Helicobacter trogontum の分泌蛋白 抄 訳 林 俊治（自治医科大学 感染免疫学講座 細菌学部門） The Secretome of Helicobacter Trogontum Trogontum Nadeem O. Kaakoush,* Andrea Sirianni,* Mark J. Raftery† and Hazel M. Mitchell* *School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, The University of New South Wales, Sydney, NSW, 2052, Australia, †Biological Mass Spectrometry Facility, The University of New South Wales, Sydney, NSW, 2052, Australia 要 約 背景：Helicobacter trogontum（H. trogontum ）は腸管や肝臓における病原体であると推定されている。 この細菌は IL-10 ノックアウトマウスに感染し、重篤な臨床症状を伴った盲腸結腸炎を起こす。 対 象 と 方 法：H. trogontum の 基 準 株 で あ る LRB 8581 の 病 原 性 の 調 査 を 行 った。 具 体 的 に は、 H. trogontum の分泌蛋白群の特徴を質量分析によって解析した。さらに、走査型電子顕微鏡を用いて H. trogontum の宿主細胞に対する付着性および侵襲性を観察した。 結果：本研究において 104 の蛋白が同定され、これらは分泌されているものと生物情報学的に予想され た。これらの蛋白を機能別に分類してみると、菌の運動に関与する蛋白、病原性に関与する蛋白、宿主の 体内に定着する際に役立つ蛋白、タイプⅥ分泌機構に関与する蛋白などが見つかった。電子顕微鏡を用い た研究では、H. trogontum が自分の鞭毛と宿主細胞の微絨毛の相互作用によって細胞に付着することが判 明した。さらに、宿主細胞の細胞膜に襞を作り、細胞に傷害を与えることも判明した。 結論：本研究によって、H. trogontum がヒトの細胞に付着し傷害を与える可能性をもつことが判明した。 さらに、本菌の分泌物が病態形成に関与することが判明した。 キーワード：Helicobacter trogontum 、分泌蛋白、タイプⅥ分泌機構、付着、侵襲 対象と方法 菌株およびその培養 アミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）で電気泳動 した後、クマシーブリリアントブルーで染色した。 本 研 究 で は ラット の 結 腸 か ら 分 離 さ れ た ゲルから蛋白のバンドを切り出し、その蛋白を切 Helicobacter trogontum （H. trogontum ）LRB 断し、複数のポリペプチドの断片にした。このポリ 8581 を被験菌株として用いた。ウマ血液寒天培地 ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（HPLC） を用いて、この菌株を 37℃微好気環境で 72 時間培 で分取し、質量分析によって解析した。 養した。H. trogontum の分泌する蛋白を解析する 実験では、サイクロデキストリンを添加した brainheart infusion 液体培地を用いて、上記の菌株を培 養した。 生物情報学的解析 Helicobacter bilis の ゲノム情報を参考にして、 H. trogontum が分泌する蛋白の生化学的性状や機 能などを推測した。 SDS-PAGE および質量分析 上記の菌株が分泌した蛋白を SDS- ポリアクリル © 2013 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 18: 316-320 34 me specificble, and the itive signifiate any false r more pepe considered ns, BLASTp e of Helicobphylogenetidicted using dk/services/ ver available meP/). The he biochem. No: HTB-37) al essential C, Australia) response to oxidative stress or redox reactions, 11 profoundinvolved betweenin nonclassically teins motility, threesecreted proteins (SecretomeP) involved in and classically proteinsinvolved (SignalP),inwhich indivirulence, and secreted three proteins the T6SS cated that H. trogontum, like H. H. pullorum, relies mainly (Table 1), which indicated that trogontum contained on nonclassical secrete proteins. factors that maymechanisms enable it to to cause disease. Twenty-two Functional classification of the and 104 present secretedinterestproteins proteins had unknown functions identified many known to characterization. be involved in bacing candidates forproteins future functional Of the proteins involved in motility, most were related to kDa the flagellar 1 apparatus2 of the bacterium (Table 1). This can be explained by the fact that H. tro209 gontum is 124 motile by means of tufts of 3–7 bipolar 80 sheathed flagella [2], thus making it likely that the sec49.1 retome analysis would identify these proteins. The three virulence proteins comprised a fibronectin 34.8 domain-containing protein, IceA and an S-layer RTX protein. The presence of specific iceA alleles in Helicob28.9 acter pylori has been associated with the formation of peptic ulcers 20.6[11], and this has been confirmed in a recent meta-analysis [12]. The fibronectin domain-containing protein and the S-layer RTX protein have been identified in7.1 the secretome of C. concisus [8], suggesting that these proteins may contribute to virulence mechanisms that are common among Campylobacterales. Of 1particular interest, was the identification of three Figure of the secretome Helicobacter trogontum LRB 図 1．H. SDS-PAGE trogontum LRB 8581 of の分泌蛋白を SDS-PAGE proteins belonging to the T6SSprotein within the(lane secretome 8581. Helicobacter trogontum secreted 2) stained で電気泳動したもの。レーン 2 が H.bands trog ontum の分 fraction of H.Brilliant trogontum, with Coomassie Blue. which were similar to those 泌蛋白をクマシーブリリアントブルーで染色したもので recently detected in the secretome of H. pullorum [1]. ある。 The T6SS has been implicated in the pathogenesis of a range of bacteria including Escherichia coli and Salmonella 317 Typhimurium [13,14]. Moreover, through structural 走査型電子顕微鏡 threading and 3D-BLAST searches, we recently proposed that H. 培 pullorum T6SS may あ ら か the じめ 養して おい たinteract Caco-2with 細 胞host に endocytic vesicles to facilitate entry into the host cells H. trogontum 8581 を加え、6 時間反応させた [1]. Given this, LRB it is possible that the H. trogontum T6SS may also employ this mechanism of action for its patho後、細胞およびそれに付着している細菌を走査型 電子顕微鏡を用いて観察した。 ence, H. trogontum was observed to invade into host cells (Fig. 2D–F), inducing a “membrane ruffling”-like effect on the host cell membrane (Fig. 2E). This process appeared to result in microvilli degradation (Fig. 2E) and cellular damage (Fig. 2F). Moreover, H. trogontum is likely to employ a paracellular mechanism of invasion as の分泌蛋白 it was observed inHelicobacter areas aroundtrogontum the tight junctions of A B C D E F Figure 2 Helicobacter LRB は、自分の鞭毛と宿主細胞 8581 adheres to and invades 図 2．H. trogontumtrogontum LRB 8581 the Caco-2 cell line via a flagellum–microvillus interaction. Infection of の微絨毛の相互作用を介して Caco-2 細胞に結合し、細 Caco-2 胞 cells 8581 was forLRB 6 hours. Panels に with 傷 害H.をtrogontum 与 え る。LRB H. trogontum 8581 の (A–C): the flagellum was observed 6 to時間かけて行った。写真 adhere to the top of the microCaco-2 細胞への感染は A〜 villus (indicated by arrows) allowing it to anchor onto the intestinal C：鞭毛が微絨毛の先端に付着するのが観察される（矢 epithelial cell. Panels (D–F): Following initial adherence, H. trogontum 印部分）。これが腸管上皮細胞への錨の役割を果たして LRB 8581 penetrates into the host cell membrane (panel D), inducing いる。写真 D 〜 F：細胞に結合した後、H. trogontum a “membrane ruffling”-like effect on the host cell membrane (panel E), LRB 8581 は宿主細胞の細胞膜を貫通する（写真 D）。 microvilli degradation (panel E), and significant cellular damage (panel F). そして、細胞膜に襞を作り（写真 E）、微絨毛が劣化し （写真 E）、明らかな細胞傷害が起こる（写真 F）。 319 © 2013 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 18: 316–320 結果と考察 H. trogontum はマウスに盲腸結腸炎を起こす菌 Helicobacter pylori の IceA は潰瘍の形成に関連し であるが、その病態形成メカニズムは不明である。 て い る 可 能 性 が あ る。Fibronectin domain- 我 々はこの 菌 が 分 泌 する 蛋 白 の 解 析 を 行 った containing 蛋 白 と S-layer RTX 蛋 白 は （図 1）。これらの蛋白は本菌の病原性に関与してい Campylobacter concisus（C. concius ）の分泌蛋白 る可能性がある。本研究において 104 の蛋白が分 として同定されたものであり、病原性への関与が示 泌されていることを確認した。 唆されている。 これらの蛋白を機能別に分類したところ、11 の H. trogontum の分泌蛋白の中で特に興味深いの 蛋白は酸化ストレスや酸化還元反応に対する反応 は、タイプⅥ分泌機構に関与する 3つの蛋白である。 に関連していた。また、別の 11 の蛋白は運動性に、 タイプⅥ分泌機構と Helicobacter の病原性の間に 3 つの蛋白は病原性に関連していた。この結果は は密接な関係がある。したがって、これらの蛋白は H. trogontum が病原性をもつことを示唆している。 H. trogontum の病原性に関与している可能性もあ ただし、22 の蛋白の機能は不明であった。 る。 運動性に関連する蛋白のほとんどは本菌の鞭毛 H. trogontum の分泌蛋白の中から病原因子を同 を作るのに必要な蛋白であった。病原性への関与 定した結果に基づき、本菌が Caco-2 細胞に変化 が 疑 わ れ る 3 つ の 蛋 白 は、Fibronectin domain- を与えるメカニズムの解析を走査型電子顕微鏡で containing 蛋白、IceA、S-layer RTX 蛋白であった。 行った。菌と細胞を 6 時間反応させた後に観察す 35 ると、まず鞭毛が微絨毛に付着することが判明し の菌が別の細胞傷害メカニズムをもっていることも た（ 図 2A 〜 C）。 付 着 に 続 き、H. trogontum が 示唆される。同様の現象は Campylobacter jejuni 、 細胞に傷害を与える様子が観察された（ 図 2D 〜 C. concisus 、Helicobacter pullorum でもみられる。 F）。この傷害の過程は微絨毛の劣化（図 2E）およ 本研究によって H. trogontum がヒトの細胞に付 び細胞そのものの傷害（ 図 2F）という形で観察さ 着し傷害を与えることが判明した。また、本菌が れる。さらに、H. trogontum が Caco-2 細胞のタイ 分泌する因子は本菌の病原性に関与する可能性が トジャンクションの周辺に観察されることから、こ ある。 36 Helicobacter trogontum（H. trogontum ）が 分 一方、本論文 の 著者 らは H. trogontum が 腸管粘膜 泌する蛋白を詳細に解析した研究である。著者らは の上皮細胞に与える影響について電子顕微鏡で詳細 本菌が分泌する蛋白を多数同定し、それらの蛋白が に解析している。その結果、本菌が腸管上皮細胞に付 病原性に関与する可能性について考察している。ただ、 着し細胞に傷害を与えることが明らかとなっている。 他の Helicobacter がもつ蛋白との比較から考察して H. trogontum は、その宿主域や病原性について、今 いるだけなので、推論の域を出ない考察となっている。 後さらに研究していく価値のある菌種であろう。
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