2016 / March No. 34 Science, Products, and Information サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフサイエンス情報誌 NEXT Interview からだ 本 来 の 修 復 能 力 を 引 き 出 す 、 新たな再 生 医 療 へ 傷 害 個 所 を 見 つ け て 治 す「 M u s e 細 胞 」を 徹 底 活 用 出澤真理 氏（東北大学大学院医学 系 研 究 科 教 授 ） P. 04 GeneArt Lentiviral CRISPR Human Kinase Library P. 05 CRISPR gRNA 構築サービス P. 06 CellInsight CX7 High-Content Platform P. 07 P. 09 Countess Ⅱ FL 自動細胞カウンター Gibco Expiシリーズ（ 3 製品） P. 13 Minor Variant Finder ソフトウェア SuperScript IV Reverse Transcriptase P. 14 Anza Restriction Enzyme Cloning System P. 12 P. 16 NanoDrop 超微量分光光度計 Qubit 3.0 Fluorometer P. 18 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer Interview からだ 本 来 の 修 復 能 力 を 引 き 出 す、 新たな再 生 医 療 へ 傷 害 個 所 を 見 つ け て 治 す「 M use 細 胞 」を 徹 底 活 用 出 澤 真 理 氏 （東北大学大学院医学系研究科教授） 私たちの体は日々傷つき、修復を繰り返しています。 当たり前の様に思っていますが、その仕組みは意外なほどわかっていません。 2010 年、東北大学の出澤真理氏は、成人ヒトの間葉系組織に多様な細胞に分化する能力を有する と名付けました。 新たなタイプの多能性幹細胞を発見、 「 Muse 細胞」 「この細胞は、私たちの体に常に存在し、血液にのって全身を巡り、 傷付いた臓器を見つければ修復します」 と出澤氏は語ります。 Muse 細胞を要に、からだ本来の修復能力を引き出す再生医療への力強い道のりを伺いました。 page 02 インタビュアー： サーモフィッシャーサイエンティフィック 橋本裕子 常識はずれの柔軟な細胞の発見 「セレンディ Muse 細胞との出会いはまさくしく ピティ」。神経再生研究の突破口を求め、神経 系以外の細胞へ研究対象を広げるうち、出澤 氏の目に留まったのは 「間葉系幹細胞」。骨髄 の間葉系幹細胞から骨や軟骨、脂肪細胞が生 まれたという報告や、女性に男性の骨髄を移 植すると、移植先以外でもあちこちの組織で男 性の遺伝子型をもつ細胞が現れたという現象 が 90 年代に報告され、まわりの組織に合わせ て柔軟に分化する細胞があるのでは、 と直感し たと振り返ります。 実際に骨髄の間葉系幹細胞を血清入りの単純 な培地で培養すると、頻度は低いけれど ES 細 胞の胚葉体のような細胞塊が形成されること に気づきました。毛や色素細胞のようなものが 混在する細胞塊で、これを観た時に元から多 能性をもつ細胞が骨髄に存在するのではと感 じ、あらゆる手で単離を試みますが、なかなかう まくいきません。しかし、女神は微笑みます。消 化酵素の中に一晩うっかり放置した間葉系幹 細胞から、多能性を持つ細胞が 生き残ったの です。これがストレス耐性を持つ多能性幹細胞、 Muse（ Multilineage-differentiating Stress Enduring）細胞でした。 出澤氏は、脳梗塞を起こしたラットの脳にヒト われた機能を取り戻す方向に進むべきかもし 皮膚由来の Muse 細胞を移植しました。すると れません。そのほうが自然の理に適った医療 麻痺で平行棒が渡れなかったラットが、移植後 と言えるのではないでしょうか」。 2 か月半で統制のとれた行動を始め、3ヶ月で 現 在 、企 業と共 同で、心 筋 梗 塞などを含めた はスムーズに渡れるようになったそうです。し いくつかの疾患を対象とした治験の準備を進 かも移植した細胞は、失われた大脳運動野の 神経に分化し、周りの神経と同じように、長い 軸索を反対側の脊髄へと伸ばし、頭蓋を出て 脊髄にある運動ニューロンとシナプスを作り、 錐体路という複雑な回路網を再建しているこ とも確認。大脳感覚野の失われた神経にも置 き換わり、四肢から上行してきたニューロンか ら知覚シグナルを受けて活動電位を出しまし た。複雑な神経回路網が再建されたのです。 えます。 新発見を生む土壌を耕す 「権威者の言うことを鵜呑みにするな、何事も 既成概念に囚われてはいけない」 。出澤氏は研 ま投与しただけで、移植前に誘導などの人為 的な操作を加えていないということ。 「 Muse 細胞には特殊な免疫抑制能力があり、移植時 に起こる免疫拒絶を免れることができます」 と 出澤氏は説明します。他家移植ができれば、大 きなメリットとなります。あらかじめ準備した修 復能力の高い細胞を誰にでも使えれば、大量 生産でコストを減らせるうえ、緊急性を要する 心筋梗塞などの様々な疾患にも対応できるか らです。 究室で学生にこうアドバイスします。 「科学の 進歩は、日進月歩。学んだ事から外れた現象に 直面したら、どうするか ? そんな時は、自分が 見ている現象を信じるべきです。これまでの科 学の常識や原理を疑い、それらが自然現象の すべてを包括していなかったと気付くチャンス だから。そこからより広い自然現象を説明でき る上位の原理が 見つかるかもしれません。自 説や仮説に合わせてデータを無理に曲げて解 釈する必要はありません。議論を尽くしても答 えが出ないなら、そのまましばらく放置すれば す。 「 幹 細 胞 医 療 の 課 題は『 腫 瘍 化 』。しかし Muse 細胞は生体内に普通に存在する細胞な ので『 腫瘍性 』を持ちません。もし危険な細胞 ヒトES 細胞の胚様体 ならば 、骨髄にも含まれていたので、60 年 以 傷を治す天然の多能性幹細胞 た移 植 前に目 的とする細 胞に人 為 的に分 化 良いんです。実験を積み重ねていると、いつか、 ああ、こういう事だったんだ、と一本の筋が通 る時がくるものです」 と続けます。 「そのまま放置した」実験データの山を、頭の 片隅にどれだけ持ち続けていられるか。その 継続と好奇心が 、これまでの常識を覆す発見 を生む土壌となるのかもしれません。 上 続く骨 髄 移 植も成り立たなかったはず 。ま させる必要がありません。これらのことは安全 「 M u s e 細 胞は、骨 髄 、脂 肪 組 織 、皮 膚 、そし 性において大きな意味があります」 と出澤氏。 て臍帯や胎盤などあらゆる臓器にあり、骨髄 さらに実 現 性が 高いことも指 摘します。骨 髄 では数千細胞に 1 つの割合で含まれています。 液や臍帯血、美容外科で得られる吸引脂肪な 骨 髄から血 中に入り、常に全 身をまわってい どから Muse 細胞を選び 出し、静脈に点滴す ます。傷害を受けた細胞が出す SOSシグナル るだけで再生医療が可能と考えられるからで を受け取ると、傷害部位に生着し、まわりの細 す。移植部位に細胞を投与するための大がか 胞、つまり 『場』に応じて分化し、失われた細胞 りな外科手術は不要で、将来的には一般病院 に置き換わります。そうやって生体における再 でも再生医療ができるようになる可能性があ 出澤氏は語ります。 理解にも展開できる可能性があり、応用先は いくらでも広がります」 とさらなる展開を見据 の細胞だったこと、そして Muse 細胞はそのま 安 全 性と実 現 性は再 生 医 療において重 要で 生的組織恒常性が 維持されているのです」 と 常による病 気が 見つかるなどの疾 患 概 念の さらに注目すべきは、ラットを救ったのが「ヒト」 安全で身近な再生医療を目指して Muse 細胞由来のクラスター めています。実施は、数年以内の予定。 「細胞 を再生医療に利用するほかに、修復機構の異 ると話します。 「 体 全 体は絶 妙なバランスで調 和をとってい しかし、脳梗塞のような大規模な傷害が 一気 ます。30 年、50 年、もっと先の医療は、もしか に起こると、置き換わりが間に合いません。そ すると人間の手で操作した細胞で一時的に傷 こで、体外から補おうというのが、Muse 細胞 をふさぐ『 絆 創 膏 医 療 』でなく、ヒトが 本 来も を使う再生医療の構想です。 つ修復機構を解明し、その能力を引き出し、失 page 03 出澤真理 （でざわ まり） 1989 年、千葉大学医学部卒業。95 年、千 葉大学大学院医学研究科で医学博士を 取得後、同大医学部の助手に着任。2000 年に横浜市立大学医学部講師、03 年に京 都大学大学院医学研究科助教授を経て、 08 年より現職。日本再生医療学会 理事・ 監事などを務める。 GeneArt Lentiviral CRISPR Human Kinase Library スクリーニングを加速させるゲノム編集ツール、登場 ! NEW! POINT レンチウイルスのコンストラクト Invitrogen™ GeneArt™ Lentiviral CRISPR Human Kinase Library は、新しくラインナップされた CRISPR で pLenti-Cas9-P2A-Bsd 行うゲノム編集のレンチウイルスフォーマットの製品です。高 psi いノックアウト効率でのスクリーニング 、遺伝子導入が 難し PRE cPPT い細胞でのゲノム編集を実現します。まずは 678 種類のヒト キナーゼシリーズを提供。研究用途に合わせて、アレイフォー マット、プールフォーマットを選択できます。 P2A EFS Cas9 WPRE Bsd LTR LTR ヒトコドンに最適化された S , pyogenes Cas9タンパク質を発現 Blasticidin 耐性遺伝子とCas9は、自己切断 2A ペプチドを介して接続。 ● 幅広い細胞に導入可能： レンチウイルスを使うので、分化 した神経細胞や初代培養細胞にも感染可能 pLentiCRISPR-EFS-Puro ● 簡単操作： レンチウイルスに Cas9 や、各キナーゼに対す るガイドRNA 遺伝子をパッケージング済み psi cPPT PRE ● 効率的： 96 ウェルのアレイフォーマットを使えば、時間の U6 かかるシーケンシングとsgRNA 同定ステップを省略可能 ● 特異的： 薬剤耐性遺伝子を共導入するので、目的細胞を sgRNA Scaffold Pol lll term LTR 簡単にセレクションできます。 WPRE FES Puro LTR Unique sgRNA U6プロモーターと特異的 sgRNAを接続 EF-1aプロモーターとPuromycin 耐性を接続 レンチウイルスを用いたワークフロー 使用する細胞にCas9 レンチウイルスを感染させてBlasticidinでセレクション後、均一に撒き直し、各キナーゼに対するsgRNAのCRISPRウイルスを 感染させれば準備完了。各種スクリーニングをフローサイトメーターやハイスループットの細胞イメージング装置 ※等で行い、表現型等を評価できます。 ※例えば、6 ページのCellInsjghtシリーズを使えば、マルチウェルプレートの細胞イメージングを迅速に行い、定量化できます。 Cas9 発現細胞株 形質導入 変異細胞 スクリーニング 標的細胞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H gRNA レンチウイルス A B C D E F G H gRNA レンチウイルス ● 表現型での評価 ライブラリー ● ハイスループットレポーターアッセイなど 製品フォーマット アレイフォーマット □ ウェルごとにgRNAの調製が可能 （ 1 遺伝子／ 1ウェル） □ 時間のかかる確認ステップを省略 □ あるレベルの自動化が必要 プールフォーマット 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H □ 特殊なインフラストラクチャー不要 □ アレイフォーマットよりも経済的 4 gRNA/gene タイター ＞10 6 TU/mL 10 gRNAs/gene 各ウェル：200 µL タイター：10 8 TU/mL 製品名 サイズ 製品番号 GeneArt Arrayed Lentiviral CRISPR Human Kinase Library - - お問い合わせ GeneArt Pooled Lentiviral CRISPR Human Kinase Library - - お問い合わせ page 04 価格 CRISPR gRNA 構築サービス CRISPR ゲノム編集実験に必要な gRNAをお届けします ! NEW! POINT CRISPRによるゲノム編集実験に欠かせない gRNA の合成受託サービスです。 配列デザインからin vitro 転写まで、Invitrogen™ GeneArt™ Precision gRNA Synthesis Kitを使って行います。 お届けするgRNA は、Cas9 Protein 、Cas9 mRNA のどちらの実験系にも使えます。 ● 配列デザインから実施します ● 調製した gRNA は Cas9 ProteinとCas9 mRNA のどちらとも使えます ● 対応生物種はヒトとマウスです ● 国内ラボで構築するので、1-2 週間でお届けします ● 1ターゲットあたり3コンストラクトの作製を推奨しています 受託サービスの流れ 下記 Webサイトからオーダーフォーム （ Excel ） をダウンロード後、 必要情報を記入し、[email protected] へお送りください。 オーダーフォーム 配列のデザイン／候補配列の提示 オリゴ合成／鋳型 DNA の調製 最適な切断配列をデザインし、候補配列を連絡します。 ご希望の配列をお知らせください。 指定した配列を合成し、鋳型 DNAを調製します。 gRNA の調製 GeneArt Precision gRNA Synthesis Kitで、gRNAを調製します。 吸光度測定 吸光度を測定し、収量を算出します。 納品 gRNA 溶液及びデータシートを納品します。※ 1 ※ 2 ※ 1 gRNAの目安収量は約 20 µgです。保証値ではなく、配列により収量が増減する場合があります。 ※ 2 凍結状態で納品します。到着後は-80 ℃での保管をお勧めします。 製品名 価格 サイズ 単価 1 コンストラクト gRNA 構築サービス 小計 ¥55,000 納期 ¥55,000 2 コンストラクト ¥55,000 ¥110,000 3 コンストラクト ¥40,000 ¥120,000 1-2 週間 ※ ※ご希望の配列をご連絡いただいてからの期間となります。 M ORE INFO サービス内容に関する詳細はこちら→ www.thermofisher.com/jp-gma page 05 2016 年 3 月 18 日まで キャンペーン実施中 ! CellInsight CX7 High-Content Platform 細胞イメージングを定量化。定量化で見えてくる新たな結果 POINT Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7 High-Content Screening（ HCS ） Platform は、スクリーニングや細胞解析に対するオールラウンドの機能を有する統合型シ ステム。最大 1,536 ウェルプレートの細胞をイメージングし、迅速に定量結果を提供します。 ● 多様な細胞解析に対応するBioApplicationを搭載し、各種イメージングモードを自 由に選択できます。 ● 目 的の解 析に最 適 化するため蛍 光スペクトル全 体を活 用し、目 的に合わせてワイド フィールドまたは共焦点観察のチャンネルのいずれかを選択できます。 ● 組織切片の比色分析用に明視野も搭載可能です NEW! 実験デザインに 個別細胞から表現型プロファイリングまでを自動化 合せたプレートマップ イメージ取得から数分で表形式の結果や統計計算値を表示します。 ウェルごとの 実 験 条 件 や 測 定 条 件を記 載し、 細胞の核、F-アクチン、核小 体、細胞体を異なる4 色の蛍 光 色 素で染 色 後 、それぞれ の面積、長さ、数等を定量化 HSC NuclearMask™ H-10325 Alexa Fluor™ 488 Phalloidin A-12379 SYTO™ 82 Orange Nugleic acid stain S-11363 HCS CellMask™ Deep Red H-32721 核 F-アクチン 核小体 セグメンテーション し、表やグラフで分かりやす く表示します。 標識 プレート全体のマップを作成できます。 測定 ワイドフィールドも切り替え可能 解析 目的に応じて 2 つのチャンネルを使い分けで きます。 widefield confocal 神経特異的β-Ⅲ tublinを染色した胚様体の画像イメージ。共焦 点チャンネルでは、3µmで最大 20スライドをイメージング。20 倍 の対物レンズを使用。 M ORE INFO 資料請求・お問い合わせはこちらから→ www.thermofisher.com/HCS page 06 Automated 検出 共焦点観察も User's Voice 堀 田 秋 津 氏（ 京都大学 iPS 細胞研究所 未来生命科学開拓部門） iPS 細胞を用いた新しい遺伝子治療法の開発へ 細胞継代や導入評価は Countess Ⅱ FL 自動セルカウンターで正確、迅速に 「 数 年 前までは 夢 物 語 でしたが 、遺 伝 子 ロフィン遺 伝 子をゲノム編 集で機 能 回 復 ニターに表示される機能もいいですね。自 させることで細 胞 治 療につながる研 究を 分の眼でピントが 合っていることや、細胞 しています」 と堀 田 氏 。2 0 1 4 年 、TA L E N 塊の大きさや分散具合をチェックできるの や CRISPR 技術を使って、患者由来の iPS で。僕はアナログ人間なので、長年使ってき 細 胞 中 のジストロフィン遺 伝 子 の 欠 失 変 た血球計算盤の様に自分の目でチェックで 異をゲノム編集し、正常な筋細胞へ分化す きると安心なんです」 と話します。 「また細胞 ることを報 告しました。 「ジストロフィンは 計測だけでなく、開発中のベクターDNA 導 220Mbという巨大遺伝子。途中で何らか 入効率を一次評価する時など、モニター遺 の遺伝子変異が起こり、読み取り枠がずれ 伝子のGFPやRFPの発現を蛍光チャネルで てしまえば 、短くて機 能しないタンパク質 計測しています」 と堀田氏。培養室のセルカ 病 の 治 療 法 の 一 つとして『 ゲノム 手 術 』 しかできず、筋肉タンパク質を細胞膜に繋 ウンターは、毎日誰かが使っているそうです。 という新しいアプローチで研 究を進めて ぎ 止めることができなくなります。細 胞レ います」。こう語るのは iPS 細 胞 研 究セン ベルでは、ジストロフィン遺伝子を『 修復 』 ター の 堀 田 秋 津 氏 。効 率 の 良 い 遺 伝 子 できたので、次は患者さんの治療へ向けて 導入ベクターや高精度なゲノム編集を駆 細胞分化等を共同研究中」 と続けます。 使し、血友病や筋ジストロフィーという遺 伝 子 病の治 療 法 開 発を進めています。鍵 は、ヒト疾 患 iPS 細 胞 。この細 胞をベース に、ヒト疾 患を引き起こす 遺 伝 子 変 異 の 修 復を目 指します。i P S 細 胞に特 徴 的な 細 胞 塊での 継 代や、新 規 ベクターによる 遺伝子導入の一次評価は、Invitrogen™ Countess™ Ⅱ FL 自動セルカウンター を使って、スピードアップを図っています。 遺伝子治療へのアプローチ iPS 細胞の継代には細胞数計測が重要 これからの研究に向けて 「 筋ジストロフィーの遺 伝 子 治 療は、細 胞 治 療 によるアプ ローチだけでなく、直 接 患者さんに CRISPR-Cas9を投与するア プローチも想 定しています。最 近 、この技 「 iPS 細胞は、コロニーの状態で増えていき 術で疾 患マウスの病 態が 改 善されたとい ます。継代の時はトリプシンでバラバラにせ う報 告 が ありましたが 、ヒトとマウスでは ず、 コラゲナーゼ等で剥がして小さな塊にし 遺 伝 子もゲノムも違います。私たちはヒト て撒き直します。この時、塊の細胞数が多す 疾患 iPS 細胞を活用することで、治療につ ぎると分化し易く、 また少なすぎると細胞が ながる技 術 開 発を進 めています。現 在は、 死んでしまいます。細胞継代はルーチンワー デュシェンヌ型でも頻 度 の 高い 変 異 の 修 クですが、iPS 細胞の場合は一般的な不死 復にフォーカスして研究を進めていますが、 化細胞株と比較して特に難しく、 しかも大事 将来的には一人ひとりの患者さんの遺伝 な作業となります。Countess Ⅱ FL 自動セ 子変異に合せた究極のカスタムメイド医療 「 血 友 病 の 治 療 法では、血 液 凝 固 因 子を ルカウンターを使うと、プログラムを設定す が実現するかもしれません。自分たちの技 効 率よく導 入するためのベクター開 発を ればコロニー状の細胞であっても計測でき 術開発が 少しでも患者さんの治療につな 行ってきました。デュシェンヌ型筋ジストロ るので、培養経験が少なくても再現性良く がることを目指して、日々研究に取り組ん フィーでは、患 者 由 来の iPS 細 胞でジスト 継代できます。また、計測と同時に細胞がモ でいます」 と堀田氏は語ります。 Countess Ⅱ FL 自動細胞カウンター 細胞数をワンステップで迅速、正確にカウント POINT ● 便利なオートフォーカス ● ● タッチスクリーンによる直感的操作 ● 10 秒で迅速測定 DAPI・GFP・RFPなどの蛍光計測も追加可能 製品の詳細情報やデモのお申込みはこちらから→ www.thermofisher.com/countess 製品名 サイズ 製品番号 Countess II FL Automated Cell Counter 1式 AMQAF1000 page 07 価格 ¥550,000 Technical Review ウェスタンブロッティングをサクッとスピーディに ! 土持政照 （テクニカルサポート） 研究室のルーチン作業、ウェスタンブロッティング。 その作業をサーモフィッシャーサイエンティフィックのトータルフローで短縮してみませんか ? 今回、私のお勧めのワークフローを6 種類の抗体検討を例にご紹介します。 このフローなら電気泳動から検出まで、普段ならオーバーナイトで行うフローも、 4 時間足らずで終了。しかも手間ヒマ省ける楽々フローです。 1 2 電気泳動 転写 並列ゲルで簡単アプライ& 7 分転写でスピードアップ ! 22 分で泳動終了 ! 1 0：0 0 ∼ 1 0：3 0 ∼ 2 枚のゲルを並べてセット。Invitrogen™ Bolt™ プレキャストゲルのサンプル ウェルは縁が広がっているので、普通のマイクロピペットで楽にアプライ可能。今 電気泳動が終わったら、ゲルを電極やメンブレンにサンドイッチしてInvitrogen™ iBlot™ 2 ドライブロッティングシステムへセット。前処理不要のPVDF 膜で、専用 回は4-12%グラジエントゲル2 枚にライセートとマーカーをトータル6セット泳動し スタックにゲルを挟むだけ。誰が行っても同じ結果が得られる再現性の高いシス ました。 テムです。 3 4 抗原抗体反応 検出 1 次抗体から最終洗浄まで 電源なしで自動化 ! 露光時間をスマートに設定 ! ［検出例］ 1 1：0 0 ∼ 1 3：3 0 ∼ Invitrogen™ iBind™ Flex Western Systemに、一次抗体溶液、二次抗体溶 液、洗浄液をセットし、後は2 時間半静置するだけ。ここでは、 メンブレンを6つに切 Thermo Scientific™ SuperSignal™ West Dura 化学発光検出試薬と反応後、 Thermo Scientific™ myECL™ Imagerで結果確認。Interactive Chemiボタ り分け、仕切り用 Well Insertを選び、6 種類の抗体を加えて同時に反応させまし ンを押せば適切な露光時間とイメージをその場で表示（左）、時間変更したイメー た。Well Insertは3 種類から選べます。 ジも確認できます。右は、アクチンタンパク質の検出結果 （右レーン） です。 ※タンパク質解析関連製品の詳細は、 こちらから→ www.thermofisher.com/protein page 08 User's Voice 三 原 恵 美 子 氏（ 大阪大学蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター特任研究員）、海 津 正 賢 氏（ 同センター特任助教）、有 森 貴 夫 氏（ 同センター特任研究員） 動物細胞発現系でのタンパク質生産支援から創薬をサポート 一過性大量発現系 Expi293 Expression System で高難度タンパク質も効率よく精製 りますが、大腸菌や昆虫細胞では発現しな も、ウイルス調製に手間や時間がかかりま かったタンパク質の発現にも成功しました」 す」 と一過性発現のメリットを指摘します。 と語ります。同じ研究室の海津正賢氏 （写真 右） は、 「 動物細胞を使うメリットは翻訳後修 構造生物学からの新たなアプローチ 飾にもあります。大腸菌では翻訳後修飾は 受託支援と並行して、研究室では神経系や なく、昆虫細胞でも糖鎖の付き方がヒトとは 異なる場合があります。その点、 このシステ ムは HEK293 細胞がベースなので、ヒト由 「 無 血 清 で 培 養 可 能 なタン パ ク 質 発 現 系 を 探して い ました 。試しに G i b c o ™ Expi293™ Expression Systemを使っ てみたところ、従来よりも15 倍も発現量が 向上したタンパク質もありました」 と語るの は、大阪大学の三原恵美子氏（写真前列）。 三原氏が所属する研究室は、13 年ほど前 より動 物 細 胞での発 現 系を使いこなして きた実績から、日本医療研究開発機構によ る「創薬支援技術基盤プラットフォーム事 業」の一環として、創薬に役立つタンパク 質の発現生産の支援や技術開発を担当し ています。 難発現性タンパク質も 哺乳類細胞発現系で可能に 来タンパク質を正確に、安定して発現する 系として期待できます。実際に、このシステ ムを用いて生産したある細胞増殖因子が活 性を持つことが確認できており、構造解析 にも問題なく使えています」 と続けます。 免疫系などの様々な細胞におけるシグナ ル伝達分子を構造生物学手法から研究中。 海津氏は 「これまでは量的な制限もあり、タ ンパク質を部分的にしか構造解析できない 場合がありました。このシステムを使えば 、 タンパク質を丸ごと解析するチャンスも増 えそうです。また、糖鎖を均一化する目的で キフネシンという薬剤を培地に添加する方 法が Expi293 Expression Systemにお 一過性発現で抗体を いて有効であることもわかり、目的タンパ 大量かつ短期間に精製 ク質の結晶化に向けたアプローチ法も増え 主に高付加価値抗体の作製やエンジニア そうです。当研究室ではこのシステムを用 リングを担当する有森貴夫氏（写真左）は、 「タンパク質 の 結 晶 構 造 解 析 には 、一 般 的に、最初に 1 mg 以上の試料が必要にな ります。これまでは安定発現株を構築して 大 量 培 養して精 製することが 一 般 的でし いて、すでに受理された論文 ※や準備中の 論文もあり、研究のベースとして今後も活 用したい」 と話します。 ※ "Active and water-soluble form of lipidated Wnt protein is maintained by a serum glycoprotein afamin/α-albumin" eLife, in press（ 2016 ） たが、このシステムを使うと1 L の培地換算 で 120 mg の抗体を回収できた例もありま 全国の研究機関へのタンパク質発現支援 す。しかも抗体精製には、Protein AやG の を行う中で 、より高 収 量で 精 製も楽な発 カラムを使うのが主流であり、血清からの 現 系を検 討し始めた三 原 氏 。 「 2 年 前から 抗体混入のリスクがありましたが、無血清 Expi293 Expression Systemを使い始 培地なので精製が 楽になりました」 と語り めました。接着細胞では面積の制約があり ます。海津氏も 「安定発現細胞株の樹立に ますが、浮遊細胞で高密度に培養できるた は通常 1,2 か月かかりますが、一過性発現 め、動物細胞における一過性大量発現系と であれば、最短で 1 週間から10 日で結晶化 して非常に有用です。またタンパク質にもよ まで進めることも可能。昆虫細胞での発現 Expi293F コンストラクト： （浮遊培養） A B C D HEK293T （接着培養） A B C D （マーカー：kDa） 150▶ 100▶ 75▶ 50▶ タンパク質の発現量の比較 ある受 容 体 の 細 胞 外 領 域 に つ い て 4 種 のコンストラクト を作成し、浮遊系 Expi293F 及び接着系 HEK293T （ A-D ） 細胞で発現。1 mL の培養上清からプルダウンにより発現量 を比較。Expi293F 培養中には、糖鎖修飾調節のため 5 µM Kifunensineを添加。 Gibco Expiシリーズ（ 3 製品） 大量発現を可能にした哺乳類細胞の一過性発現システム Expi293 Expression System：HEK293 細胞ベースで最大 1g/Lの発現 NEW ExpiCHO Expression System：CHO 細胞ベースで最大 3g/Lの発現 ● Expi293 MembranePro Expression System：膜タンパク質の機能解析に最適 ● ● 製品名 Expi293 Expression System Kit ※ 1 サイズ 製品番号 価格 1 キット A14635 ¥221,400 ExpiCHO Expression System Kit ※ 1 1 キット A29133 ¥276,000 Expi293 MembrenePro Expression System ※ 2 10 反応 A25869 ¥198,400 ※ 1 キットは、専用の細胞、培地、 トランスフェクション試薬を含むトータルシステムです。構成品の詳細は、 こちらから→ www.thermofisher.com/expicho ※ 2 Expi293 Cells （ A14527 ） は別売りです。 page 09 ユーザーグループミーティング 2015 開催報告 昨年 12 月、東京にて 「 Applied Biosystems / Ion Torrentユーザーグループミーティング 2015 」 を開催しまし た。遺伝子解析技術のスタンダードとして歩み続けるアプライドバイオシステムズ、そして最新の次世代シーケン ス技術を提供するイオントレント製品をお使いの方々始め、100 人を越える研究者の皆様にご参加いただきました。 講演では、現在、分子生物学や疾患研究をリードする 8 名の研究者の方々による、次世代シーケンサ、デジタル PCRシステム等を活用した研究の一端をご紹介いただきました。参加者からも「基礎研究から臨床研究まで幅広 い内容が良かった」 「 具体的な実験例が役立った」 とのコメントをいただき、弊社テクニカルスタッフへの質問時間 や情報交換会も盛り上がりました。 「 3500 Genetic Analyzer 解体ショー」 も人気。普段お使いの機械の内部を ご覧いただく良い機会となった様です。 「私たちの住む世界をより健康で、より清潔な、より安全な場所にするために、お客様へ製品・サービスを提供す ること」 を目指す弊社ミッションの紹介とともに、分子生物学や各種疾患研究に貢献するApplied Biosystems / Ion Torrentをはじめとした幅広い製品群を紹介しました。またアメリカ本社の Andrew Felton Ph.D.（ Vice を含む遺伝子解析ソリュー President, Product Management ）は、次世代シーケンサ「 Ion Torrent システム」 ションの開発状況を紹介しました。───── サーモフィッシャーサイエンティフィック代表取締役 イアン・スミス 臨床で使えるエピゲノムマーカーの開発 特別基調 講演 乳がん患者の血中 DNA におけるPIK3CA 講演 1 mutation 検出とその臨床意義 臨床応用を目指したエピゲノミクスとがんと の関係について、3つの観点からご講演いた だきました。1 つ目は、一見正常な組織にも がん患者の血液中には腫瘍由来の DNA 断 DNAメチル化異常が蓄積しており、その量 片（ circulating tumor DNA; ctDNA ）が が発がんリスクと相関する場合があること。 「発がんの素地」 という考え方を説明されま した。2 つ目は、胃粘膜に蓄積したDNAメチ ル化異常を定量することで異時性多発胃が 存 在し、新たなバイオマーカーとして注 目 国立がん研究センター エピゲノム解析分野・分野長 牛島俊和 氏 されています。加々良氏らはデジタル PCR を使 用し、乳がん患 者 血 中の PIK3CA 変 異（ H1047R, E545K, E542K ）検出を試 んのリスクが測定できること。そして 3 つ目 みたところ、変異 ctDNA 陽性症例は有意 は、神経芽細胞腫での CIMP の存在が予後 に予後不良だったこと、デジタル PCR は血 と密接に関連すること。CIMPとはゲノム上 中の微量なPIK3CA 変異 ctDNA の検出 の複数の CpG アイランドのメチル化であり、 に有用な感度と特異度を有し、ctDNA は その存在と予後に関する最新の研究進捗や がん患者の予後予測因子となりうることを 海外との共同研究をお話しいただきました。 講演されました。 Ion PGM システムを用いた大 規 模メタ 1 6 S 解 析による健 康に関 わる口 腔マイク 講演 4 Ion PGM システムを用いたジストロフィン遺 デュシェンヌ型筋ジストロフィーはジストロ 口腔には数百種、数兆個ともいわれる膨大な フィン 遺 伝 子 変 異 によって 起こる頻 度 の 数の微生物が複雑な相互作用に基づく常在 高い 遺 伝 性 疾 患であり、70% の患 者では、 微生物生態系（マイクロバイオーム） を構築し、 に関わる口腔常在マイクロバイオームの構成 パターンの特定を目指し、さまざまな集団にお 乳腺・内分泌外科 加々良尚文 氏 講演 5 伝子変異解析の臨床現場への応用について ロバイオームの探索 生息しています。竹下氏らは疾患および健康 大阪大学大学院医学系研究科 大規模な欠失・重複変異を持ち、MLPA 法 九州大学大学院歯学研究院 口腔保健推進学講座 竹下 徹 氏 いて唾液、舌苔、歯垢といった口腔検体を採取 によって診 断されます。しかし点 変 異など の微 小 変 異を有する 3 0 % の患 者には、臨 床 現 場 で 利 用 できる 遺 伝 子 診 断 方 法 が ありませんでした。そこで三橋氏らは、Ion し、Ion PGM システムをはじめとする次世代 PGMシステムによる遺伝子検査の有用性 シーケンサを用いた微生物群集構成比較解析 を検証した結果、ジストロフィン遺伝子変異 を行っています。これらの解析で得られた知見 をもつ患者の 94% 以上の検出が可能であ やマイクロバイオーム解析における Ion PGM り、欠失／重複例についても遺伝子配列情 システムの 有 用 性をご 紹 介いただきました。 報が 得られたことをご紹介いただきました。 page 10 国立精神・神経医療研究センター 疾病研究第一部 三橋里美 氏 クリニカルシーケンスのこつとリキッドバイ 講演 2 オプシーへの展開 Ion PGMシステムによる16S rRNA アン 講演 3 プリコンシーケンスを基盤とした細菌叢解 析をインプラント周囲炎や歯周病の予防お よび治療に役立たせるために 現在、がん薬物療法では、EGFR 遺伝子変異 や ALK 融合遺伝子の発見により、個々の分子 標的薬に対する遺伝子異常のコンパニオン診 断が求められており、次世代シーケンサを用い た複数の遺伝子異常測定パネルのクリニカル シーケンスへの応用および体外診断薬化が模 インプラント治 療は、天 然 歯よりも人 工 歯 近畿大学 医学部 ゲノム生物学教室 坂井和子 氏 根と歯肉との結合が弱いため、周囲が病原 性細菌に感染し易いという欠点があります。 鏡 氏らは、歯 科 医 院におけるインプラント 索されています。坂井氏は、近畿大学医学部に 周囲の炎症予防や治療方針をサポートする おける、種々のパネルを用いた臨床サンプル ためのシステムを開 発 中です。このシステ の遺 伝 子 解 析の実 施 体 制やクリニカルシー ムは、Ion PGM システムを利用した 16S ケンスの現状をご講演。また、より侵襲性の低 rRNA 遺伝子配列解析による患部細菌叢 いリキッドバイオプシーを用いた個別化医療 の系 統 解 析を基 盤としており、その一 端を への展開についてもご紹介いただきました。 細菌叢データと共にご紹介いただきました。 便やFFPE 組織など劣悪な検体でのmiRNA 講演 6 Ion AmpliSeq テクノロジーを利用した 瑞輝科学生物株式会社 鏡 良弘 氏 講演 7 膵管がんにおける変異検出 発現解析 古 賀 氏 ら の 研 究 室 で は 、2 0 0 6 年 より ゲノム解 析 技 術の進 歩に伴い遺 伝 子 診 断 Applied Biosystems 7500 Fast リアル タイム PCR システムを使用し、新しい大腸 が ん診 断 法の開 発 研 究として、便 中 R N A の解 析を行っています。特に 2010 年 以 降 国立がん研究センター 東病院 臨床開発センター 古賀宣勝 氏 への期待が 高まっており、すでにがん領域 において遺伝子変異等の「診療情報」が 必 須となっています。水上氏らは、民間病院に は便中の miRNA に着目し、バイオマーカー 付 属するラボにおいて、ゲノムから生 命 科 として利 用 可 能であることを明らかにしま 学情報を読み取り、将来の診療応用へと展 した。最 近は、便 潜 血 検 査の残り液中に含 開すべく、研究活動に取り組んでいます。特 まれるmiRNA の検出や、FFPE 組織を用い に膵がんを中心にAmpliSeq テクノロジー た miRNA 発 現 解 析も行っていることを併 を利 用した情 報 発 信を目指しており、その せて紹介されました。 試行錯誤の様子をご紹介されました。 page 11 札幌東徳洲会病院付属 臨床研究センター 臨床生体情報解析部 水上裕輔 氏 Minor Variant Finder ソフトウェア キャピラリシーケンサで、レアな変異にアプローチ NEW! POINT Applied Biosystems™ Minor Variant Finder ソフトウェ アは、キャピラリシーケンサで 5% 程 度のレアな変 異を検 出する ために開発されました。従来のキャピラリシーケンサのソフトウェ アで、変異ピークを検出するには、25% 程度の変異が存在しない と、シーケンシングデータのバックグランドのノイズにピークが埋 もれてしまい、ノイズと変異のピークを見分けることは困難でした。 Minor Variant Finder ソフトウェアは、弊社の長年に亘るシー ケンシング技術の蓄積を基に開発したアルゴリズムを搭載してい ます。コントロールサンプルからバックグラウンドのノイズを区別し、 変異ピークを検出するために、ノイズを最小化するプロセスが組み 込まれています。これにより従来は識別が困難であった5% 程度の 変異ピークの検出が可能となります。 ● キャピラリシーケンサで 5% 程度の変異を検出 ※ Minor Variant Finder ソフトウェアの利用は、今までの実験系を変更する必要はありませ ん。キャピラリシーケンサのファイル （ .ab1ファイル） で簡単に解析できます。また、次世代シー ケンサの VCFファイルにも対応し、次世代シーケンサとキャピラリシーケンサの結果を比較し、 アノテーションできます。 ● 簡単な操作でレアな変異を検出し、 レポート ● 次世代シーケンサとの比較やアノテーションが簡単に ● 今までのプロトコルを変更する必要がありません 簡単な操作でレアな変異を 次世代シーケンサとの比較や 検出し、レポート アノテーションも簡単に 解析後はリファレンス配列における変異情報をわかりやすくレポートします。 次世代シーケンサから得られたデータファイルをインポートし、キャピラリーシーケンサの変異情報と 比較し、アノテーションを行うことができます。 約 5% の変異ピークを検出 ソフトウェア （デモ版） いますぐ試してみよう ! 配布中 50サンプル分の解析を実際に試していただけるMinor Variant Finder ソフトウェアのデモ版を配布しています。 上段： キャピラリ―シーケンサによる従来のデータ 5% 程度のレアな変異のピークは、ベースラインのノイズに埋もれてしまい、判別が困難でした。 下段： Minor Variant Finder ソフトウェアのアルゴリズムでノイズを最小化したデータ ベースラインのノイズを除去し、わずかな変異のピークでも可視化したデータから、高感度な変異 ダウンロードはこちらから ⇒ w w w. t h e r m o f i s h e r. c o m / m v f 検出を可能にします。 製品名 サイズ 製品番号 価格 Minor Variant Finder Software アプリケーションソフトウェア、Windows 7 / Windows 10 英語版 1式 A30835 ¥780,000 page 12 SuperScript IV Reverse Transcriptase 10 分間で全てを逆転写する 高性能 Invitrogen™ SuperScript™ III Reverse Transcriptase（ RT ）の品質を全て引き継ぎ、さらに確実性を高めた逆転写酵素です。 お試しいただいた方の 78% が購入希望と回答しました。 POINT わずか 10 分間の反応時間 分解したRNA でもOK 反応阻害剤に対する高い耐性 優れた熱安定性（最高 55 ℃） 製品名 サイズ 製品番号 SuperScript IV Reverse Transcriptase 2,000 ユニット 10,000 ユニット 10,000 ユニット×4 18090010 18090050 18090200 ¥13,100 ¥53,700 ¥170,000 SuperScript IV First-Strand Synthesis System 50 反応 200 反応 18091050 18091200 ¥79,200 ¥269,300 価格 User's Voice 浅 田 眞 弘 氏（ 産業技術総合研究所 創薬基盤研究部門 主任研究員） 繊維芽細胞増殖因子（ FGF ）の機能発現と糖鎖の影響 遺伝子の発現解析には、SuperScript RTを継続的に使用 「この研 究 所に入 所して分 子 生 物 学 的 研 のバックグラウンドを生かして、FGF へ人 究を始めた 20 年程前から、逆転写酵素は 工的にどんな糖を付けると機能が 向上す S u p e r S c r i p t RT を使い 続けています。 るかを調べました。もともと大腸菌で作ら 新製品の SuperScript Ⅳ RTも試してみ せた糖鎖がない FGF にも活性があります ましたが 、問 題なく使えるようなので、新 が、糖鎖が付くことでタンパク質分解酵素 しい実験を始めた時には迷わず 使います に対する抵抗性が高まることが分かりまし ね」。こう語るのは、産業技術総合研究所の た。また糖鎖を離れて、FGF-1とFGF-2 の 浅田眞弘氏。経験豊富な糖鎖研究を起点に、 キメラであるFGFC は、安定性が高いだけ 多彩なFGF の機能と構造、そして糖鎖との でなく、増殖因子としての機能も向上する 関係を研究してきました。 ことから、生体へ深刻なダメージをもたら す放射線の影響を調べました。するとマウ 「様々な細胞増殖因子がありますが 、その スの 実 験 から、放 射 線による生 体 障 害を 中でも FGF は 22 種 類もあり、それぞれの 軽減することが分かり、放射線防護剤の創 作用を研究してきました。最初は糖鎖研究 薬の可能性を示しました」 と続けます。 「さ page 13 らに何種類かの FGF 因 子は、毛髪の成 長 にも影響するので、マウスを使って発毛の 周 期によって遺 伝 子 発 現がどのように変 化するかを調べたこともあります。この時 は m R N A を S u p e r S c r i p t R T で逆 転 写 し、定量的 PCR で徹底的に調べました。ま た FGF は幹細胞培養液への添加物として も重要であり、その観点からも研究を進め ています。今 後も幅 広い 視 点で研 究に取 り組みたい」 と浅 田 氏は語ります。浅 田 氏 の縦横無尽に広がる研究をSuperScript RT がこれからも支えていくようです。 Anza Restriction Enzyme Cloning System 1 バッファー、1 プロトコルで 128 の制限酵素が切断可能 NEW! POINT Invitrogen™ Anza™ Restriction Enzyme Cloning Systemは、 128 種類の制限酵素と5 種類の DNA 修飾酵素を含む完全なシステムです。 すべての Anza 制限酵素は同一の Anza バッファーで反応可能で、 優れたパフォーマンスを提供します。 ● すべての制限酵素は 1 種類のバッファーで反応 ● 単一プロトコル（ DNAタイプごとの使い分け必要なし） で、反応は 15 分で完了 ● オーバーナイトの反応でもスター活性が生じません Anza 制限酵素のシンプルな反応系 試薬 制限酵素 1 種類の反応 ヌクレアーゼフリー水 制限酵素 2 種類の反応 制限酵素 3 種類の反応 最終容量になるように必要量を加えます Anza 10X バッファー もしくはAnza 10X Redバッファー Anza 制限酵素は、反応で使用する制限酵素の 数や D N A のタイプには無 関 係に、シンプルな プロトコルを採 用しています。混合液を調製し、 37 ℃で15 分間インキュベートする2ステップのみ 2 µL 2 µL 3 µL 0.2–1 µg 0.2–1 µg 0.2–1 µg Anza 制限酵素 1 1 µL 1 µL 1 µL 便利なバッファーフォーマット Anza 制限酵素 2 – 1 µL 1 µL す べ ての A n z a 制 限 酵 素 には A n z a 1 0 X バッファーと A n z a Anza 制限酵素 3 – – 1 µL 20 µL 20 µL 30 µL DNA 最終反応容量 同一の Anza バッファー中での 複数酵素による処理 C 1 2 3 4 です。 10XRed バッファーがセットで付属しており、用途に応じて柔軟に 対応します。Red バッファーは、反応終了後、直接電気泳動に使用 できるようにデザインされています。また反応容量は直線的に5x までスケールアップができます。 L bp 12,000 5,000 同一バッファー中、3 種類の酵素で プラスミドを完全消化 をAnza 1 NotI, Anza プラスミドDNA（ 6,215 bp ） 16 HindIII, および Anza 15 XmaJIで消化しまし た。制限酵素 1 種類の場合、20 µLの反応系で、1 µg Anza 制限酵素は、Anza バッファーを使用 2,000 して一つの反応液中で複数酵素の反応を の DNA および 1 µL の制限酵素で反応を行いました （レーン1-3 ）。制限酵素が 3 種類の場合には、30 µL の反応系に、1 µgのDNAおよび各制限酵素 1 µLず 行えます。すべての消化反応に対してプロ 1,000 トコルは１種類。使用する酵素全てに対し 500 インキュベーションは37ºCで15 分間行いました。 300 200 100 C: 非消化プラスミドDNA 1: Anza 1 NotI 2: Anza 16 HindIII 3: Anza 15 XmaJI 4: Anza 1 NotI ＋ Anza 16 HindIII ＋ Anza 15 XmaJI L: 1 Kb Plus DNAラダー て互換性のあるバッファーを探す手間を省 き、時間を節約できます。 M ORE INFO つを添加し、推奨プロトコルに従いました （レーン４）。 下記は製品の一例です。全 163 製品のリストはウェブサイトをご確認ください。 2016 年 3 月 31 日まで、発売記念 50%offキャンペーン実施中 ! www.thermofisher.com/jp-anza 製品名 サイズ 製品番号 Anza 1 Notl 500 ユニット IVGN0014 ¥10,700 2000 ユニット IVGN0016 ¥42,900 8000 ユニット IVGN0116 ¥8,300 40,000 ユニット IVGN0118 ¥33,000 2000 ユニット IVGN0126 ¥9,900 12,000 ユニット IVGN0128 ¥40,400 8000 ユニット IVGN0166 ¥8,300 40000 ユニット IVGN0168 ¥33,000 8000 ユニット IVGN0056 ¥8,300 24,000 ユニット IVGN0058 ¥20,600 Anza 11 EcoRI Anza 12 XbaI Anza 16 HindIII Anza 5 BamHI page 14 価格 User's Voice 河 原 裕 憲 氏（ 金沢大学医学系免疫学） 神経系エキソソームが内包するタンパク質や RNA の機能解析 Lipofectamine MessengerMAX で、初代培養神経細胞へ簡便に遺伝子を導入 生体内で様々な細胞間情報伝達を介在す をかけずに効 率 良い 方 法を探していまし る細 胞 分 泌 小 胞として注 目されるエキソ た。そこで試 薬を使い、もっと簡 便に遺 伝 ソーム。金 沢 大 学 の 河 原 裕 憲 氏は、神 経 細胞とグリア細胞間の情報伝達機構に関 子を導入できないかどうか、Invitrogen™ Lipofectamine™ MessengerMAX で 与する分子メカニズムの解明を目指し、神 mRNA による導入を試してみました（右の 経 系エキソソームに内 包される新 規タン 写真）。すると突起を伸ばした典型的な初 パク質や RNAを探索中です。 代神経細胞で GFP の発現を確認でき、細 具 体 的 には パ ーキンソン 病 の 原 因 遺 伝 しかも m R N A なので 、タンパク質 への 発 胞 毒 性もほとんど 観 察されませんでした。 子の一つであるα-synuclein を Ca 2＋ 刺 現も早い様です。今後、初代培養神経細胞 激 依 存 的エキソソーム内 包マーカーとし の異なるステージで遺伝子導入を行い、そ て、刺 激 前 後の分 子 種の変 化を調 べてい の違いを観察してみたいですね。そして神 ます。「 研究を進めるために、初代培養神 経 系のエキソソーム中のどのような分 子 経細胞への遺伝子導入を行うことにしまし を介して情報伝達が行われているのか。そ たが 、分 化した神 経 細 胞への遺 伝 子 導 入 の正体や機能に迫りたいと思っています」 は難しく、私自身もエレクトロポレーション と河原氏。神経系に特異的なエキソソーム やレンチウイルス、 トランスジェニックマウ の作 用 機 序の解 明を足 掛かりに、疾 患の ス等様々な方法で試してみましたが、手間 病態理解や創薬への応用が期待されます。 マウスの初代神経細胞への遺伝子導入 マウス初代海馬神経細胞へ分化後 13日目に、Invitrogen™ mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA で転写した GFP 遺伝子のmRNAをLipofectamine MessengerMAX を使って導入。神経突起を伸ばした複数の細胞で GFP の 発現を確認できました。Lipofectamine MessengerMAX の方が Lipofectamine 3000よりも導入効率が良好でした。 細胞別トランスフェクション選択ガイド Invitrogen™ Lipofectamine™ トランスフェクション試薬は、脂質ベースの卓越したテクノロジーをベースに、様々な細胞へ目的の分 子を導入します。プラスミドDNA 、mRNA 、低分子 RNA 、さらにレンチウイルスへのパッケージングや Casタンパク質によるCRISPR ゲノ ム編集まで、目的に応じて試薬やシステムを使い分けることで、細胞へのダメージを抑えつつ高い遺伝子導入効率を実現します。細胞に 合わせてトランスフェクション法を使い分けて、効率よく研究を進めるための選択ガイドをご紹介します。 初代細胞 神経 / 幹細胞 付着細胞 細胞株 / 初代細胞 jurkat/B&T 細胞 Lipofectamine 3000 Neon Transfection System 成功 ● 1 異なる細胞密度 2 試薬量を上げる 3 MessengerMAX 要改善 ▲ 浮遊細胞 不成功 × 1 MessengerMAX 2 Neon System Virus 成功 ● 1 異なる細胞密度 2 異なるDNA 濃度 要改善 ▲ Lipofectamine MessengerMAX 不成功 × 要改善 ▲ 不成功 × 1 mRNA+Neon mRNA のデザインと 1 mRNA+Neon 2 Virus 質の向上 2 Virus 製品名 サイズ 製品番号 Lipofectamine 3000 Lipofectamine MessengerMAX Neon Transfection System 0.75 mL 0.75 mL 1台 L3000008 LMRNA008 MPK5000 価格 詳しい製品情報はこちらから www.thermofisher.com/lipofectamine page 15 ¥69,400 ¥71,200 ¥1,000,000 Technical Review NanoDrop 超微量分光光度計 & Qubit 3.0 Fluorometer サンプル中の核酸や タンパク質の定量・定性に便利な 2 つの光度計 さまざまな実験で、核酸（ DNA 、RNA ）やタンパク質の濃度測定が必要です。より適切に、より手軽に濃度測定できれば、その後の実験を スムーズに進められます。サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、ベンチトップ型のサンプル定量装置として、UV ベースの Thermo Scientific™ NanoDrop™ 超微量分光光度計と蛍光ベースの Invitrogen™ Qubit™ Fluorometerを提供しています。ここでは各々 の特長と使い分けのポイントを解説します。両機種を使いこなすことで、実験を安心して効率化できます。 NanoDrop One 超微量分光光度計 Qubit 3.0 Fluorometer 夾雑物はあるけど 微量な目的分子の 濃度を知りたい ! 貴重な サンプルでも 手軽に濃度を 知りたい ! NanoDrop One 超微量分光光度計は、わずか数 µL の微量 なサンプル中の核酸やタンパク質を定量します。さらにキュ Qubit 3.0 Fluorometer は、測定分子を専用の蛍光試薬 でラベルし、夾雑物中でも 2 本鎖 DNA や、RNA を特異的に ベット測定に対応する機種（ NanoDrop One C ）もあります。 定量します。 ● UV ベースの吸光度測定 µL のサンプルを直接測定 ● PC 不要のコンパクトシステム ● 蛍光ベースの定量測定 ● わずか 1-2 ● 目的分子を特異的に測定 ● 高感度測定 ● コンタミネーションを知らせるアラート機能 POINT POINT ［簡単、直接定量］ ［ターゲットに特異的な測定］ サンプル溶液を直接測定するので、 例えば 2 本鎖 DNAを測定する場合、 希釈、試薬添加や反応など必要ありません。 専用試薬を加えて測定するので、同じ質量の RNA が 台座にサンプルを載せ、アームを降ろせば、 存在してもDNA のみを特異的に測定します。 自動的に測定を開始します。 DNA + RNA（ 1:1 ） F l u o re s c e n c e DNA 0 1.0 2.0 DNA (ng) RNA 0 Pipette Measure Know page 16 20 60 80 40 DNA or RNA (ng) 100 使い分けガイド Qubit 3.0 NanoDrop One NO A 260/A 280の比や DNAサンプル ターゲット以外の不純物 （ RNA, dNTPs, タンパク質など）の NO スペクトル確認が必要 NO YES NanoDrop One DNA 濃度が高い （＜100 ng/µL ） 影響が疑われる YES DNA 濃度が低い NO （＞1,000 ng/µL ） YES Qubit 3.0 NO 蛍光ラベル率を 確認したい YES Qubit 3.0 YES NanoDrop One NanoDrop One ※ ※蛍光色素の極大吸収波長 （通常、励起波長） での吸光度を測定することで蛍光色素量が確認できます。ただし蛍光強度は測定できません。 DNA 測定における両機種の比較 NanoDrop One テクニカルスタッフから もうひとおし ! Qubit 3.0 NanoDrop One 超微量分光光度計 迅速・簡便 高感度・特異的 精製サンプルを直接測定 RNAやdNTPの混在でも測定可能 測定原理 UV 吸光光度測定 蛍光試薬ベースの測定 サンプル容量 1-2 µL 特長 ［アラート機能］ 実験経験が少ない方も安心 ! 測定結果の 妥当性が低い場合や、コンタミネーション 0.2-27,500 ng/µL 1 の可能性をアラートで表示します （赤枠） 。 1-20 µL ※1 POINT 0.01-1,000 ng/µL ※2 NanoDrop dsDNA 測定範囲 Qubit 3.0 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000 DNA 濃度（ ng/µL, Logスケール） 測定時間 （サンプル調 製∼ 結果表示） 約8秒 （自動サンプル検証等 ※3を含む） ● 精製サンプルのルーチン測定 ● スペクトル確認 アプリケーション ● 高濃度サンプル ● 蛍光ラベル量の測定 （例：マイクロアレイ） 2-5 分 Qubit 3.0 Fluorometer POINT 2 ［夾雑物中の低分子 RNAを正確定量］ ● 夾雑物を含むサンプルの測定 2 ng/µL siRNA 中に各種濃度のrRNA ● 低濃度サンプル を加え、3 種類の方法で測定。Qubitと ● 精度が求められる測定 専 用 試 薬を用いた場 合 のみ、s i R N A （例：次世代シーケンス、定量PCR） を 正 確 に 定 量 できました 。グ ラフは 、 N a n o D ro p 超 微 量 分 光 光 度 計によ る 2 6 0 n m での 測 定（ A 2 6 0 ）、Q u b i t＋ miRNA assay 、もしくはQubit＋ RNA assayを比較しています。 ※ 1 台座で測定した場合、下限は2 ng/µL 。キュベットを用いた場合の下限は、0.2 ng/µLです。 ※ 2 サンプル容量と使用する蛍光試薬によって範囲が変わります。 ※ 3 吸光度測定やスペクトル表示だけではなく、サンプル中へのコンタミネーションや気泡の有無を検証する時間 も含まれています。 製品名 サイズ 製品番号 価格 NanoDrop One 超微量分光光度計 1台 A30221 ¥1,750,000 NanoDrop One C 超微量分光光度計 1台 A30222 ¥2,050,000 Qubit 3.0 Fluorometer 1台 Q33216 ¥195,000 Qubit 3.0 Quantitation Starter Kit 1 セット Q33217 ¥215,000 Qubit 3.0 NGS Starter Kit 1 セット Q33218 ¥210,000 M ORE INFO One www.thermofisher.com/jp-ndo 詳しい製品情報はこちらから→ NanoDrop page 17 Qubit 3 www.thermofisher.com/qubit Technical Review Attune NxT Acoustic Cytometerでヨーグルト中の生きた乳酸菌を簡単定量 ヨーグルトは生きて腸まで届く? 市販のヨーグルトに含まれる乳酸菌の生菌と死菌の割合を、Invitrogen™ Attune™ N x T A c o u s t i c C y t o m e t e r を使って定 量しました。その 結 果 、今 回 使 用した ヨーグルト中には、乳酸菌の生菌が 72% 、死菌が 22% の割合で含まれていました。 Attune NxTシステムの検出部では、超音波を用いたアコースティックフォーカシン グ技術により、縦長の乳酸菌を全て一定の向きに一列で整列させて測定します。そ yogurt のため菌体の向きによる蛍光強度のバラつきがなく、乳酸菌の生死を正確に測定で きました。 用 意するもの 手順 ・ ヨーグルト （加糖・無糖問わず） ・ Attune NxT Acoustic Cytometer ・ LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability and Counting Kit, for flow cytometry（ L34856 ） ・ 0.85% 食塩水（ 0.2 µmフィルター濾 過済） 1 ヨーグルトを適量チューブに移し、溶液状になるまでボルテックス 2 溶液状になったヨーグルトを0.85% 食塩水で 400 倍に希釈 3 Invitrogen™ LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit 中の SYTO9とPI 試薬をヨーグルト希釈液の 1/1000 量添加 4 遮光、室温で 15 分インキュベート 5 Attune NxT システムで測定（ Flow rate = 25 µL/min ） 測定結果 Attune NxT コ コ が ポ イント ! 乳酸菌のうち、 必ずサンプルの長辺側をレーザー 生菌 =72%（ 3x10 5 cells/mL ）、 が 照 射する→ 乳 酸 菌など 縦 長 の 死菌 =22%（ 9x10 cells/mL ） で 4 サンプルは、全て縦長の状態で測 あることが分かりました。 定できるので、データの一貫性が 担保されます。 小さなサンプルもきちんと一列に Name 整列→サンプル流径によらず常に Count Concentration Gated Total 350,133 14,588.88 100.00 100.00 10,000 416.67 2.86 2.86 く、精度が高いデータが得られます。 Live 7,196 299.83 71.76 2.06 ※これらのポイントは 、A t t u n e N x T 独 自 の Dead 2,196 91.50 21.96 0.63 All events lactobacillus 整列しているので、蛍光強度にバ ラつきが少ない。つまり%CV が低 Acoustic Focusing技術により実現されます。 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer 素早く・簡単・詰りづらい ! 解析に特化したフローサイトメーター 最大 4 本レーザー搭載、14 色検出可能。 詳しくはこちらから→ www.thermofisher.com/attune page 18 い つ 行く? どうする ? 海 外 留 学 Title 新しいサイエンスが Number 16 始まるところへ Name 宮 成 悠 介 氏（自然 科 学 研 究 機 構 岡 崎 統 合バイオサイエンスセンター 特任准教授） フランスで 5 年間、若いボスと新しいラボの立ち上げに奮闘する ボを立ち上げることを知りました。メキシコ出身の女性で、抜群 一方、多能性獲得に関わる遺伝子発現の「揺らぎ」 を動画で捉え、 に頭が切れると聞き、その人のもとで新しいサイエンスを一緒に Nature 誌に報告した宮成氏。現在は基礎生物学研究所にラボ 作っていきたいと思いました。すでに実績のあるビッグラボより、 を持ち、独自の分野を築きつつあります。 「自分の直感よりも、第 三者の客観的評価を尊重した留学先のラボ選びは成功だった」 と振り返ります。 研究費が少なくても、小さなラボで思いっきり自分の力を試しみ たいと思ったのです」 と、ほぼ 3 日で留学先を選んだと宮成氏は 笑います。 海外での研究生活 留学までの準備期間 「留学したフランス国立科学センター （ IGBMC ） では、6-7 人から 九 州 大 学 卒 業 後 、修 士 課 程で京 都 大 学ウイルス研 究 所に移り、 C 型肝炎ウイルスの研究で博士号を取得。留学する先輩と接す る中で、自分も一度は海外で研究したいという気持ちが強くなり ます。 「 研究室の成果発表やジャーナルクラブを通して、ウイルス 研究から次第にリプログラミングやエピジェネティクスという研 究に惹かれていきました」 と宮成氏は話し、留学では新しい研究 分野に挑戦することを決心します。 「しかし留学先で異分野に飛 び込んで、基礎から教えてもらうよりも、限られた留学期間中は 最大の力を発揮したい。そのために、まずは国内で基礎を学ぶこ とにしました」 と3 年間の準備期間を設けます。 構成される研究ユニットがずらっと並び、垣根が 低く、研究機器 は自由に使えました。また研究所には、常勤のイメージングのサ ポートチームなどがあり、様々な技術的な相談に乗ってくれまし た」 と、宮成氏は日本とは大きく異なる研究環境に驚いたそうで す。 そして半年後、面白い現象を見つけます。 「 ES 細胞内で、多能性 獲得に関わるNanog 遺伝子の発現パターンを蛍光イメージング で追跡していました。すると多能性が不安定な時期には、父親由 来か母親由来か、どちらか片方の染色体からのみ Nanog が発現 している様子を動画で捉えたのです。時間と共に発現がスイッチ する様子が鮮やかに映し出されていました。そのような現象は他 の多能性遺伝子では見られない、ユニークなものでした。」宮成 第三者の意見を聴く 数年後、留学の準備のために申請用紙を開くと、渡航の 1 年以上 も前にも関わらず、留学先のボスの承諾が必要とあります。締切 りは 3 週間後。まだ具体的な留学先はなく、慌てて科学雑誌でや りたい研究の論文を探してラボをピックアップします。そして候 補のラボのホームページから、過去に滞在したらしい日本人を探 し出し、ウェブ検索で連絡先を調べ、ラボの様子やボスの人柄を 尋ねました。 「 締め切りも迫っていたので、急いで電話をかけまし た。とても親切に対応してくださり、論文の筆頭著者が 新しくラ 氏は、この論文を留学 3 年目にまとめ、さらに帰国後にラボを持 つために、もう2 年留まり新たな研究を進め、5 年目にポストを得 て帰国します。 留学で得たものは ? 「留学前は 1 人でバリバリと研究を進めれば 良いと思っていまし たが、留学してコミュニケーションの大切さに気づきました。向こ うでは、教授も学生もフラットに話し合い、研究を進めていきます。 また誰でも行き詰ることがありますが、そんな時も自分だけで解 決しようとせず 、誰かに聞けばよいと思うようになりました。研 究をやるのは人であり、その対処法の差は研究にも表れます。留 学したことで海外の研究者との心理的な垣根がなくなったこと も大きなメリット」 と話します。さらに 「 2 歳違いのボスがラボを立 ち上げ、試行錯誤しながらラボを運営していく姿を間近で見たり、 相談に乗ったりしたことが、今、とても役立っています。良いラボ に留学したと思っています」 とボスへの感謝も忘れません。 2006 年、京都大学生命科学研究科にて Ph.D.を取得。国立遺伝学研究所で 3 年間のポ スドクを経て、フランス国立科学センターへ。14 年、愛知県岡崎市にある自然科学研究機 構 岡崎統合バイオサイエンスセンターにて独立。基礎生物学研究所の併任准教授、JST 研究室仲間とマドリッドへ。右端がボスのMaria-Elena Torres-Padilla 博士。 さきがけ研究員でもある。 page 19 INFORMATION 2016 / March / No.34 第 1 5 回 日 本 再 生 医 療 学 会 総 会に参 加します ! 「知のシンフォニー ∼再生医療による難病克服を目指して∼」 をメインテーマに開催される再生医療学会総会に参加します。 ブースでは、再生医療研究に欠かせない培養関連試薬や細胞低接着性プレート、また細胞解析用の顕微鏡やフローサイトメーター、 細胞イメージング定量プラットフォーム、次世代シーケンサなどを展示します。 また、ブースで簡単なアンケートに答えると、 「 川柳 in the ラボ 2015 」冊子をもれなくプレゼント! ランチョンセミナーでは、幹細胞研究をリードする研究者のご講演や、 米国本社のエキスパートが米国での実例と共に再生医療研究を加速する各種ツールをご紹介します。 ランチョンセミナー① ［ LS-13 ］ 3 月18日（金）12：00∼12：50 第 4 会場 （ Room1003 ） 「幹細胞研究における生体環境利用の有用性」 演題： 座長： 江藤浩之氏（京都大学 iPS 細胞研究所臨床応用部門） 演者： 正木英樹氏（東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センター幹細胞治療分野） ランチョンセミナー② ［ LS-10 ］ 3 月17日（木）12：10∼13：00 第 11 会場 （ Room1101-2 ） 演題： "The CTS Product Platform and the Importance of Raw Material Sourcing, Quality, Experience and Scale in the Translation of Cell Based Therapeutics" 座長： 宮崎潤一郎（サーモフィッシャーサイエンティフィック） 演者： Eric Roos（ Strategic Alliances Leader, Cell Therapy, Thermo Fisher Scientific ） 会期 2016 年 3 月 17 日（木）∼ 19 日（土） 会場 大阪国際会議場 www.thermofisher.com/jp-15jsrm 抽選で100 名様に 「川柳 in the ラボ 2015 」 を プレゼント! NEXT3 月号はいかがでしたか ? 特集は、東北大学教授の出澤真理先生。再生医療への Muse 細胞の応用と可能性について伺いました。人 気の留学記は、自分の力を試すために留学先を決めた基礎生物学研究所の宮成悠介氏です。また新製品は、 CRISPRライブラリや細胞イメージングの定量化に活躍するCellInsight CX7 等。創薬スクリーニングなど、 ハイスループット解析へお役立てください。今回は、読者アンケートにご協力いただいた方から抽選で 100 名様に 「川柳 in the ラボ 2015 」 をプレゼント。ぜひ感想をお寄せください ! アンケートはこちらから→ www.surveymonkey.com/s/NEXT34 photographs: mitsuhiro koyama（ p.02-03, p.10-11 ） art direction & design: masami furuta, yuka uchida（ opportune design ） science writing: momoyo matsuyama（ p.02-03, p.19 ） edition: yuko hashimoto 公式 Facebook ページ &Twitterもチェック! facebook.com/ThermoFisherJapan @thermofisherjp ●記載価格は2016年3月現在の価格です。●消費税は含まれていません。●価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじ めご了承ください。●最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の"製品価格と在庫の検索"でご確認いただけます。●研究 用にのみ使用できます。●診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。●記載の社名および製品名は、弊社または各社の商 標または登録商標です。●販売条件はこちらをご覧ください。www.thermofisher.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2016 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. 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