【研究報告】（自然科学部門） 食品成分アピゲニンのマイクロ RNA 抑制機構を介した 抗 C 型肝炎ウイルス効果の検討 大 野 元 子 東京大学大学院医学系研究科内科学専攻（消化器内科学） 博士課程 緒 イルス量を減らすことが確認されている6）。慢性 C 型肝 言 ポリフェノールは分子内にフェノール性ヒドロキシ 炎は治療法が進歩しつつあるものの、いまだに我が国の ル基をもつ植物性成分の総称で、多彩な生理学的作用を 肝癌の主要な原因であり、また抗ウイルス療法の治療効 持つことが知られているが、その作用機構の大部分は明 果はウイルス量によって規定されているという側面もあ らかにされていない。一方、microRNA は 20∼25 塩基 り、miR122 の機能調整・発現調整は肝臓関連疾病の管 程度の小分子 RNA で、現在ヒトで 2,000 種ほど報告され 理に有用な可能性がある。本研究ではこれまでに見出し ているが、ひとつの microRNA が複数の mRNA を標的 たアピゲニンの microRNA 合成・機能阻害効果の知見 として結合し、それらの遺伝子からの蛋白発現を負に制 を元に、miR122 の合成阻害を介した C 型肝炎ウイルス 御することで様々な生理機能を発揮することが近年明ら 増殖抑制効果について検証した。 1） かになってきた 。我々は microRNA が多彩な生理作用 を持つという点でポリフェノールと類似していることに 方法・結果 着目し、「ポリフェノールの持つ生理作用の多様性は、 1. アピゲニンは miR122 の産生を抑制する 多彩な生理作用をもつ microRNA の機能変化によって ヒト肝癌細胞株である Huh7 細胞にアピゲニンを添加 惹起されている可能性がある」という仮説を立ててこれ 後 5 日目の細胞中の成熟 miR122 発現量を RT-PCR 法で を検証した。その結果、ブロッコリー・パセリなどの緑 定量した。TRBP が関与しない microRNA の一つ let-7g 色野菜やカモミール茶に多量に含まれるポリフェノール を Control として用いたところ、let-7g の発現量は変化 の 中 の フ ラ ボ ノ イ ド 属 の ひ と つ ア ピ ゲ ニ ン が、 しなかったものの、miR122 はアピゲニン濃度依存的に microRNA の成熟過程に関与する TRBP というタンパク 有意な低下を認めた（図 1a）。また、Northern blotting のリン酸化を MAPK 経路依存性に抑制し、TRBP に依 でもアピゲニン存在下での miR122 の発現低下を確認し 存して合成される一群の microRNA の産生を低下させ た（図 1b）。 一 方、miR122 の 前 駆 体 で あ る miR122 その機能を抑制するということを見出した。その具体的 precursor はアピゲニン濃度依存的に増加しており（図 な効果として、耐糖能異常に関与することが報告されて 1c）、アピゲニンが precursor から miR122 への成熟の過 いた microRNA-103（miR103）2）に着目し、アピゲニン 程を阻害していると考えられた。 が miR103 の生成を抑制することによって耐糖能異常を 次に、miR122 のターゲット領域を 3′-UTR に持つルシ 改善する効果があることをマウスモデルで検証し報告 フェラーゼレポーターを細胞に導入し、miR122 の機能 3） し た 。 ア ピ ゲ ニ ン は TRBP を 介 し て 生 成 さ れ る をルシフェラーゼアッセイで評価した。この系において microRNA の一群の機能を抑制すると考えられるが、そ miR122 はルシフェラーゼの発現を抑制するが、アピゲ の中で microRNA-122（miR122）もアピゲニンによっ ニンの濃度依存的にルシフェラーゼ活性の上昇を認め、 て合成が阻害される microRNA のひとつであった。 アピゲニンが miR122 の機能を抑制していると考えられ た（図 1d）。また、miR122 のターゲット領域に変異を miR122 は肝細胞特異的に発現し、脂質代謝や鉄代謝 4） など肝臓の多彩な機能に関わる microRNA である とと 導入したレポーターではルシフェラーゼ活性の変化はな もに、C 型肝炎ウイルス（HCV）の複製を「正」に促す く、活性変化は miR122 の特異的な作用を反映している ことが示されており5）、実際に miR122 のアンチセンス と考えられた。なお、アピゲニン濃度は 5 μM まで上げ 核酸が小規模の短期臨床試験（Phase 2）で C 型肝炎ウ ても有意な細胞毒性を認めず、50 μM ではわずかに細胞 1 大 野 元 子 図 1 アピゲニンの miR122 産生抑制効果 数の低下がみられた（図 1e）。 2. アピゲニンは miR122 発現抑制を介して HCV 複製 を抑制する miR122 が HCV 複製に促進的に働くことから、アピゲ ニンが miR122 発現抑制を介して HCV 複製を抑制する という仮説を立て、これを検証した。この際、HCV レ プリコンによるレポーターコンストラクト（Huh7-Feo） を 持 つ Huh7-Feo 細 胞 を 用 い た。 こ の レ プ リ コ ン は、 HCV の 5′ IRES の下流にルシフェラーゼ遺伝子とネオマ イシン耐性遺伝子による融合遺伝子 Feo を持ち、細胞内 の HCV 複製をルシフェラーゼ活性によってモニターで きる（図 2a）。この細胞にアピゲニン添加後 5 日目にル シフェラーゼ活性を測定すると、アピゲニン濃度依存的 にルシフェラーゼ活性は有意に低下（すなわち HCV 複 図 2 アピゲニンの miR122 抑制を介した HCV 複製抑制効果 製の低下を示唆）しており、5 μM のアピゲニン処理後 では miR122 アンチセンスを導入したものとほぼ同程度 中の miR122 が増加していることを Western Blotting で の低下であった（図 2b）。Western Blotting でも同様に、 確認（図 2d）、アピゲニン添加によるルシフェラーゼ活 アピゲニンによるルシフェラーゼの発現抑制を確認した 性をみると、miR122 高発現細胞ではアピゲニン存在下 でもルシフェラーゼ活性低下を認めなかった（図 2e）。 （図 2c）。 以上より、アピゲニンは miRNA 発現抑制を介して HCV 次に、合成 miR122 の導入がアピゲニンの効果に拮抗 複製抑制効果を阻害すると考えられた。 するかどうかを調べた。まず合成 miR122 導入後の細胞 2 食品成分アピゲニンのマイクロ RNA 抑制機構を介した抗 C 型肝炎ウイルス効果の検討 して miR122 の成熟過程を阻害し、結果として miR122 が促進的に働く HCV 複製が抑制されると考えられる。 考 察 慢 性 C 型 肝 炎 の 治 療 に お い て は、 近 年 DAA 製 剤 （direct acting antiviral drug）の進歩により治療効果が 目覚ましく向上してきており、アピゲニンの HCV 複製 抑制効果がどれほど寄与できるかは不明である。しか し、DAA が高価であることから経済性・利便性の問題、 図3 また DAA 耐性株を持つ治療無効な患者などの問題も存 ア ピ ゲ ニ ン の HCV 複 製 抑 制 効 果 に 対 す る リ ン 酸 化 TRBP の拮抗効果 在している。我々の見出したこの知見により、例えばア ピゲニンと従来の治療を組み合わせるなど、アピゲニン 3. リン酸化 TRBP はアピゲニンの HCV 複製抑制効果 が HCV の制御に補助的な役割を果たすことができるか を阻害する もしれない。また、miR122 が脂質代謝にも関与してお アピゲニンの microRNA 産生抑制効果が TRBP リン り、miR122 の発現抑制がコレステロールを低下させる 酸化抑制によるという以前の実験結果を踏まえ、flag- 効果も示唆されることから、アピゲニンのサプリメント Tag 付き TRBP、および活性型であるリン酸化 TRBP の や補助食品の開発など、新たな予防法・補助治療法とし mimic（TRBP（SD） : TRBP のセリンをアスパラギン酸 て発展することも期待できる。 に置換）の発現コンストラクトを作成した。これらのコ 謝 ンストラクトを 293T 細胞に導入すると、共に同程度の 辞 発現を認めた（図 3a）。次に、レンチウイルスを用いて 本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益 TRBP および TRBP（SD）安定発現 Huh7-Feo 細胞株を 財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。 作成し、これらの安定発現株にアピゲニンを添加したと 文 ころ、TRBP（SD）発現株では miR122 の発現が有意に 高く、アピゲニン存在下でも miR122 発現は低下しな 献 D. P. Bartel: , 116, 281–297, 2004. M. Trajkovski, et al.: , 474, 649–653, 2011. M. Ohno, et al.: ., 3, 2553, 2013. A. Takata, et al.: ., 59, 187– 203, 2013. 5） C. L. Jopling, et al.: , 309, 1577–1581, 2005. 6） H. L. Janssen, et al.: ., 368, 1685–1694, 2013. 7） C. Shibata, et al.: , 462–463, 42–48, 2014. 1） 2） 3） 4） かった（図 3b）。また、ルシフェラーゼ活性（HCV レプ リコンの複製）の低下も認めなかった（図 3c）。つまり TRBP（SD）はリン酸化 TRBP の機能を持ち、アピゲ ニンの miR122 発現抑制作用をキャンセルしていると思 われた。 以上より、アピゲニンは TRBP のリン酸化抑制を介 3
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