトロクロロベンゼン
５）親株においてノックダウン株よりIL-6産生が亢進していた化学物質
p-‐フェニレンジアミン６）親株のみでサイトカイン産生が亢進していた化学物質
IL-6 ：ジニトロベンゼンスルホン酸・グルタルアルデヒド
IL-13：エトキシメチレンフェニルオキサゾリンオン・p-‐フェニレンジアミン ⑯ 【今後の展開】ヒト好塩基球細胞株KU812-Fおよびヒト好酸球細胞株EoL-1
でのshRNAを用いたノックダウンによるセリンプロテアーゼ
インヒビター欠損株の作製
化学物質
KU812-F EoL-1 shRNA セリンプロテアーゼイン
ヒビター欠損細胞
IgE, LPSなど
＋
化学物質
サイトカイン
測定
サイトカイン
測定
⑰

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