アポトーシスの検出

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アポトーシスの検出
はじめに
アポトーシス（プログラム細胞死）は Fas（CD95）のシグナルや、薬剤や放射線による DNA の損傷、増殖因子の枯渇など
さまざまな要因により誘導されます。アポトーシスは DNA の断片化と核および細胞の形態変化に至る以前に、ICE ファミリー
プロテアーゼの活性化や、ミトコンドリア膜電位の低下などが認められることも明らかにされています。
アポトーシスをフローサイトメトリーで検出する方法として、各 DNA 染色による sub-G1 フラクションの検出や、TUNNEL（TdTmediated dUTP nick end labeling）法による断片化 DNA の検出などが知られています。これらはアポトーシスの分子機構に
おける中・後期のイベントを見るものです。今日では、この DNA 断片化よりも以前に起こる細胞膜の構造変化を検出する方法
が行われています。
ここでは、アポトーシスの初期段階を検出する Annexin V Kit の測定原理と使用方法のご紹介をいたします。また、断片化
DNA を測定する TUNEL 法の原理もご紹介します。
原理
【Annexin V 】
細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）と結合する蛍光標識 Annexin V と DNA に結合する PI や 7-AAD
（膜透過性がない）を用いてアポトーシス細胞を検出する方法です。
＊ここでは PI を使用した例をお示しします。
1. アポトーシスを誘導していない正常な状態の細胞は、細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）が存在して
います。また、細胞膜の損傷もないので PI は細胞内に取り込まれず核内 DNA とは結合しません（図.1 - ①）。
2. 細胞に Fas 抗体または薬剤などを作用させることにより、アポトーシスを誘導させます。
3. アポトーシスの初期の段階では、通常細胞膜の内側に存在する PS が細胞膜表面に露出してきます。この PS と Annexin
2+
V は Ca 存在下で結合します。この段階の細胞膜にはまだ損傷が起こっていないため、PI は細胞内に取り込まれず、核
内 DNA とは結合しません（図.1 - ②）。
4. 後期のアポトーシス細胞およびネクローシス細胞は、Annexin V と PI の両方に染まります（図.1 - ③）。
図.1 Annexin V 染色原理
① アポトーシス誘導前
核も PS も染まりません
：蛍光色素
② 初期のアポトーシス
PS が Annexin V と結合
：Annexin V
：PI
1
③ 後期アポトーシス(二次的ネク
ローシス)とネクローシス
核が PI に染まり、
PS が Annexin V と結合
：フォスファチジルセリン（PS）
アポトーシス誘導例
アポトーシスの誘導 ①
－Fas抗体によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞
試薬： Fas(CD95)抗体（IM1504）：in vitro で CD95 を発現している細胞株のアポトーシスを誘導します。
注： Fas 抗体(IM1504)の濃度は 500μg/mL です。
RPMI 1640 または DMEM
FCS
注： RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。
Ⅱ. 方法
Fas(CD95)抗体（IM1504 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞を、5×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
2. この培養細胞に対して Fas(CD95)抗体を 100ng/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
例：培養細胞 20mL Culture に、上記抗体を 4μL 加えます。
3. 37℃、CO2 5.0%で 4～8 時間インキュベートします。
（この反応時間の場合、20%～50%の細胞にアポトーシスが誘導されます。）
＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。
アポトーシスの誘導 ②
－薬剤（Actinomycin D）によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞または HL-60 細胞
試薬： Actinomycin D-Mannitol （SIGMA #A 5156 など）
ストック溶液：SIGMA #A5156 を Actinomycin D-Mannitol が 1mg/mL になるように蒸留水（無菌にしたもの）に溶解します。
（溶解したものは、遮光をして 4℃に保存します。）
RPMI 1640 または DMEM
FCS
注：RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。
Ⅱ. 方法
Actinomycin D-Mannitol（SIGMA #A 5156 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞または HL-60 細胞を、5×105cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
2. この培養細胞に Actinomycin D-Mannitol（上記ストック溶液）を 2μｇ/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
例：培養細胞 20mL Culture に上記ストックを 40μL 加えます。
3. 37℃、CO2 5.0%で 6～8 時間インキュベートします。
（この反応時間で、60%～80%の細胞にアポトーシスを誘導します。）
＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。
2
アポトーシスの誘導 ③
－薬剤（Mitomycin C）によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞
試薬： Mitomycin C (SIGMA #M 4287 など)
RPMI 1640 または DMEM
FCS
注：RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。
Ⅱ. 方法
Mitomycin C(SIGMA #M 4287 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞を、2×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
2. この培養細胞に Mitomycin C を 1μg/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
3. 37℃、CO2 5.0%で 12 時間インキュベートします。
（この反応時間で、40%～50%の細胞にアポトーシスを誘導します。）
＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。
3
2 カラー染色例
Annexin V Kit
【AnnexinV-FITC kit (PI)、Annexin V-FITC/7-AAD Kit】の場合
アポトーシスの特徴として、良く知られている DNA の特殊なフラグメント化の前に、細胞膜の構造変化が起こります。
通常、膜の内側に存在する膜リン脂質フォスファチジルセリン（PS）は、膜の構造は保ったままで膜の外部に露出してきます。
露出した PS と Annexin V は、カルシウムイオンの存在下で結合します。アポトーシスの起こった細胞では、Annexin V-FITC の
蛍光は観察されますが、細胞膜の構造は保たれているため、PI/7-AAD は膜を通過できず、DNA とは結合しません。
一方、アポトーシスの後期やネクローシスの場合には、細胞膜の構造が崩壊しているため、Annexin V-FITC と PI/7-AAD の
両方の蛍光が観察されます。また、正常な細胞はいずれの試薬とも反応せず陰性となります。
Ⅰ. 準備
器具：プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
FCM 用サンプルチューブ
（PN :6199306、A26428、2523749 など）
試薬： Annexin V-FITC Kit (PI)
Annexin V-FITC/7-AAD Kit
（IM2375 20T または IM3546 200T）
（IM3614 150T）
Ⅱ. 染色方法の流れ：2 カラー染色
【Annexin V-FITC Kit】
20T
アポトーシスの誘導
メディウムまたは PBS を加え 500g 4℃ 5 分間遠心分離、上清除去
（注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異なります
細胞の回収、洗浄
バインディング
バッファ－に懸濁
【AnnexinV-FITC/7-AAD Kit】
200T
150T
2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導
5x106～1x107cells/mL になるように
氷中で冷却した 1x バインディング
5
6
5x10 ～5x10 cells/mL になるように、氷中で冷却した
1x バインディングバッファ＊で再懸濁します
サンプルの染色
サンプル 100μL
Annexin V-FITC 5μL
PI 2.5μL を添加
インキュベーション
暗所、氷上、10 分間
バインディング
バッファ－を加える
バッファ＊で再懸濁します
サンプル 100μL
Annexin V-FITC 1μL
PI 5μL を添加
サンプル 100μL
Annexin V-FITC 10μL
７-AAD 20μL を添加
暗所、氷上、15 分間
400μL の 1x バインディングバファ＊を加えます
FCM で測定
FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行い測定します
＊バインディングバッファの代わりに、メディウムに CaCl2（終濃度 1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
Ⅲ. セットアップに必要なサンプル
① ： PI 単染色サンプル
② ： Annexin V-FITC 単染色サンプル
③ ： Annexin V-FITC と PI 染色サンプル(測定サンプル)
4
解析の流れ
解析例
1.
【AnnexinV-FITC Kit(PI)】の場合
プロット図の作成
SS / FS のプロット図と生細胞集団を囲むＡゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定をした FL1 / FL4 のプロット図
とゲートなしの FL1 / FL4 のプロット図の二つを作成します。
SS INT LIN
2.
Ungate
PI(FL4)
A Gate
PI(FL4)
FS INT LIN
Ungate
Annexin V-FITC（FL1）
Annexin V-FITC（FL1）
ネガティブコントロールサンプル
ネガティブコントロールサンプルは PI で単染色したサンプルを用います。Ungate のプロット図で、PI 陽性細胞の感度設定を
行います。また、この PI 陽性サンプルで、FL1 側のネガティブ領域を決定します。
PI(FL4)
（注）：PI を加えると PI と細胞の非特異的な結合などによりバックグランドが上がります。PI を添加していないサンプルを
用いて FL4 の感度調整を行た場合、PI を添加したサンプルのネガティブ（生細胞）の集団が FL4 軸側に浮き上がっ
た状態になりますので注意してください。
Ungate
Annexin V-FITC（FL1）
FL4(PI)から FL1 への蛍光補正
ネガティブコントロールサンプル(PI 単染色)を用いて、FL4 から FL1 への蛍光補正を行います。蛍光補正は、PI 陽性細胞が
確認しやすい Ungate の FL1 / FL4 プロット図で行います。
Ungate
蛍光補正前
蛍光補正後
PI(FL4)
Ungate
PI(FL4)
3.
Annexin V-FITC(FL1)
Annexin V-FITC(FL1)
5
FL1(FITC)から FL4 への蛍光補正
AnnexinV-FITC で単染色されたサンプルで、FL1 から FL4 への蛍光補正を行います。
ネガティブコントロールサンプルと違い PI が添加されていないため、PI の非特異的な反応が大きいサンプルでは FL1 の軸
にへばり付いた状態になることがあります。その場合、正確は蛍光補正が行えない事があります。
その時には Annxin V-FITC、PI 共に染色したサンプルを用い、A Gate が設定されたデータで蛍光補正を行ってください。
A Gate
A Gate
蛍光補正前
蛍光補正後
PI(FL4)
PI(FL4)
4.
Annexin V-FITC(FL1)
5.
Annexin V-FITC(FL1)
サンプル測定例
A Gate
PI(FL4)
B2:
アポトーシス後期(二次的ネクローシス細胞)、
もしくはネクローシス細胞の領域
B4:
初期のアポートーシスの領域
Annexin V-FITC(FL1)
B3:
アポトーシスを起こしていない、生細胞の領域
サンプル測定例： Jurkat 細胞 5x106 cells/mL に対し、Actinomycin D-Mannitol を終濃度 2μｇ/mL になるように加え、
6 時間インキュベートした後に測定したデータです。
6
3 カラー染色例（細胞表面抗原とアポトーシス検出）
Annexin V Kit
【 Annexin V-Biotin Kit】の場合
Annexin V-Biotin を使用することにより、Annexin V-Biotin と結合する蛍光色素を自由に選択することが出来ます。ここでは表面
抗原を 2 つの蛍光色素て染色し、Annexin V-Biotin をストレプトアビジン（SA）が修飾された蛍光色素で染色する 3 カラー染色方
法をご紹介します。
Ⅰ. 準備
器具：プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
FCM 用サンプルチューブ
（PN :6199306、A26428、2523749 など）
試薬： Annexin V-Biotin Kit
蛍光標識ストレプトアビジン
蛍光標識抗体
（IM2585 20T または IM2586 200T）
Ⅱ. 染色方法の流れ：3 カラー染色
アポトーシスの誘導
【Annexin V-Biotin Kit】
20T/200T
2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導
細胞の回収、洗浄
メディウムまたは PBS を加え 500g 4℃ 5 分間遠心分離、上清除去
（注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異なります
バインディング
バッファ－に懸濁
105～106cells/mL になるように、氷中で冷却した 1x バインディングバッファ＊で再懸濁します
サンプルの染色
サンプル 500μL
Annexin V-Biotin 5μL を添加
インキュベーション
氷上、5 分間
遠心、洗浄
＊
1x バインディングバッファを 500μL 加えて遠心分離、上清除去を 2 回行います
再懸濁
1x バインディングバッファ 100μL で再懸濁します
蛍光標識二次試薬
蛍光標識抗体の添加
蛍光標識ストレプトアビジン（PC7 標識-ストレプトアビジンなど）を規定量添加
細胞表面抗原を同時染色する場合は、蛍光標識抗体を規定量添加
インキュベーション
暗所、室温で 30 分間
遠心、洗浄
＊
1x バインディングバッファを 500μL 加えて遠心分離、上清除去
再懸濁
＊
1x バインディングバッファ 500μL で再懸濁します
FCM で測定
FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行い測定します
＊バインディングバッファの代わりに、メディウムに CaCl2（終濃度 1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
7
3 カラー（細胞表面とアポトーシス）解析の流れ
3 カラー染色解析例
今回使用した 3 カラー染色サンプルは CD5-FITC、CD1a-PE、Annexin V-Biotin/SA-PC7 を用いて測定しました。
1.
プロット図の作成
SS / FS のプロット図の感度調整を行い、Ａゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定がされた各パラメータのプロット図を
作成し感度調整を行います。
Ungate
FITC(FL1)
FITC（FL1）
SS INT LIN
2.
A Gate
PE(FL2)
FS INT LIN
A Gate
Annexin V-PC7（FL5）
FL1(FITC)から FL2(PE)、FL1(FITC)から FL5(PC7)への蛍光補正
FL1(FITC)から FL2(PE)、FL1(FITC)から FL5(PC7)への蛍光補正を FITC 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate
A Gate
蛍光補正前
蛍光補正後
蛍光補正前
蛍光補正後
PC7(FL5)
PE(FL2)
FITC（FL1）
FITC（FL1）
FITC（FL1）
FITC（FL1）
FL2(PE)から FL1(FITC)、FL2(PE)から FL5(PC7)への蛍光補正
FL2(PE)から FL1(FITC)、FL2(PE)から FL5(PC7)への蛍光補正を PE 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate
A Gate
A Gate
蛍光補正前
蛍光補正後
蛍光補正前
蛍光補正後
PE（FL2）
PC7(FL5)
FITC(FL1)
PC7(FL5)
A Gate
FITC(FL1)
3.
PC7(FL5)
A Gate
PE(FL2)
A Gate
PE（FL2）
PE（FL2）
8
PE（FL2）
4.
FL5(PC7)から FL1(FITC)、FL5(PC7)から FL2(PE)への蛍光補正
FL5(PC7)から FL1(FITC)、FL5(PC7)から FL2(PE)への蛍光補正を PC7 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate
A Gate
A Gate
蛍光補正前
蛍光補正後
蛍光補正前
蛍光補正後
PC7（FL5）
PE(FL2)
PC7（FL5）
PC7（FL5）
PC7（FL5）
サンプル測定例
Ungate
A Gate
A Gate＆B Gate
CD5-FITC
Annexin V-PC7
CD11a-PE
FS INT LIN
5.
PE(FL2)
FITC(FL1)
FITC(FL1)
A Gate
SS INT LIN
OverLay Plot
：アポトーシス誘導なしサンプル
：アポトーシスを誘導したサンプル
Jurkat 細胞に対して、Actinomycin D-Mannitol を終濃度
2μｇ/mL になるよに加え、8 時間インキュベーションした後
に測定したデータです。
Annexin V-PC7
9
接着細胞染色例
Annexin V Kit
【 Annexin V-Biotin Kit】の場合
Annexin V-Biotin を使用することにより、PS と Annexin V の反応を好きな蛍光色素を用いることが出来ます。ここでは接着細胞
の染色方法をご紹介します。
Ⅰ. 準備
器具： 24wel プレート
ゴム製のスクレーパー
FCM 用サンプルチューブ
試薬： Annexin V-Biotin Kit
蛍光標識ストレプトアビジン
（PN :6199306、A26428、2523749 など）
（IM2585 20T または IM2586 200T）
Ⅱ. 接着細胞染色方法の流れ
アポトーシスの誘導
Annexin V-Biotin の添加
インキュベーション
細胞の回収
【Annexin V-Biotin Kit の場合】
20T/200T
2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導（24well プレートで培養した場合）
細胞を培養している培養液 500μL に対し、5μL の Annexin V-Biotin を加えます
2+
（注）培地 Ca の濃度を保つために終濃度 1.5mM になるようにバインディングバッファか CaCl2 を加えます。
5 分以上反応させます。
＊Annexin V-Biotin は 42℃以上で不安定になるので注意してください。
培養液中の細胞
プレートに接着している細胞
プレートから剥がれた細胞を含む溶液を回収
プレートに接着している細胞を
＊
1x バインディングバッファ（適量）で 2 回リンス
1x バインディングバッファ＊を適量（500μL 位）加
えて遠心分離、上清除去を 2 回
（注）トリプシンや EDTA を用いたハーベスト方法は細
（注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異な
胞と Annexin V-Biotin の結合を弱め、PS を細胞表
ります
面に誘導する可能性があります
スクレーバで細胞を回収
プレートから剥がれた細胞溶液とプレートに接着していた細胞をまとめます
遠心し 105～106/mL の濃度になるように、1x バインディングバッファ＊で懸濁
蛍光標識二次試薬と
PI の添加
蛍光標識ストレプトアビジン（FITC 標識ストレプトアビジンなど）を規定量添加
PI を終濃度 2.5μg/mL になるように加えます
インキュベーション
暗所、氷上で 15 分間インキュベート
FCM で測定
FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行って測定します
＊バインディングバッファの代わりにメディウムに CaCl2（終濃度 1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
10
【MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit （TUNEL 法）】
原理
MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Dirrect /Ⅱは TUNEL 法により、DNA の断片化を指標として、アポトーシスによる細胞死を
細胞個々に検出する試薬です。細胞内の核における断片化 DNA の 3’-OH 末端部分に fluorescein-dUTP を結合させることによ
り、断片化 DNA に特異的な蛍光を検出できます。
図.2
TUNEL法染色原理
■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct
dUTP が FITC 標識されているため、染色の工程が少なく、簡便に染色できます。
FCM 測定
核の断片化
DNA の 3’-OH 末端部
に FITC-dUTP が結合
■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ
dUTP が Biotin 標識されているため、dUTP の検出をするための蛍光色素を自由に選択することができ、好きな染色
の組み合わせを選択できます。
FCM 測定
核の断片化
DNA の 3’-OH 末端部に
Biotin-dUTP が結合
DNA に接合した Biotin-dUTP
と FITC-Avidin が結合
MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct, MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱは株式会社医学生物学研究所（MBL）で取り扱ってます。
MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct ：MBL code 8445、MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ：MBL code 8441
■MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct
FCM 解析データ
Jurkat 細胞を抗ヒト Fas 抗体(クローン CH-11)でアポトーシスを誘導しました。抗体添加２時間後、及び、４時間後に細胞を回収
し、MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct で染色し、フローサイトメーターで測定しました。
・抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 2 時間後データ
・抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 4 時間後データ
抗ヒトFas抗体添加濃度陽性率(%)
Untreated
6.2%
20 ng/mL
45.4%
200 ng/mL
68.7%
2,000 ng/mL
70.2%
抗ヒトFas抗体添加濃度陽性率(%)
Untreated
6.2%
20 ng/mL
8.5%
200 ng/mL
18.3%
2,000 ng/mL
24.5%
データ提供：株式会社医学生物学研究所（MBL）
11
参考文献
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辻本賀英、⼑祢重信、⼭⽥武『新アポトーシス実験法-基本操作と最先端の解析法-』羊土社 84-105
改訂履歴
Ver1.0 2006 年 12 月
Ver1.1 2013 年 2 月
CE1009 1302

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