シークエンシングワークフロー 研究用 ライブラリー調製 サンプル 調製 末端修復 エンドポイントライブラリー増幅 A-TAILING アダプター ライゲーション サイズセレクション & サイズ確認 または リアルタイムライブラリー増幅 illumina社用 ライブラリー調製キット KAPA HyperPlus Kit “ Evolved ／ 進化版 ” 断片化装置フリー 自動化に適したワークフロー 1ng∼1μgで自在のDNAサンプルインプット量 KAPA HyperPrep Kit FFPEなどの微量DNAサンプルからの ライブラリー調製に最適“1ng∼” ハンズオン・タイムの劇的な短縮 ライブラリー 定量 クラスター 増幅 シーク エンシング KAPA HyperPlus Kit KAPA HyperPlus Kit illumina社用ライブラリー調製キット “ Evolved ／ 進化版 ” KAPA HyperPlus キットは、物理的な断片化と同等レベルのバイアスの少ない 新開発DNA断片化酵素と、1本のチューブ内で行えるシンプルでスリムなワークフロー によって、業界を一歩リードするライブラリー作製効率の高さを実現しました。 • 断片化装置フリー • 約2.5時間での“DNA断片化とライブラリー調製” • 1ng ∼1μg で自在のDNAサンプルインプット量 • 限界まで減らしたビーズ精製ステップ • PCRフリーのワークフローが可能に • 増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上 • 自動化に最適 2 断片化装置フリー。自動化に適したワークフロー • FFPEのような困難なサンプルも含め、幅広 いDNAタイプとインプット量に対応 • ヒトエキソームや微生物の全ゲノムシーク エンスなど、多様なアプリケーションに適 用可能 1本のチューブ • チューブ1本でのワークフローによりDNA 断片化とライブラリーの作製が約2.5時間 で可能 C社 超音波破砕機 ＋ KAPA Hyper Prep Ⅰ社 キットN KAPA HyperPlus Kit 合計時間：∼2.5時間 合計時間：∼2.5時間 合計時間：∼3.5時間 断片化 （10∼45分） タグメンテーション 断片化 末端修復およびAテーリング （30分） ビーズ精製 末端修復およびAテーリング アダプターライゲーション （15分） ライブラリー増幅 （必須） アダプターライゲーション ビーズ精製 （30分） ビーズ精製 ビーズ精製 ライブラリー増幅 （オプション） （30分） ライブラリー増幅 （オプション） ビーズ精製 （30分） ビーズ精製 1本のチューブ KAPA HyperPlusキットは、バイアスの少 ない酵素による断片化を取り入れたことで、 「自動化が難しく、高価な装置によるDNAの 物理的な断片化」の必要がありません。 サイズ調節が可能で再現性の高い“酵素による断片化” • 断片化時間の違いによりライブラリーインサートサイズを150∼800 bpで調節可能 • インサートサイズは、さまざまなGC含量とDNAインプット量において再現可能 ライブラリー断片サイズ分布 再現性ある断片サイズ 高 10ng 15分 100ng 15分 600 10ng 30分 150 100ng 30分 100 50 % GC 200 700 平均サイズ（bp） 蛍光（シグナル強度） 800 500 400 300 B. pertussis 50ng E. coli 10ng E. coli 50ng Human 10ng Human 50ng C. difficile 10ng C. difficile 50ng P. falciparum 50ng 低 200 0 B. pertussis 10ng 100 35 100 150 200 300 400 500 600 1000 2000 10380 bp 0 5分 15 分 45 分 断片化時間 DNAサンプルインプット量やサイズに依存しない、再現性ある ライブラリー断片サイズ分布 設定した断片化パラメータで、GC含量の異なる複数種のサンプルで あっても、一貫したライブラリーインサートサイズが得られます。 HyperPlusキットを使用して、インプット量の異なる大腸菌ゲノムDNAを 37℃で15分または30分断片化。ライブラリー増幅後にSPRI ®ビーズで 1回精製した後、サンプルをAgilent High Sensitivity DNA Assay TM キットで解析しました。 10ngまたは50ngの百日咳菌（GC 68％）、クロストリジウム ディフィシ ル（GC 29％）、大腸菌（GC 51％）、熱帯熱マラリア原虫（GC 20％）、 ヒトゲノムDNAを5分、15分、45分で断片化。得られたインサート断片の 平均サイズはそれぞれ∼700、∼350、∼200bp。断片化反応は37℃ で実施。 3 KAPA HyperPlus Kit 優れたライブラリー収量そして品質 インプットDNAをシークエンス可能なアダプター ライゲーション済みのライブラリーに変換する割 合（変換率％）は、ライブラリー作製の主要な測 定基準ですが、結局はライブラリーの多様性と品 質を決定づけるものです。 変換率範囲 変換率％ 100 • プロトコルの最適化による優れた変換率 • 幅広いDNAインプット量で優れた性能 90 HyperPlus 80 C社 超音波破砕機 + Hyper Prep C社 超音波破砕機 +Ⅰ社ライブラリー調整キット 70 60 50 • 高いライブラリー収量によりPCRフリーのワー クフローが可能（最低50ngの初発量から） 40 30 20 10 0 1 µg 100 ng 10 ng 1 ng インプット量 多 低 変換率はライブラリー調整キットに大きく左右されます。 HyperPlusで調製したライブラリーと、C社 超音波破砕機で断片化したDNAをⅠ社ライブ ラリー調整キットおよびHyper Prepで調整した場合とを比較しました。HyperPlusは一 体化したワークフローにより、インプットDNAからアダプターライゲーション済みライブ ラリーへの変換率が高くなっています。変換率は高インプット・低インプットいずれの場 合も、KAPA HyperPlusによるものが一番高くなっています。 上質なシークエンス結果を可能に • 高い変換率により少ない増幅サイクルと低い複製率（Duplication Rate）を実現 • 優れたライブラリー多様性とより均一なシークエンスカバー率により、低頻度の突然変異を高い信頼性をもって検出 9 C社 超音波破砕機 + Hyper Prep 8 HyperPlus SNP（一塩基多型）の検出感度 0.040 7 95 5 4 標的断片 6 90 C社 超音波破砕機 + Hyper Prep 0.035 HyperPlus 0.030 Ⅰ社 キットN 0.025 0.020 0.015 3 85 2 0.010 0.005 1 80 0 gDNA FFPE 低い複製率（Duplication Rate） HyperPlusまたはC社 超音波破砕機とHyper Prepを使ったエキソームシークエンス実験に よる複製率です。50ngのヒトゲノムDNAまた は50ngのFFPE DNAからライブラリーを調 製し、Nimblegen SeqCap EZ HGSC VCRome パネルで取り込みました。 4 シークエンスカバー率の均一性 100 (%) Duplication Rate（％） 複製率（Duplication Rate） C社 超音波破砕機 HyperPlus + Hyper Prep Ⅰ社 キットN 一塩基多型（SNP）検出感度が優れた シークエンス品質を示しています。 インプット量50ng、標準的な回収手順でラ イブラリーを調製してNimblegen SeqCap EZ HGSC VCRomeパネルで取り込みまし た。SNPは、初期設定、一塩基あたりの最小 カバー深度カットオフ値10のLoFreqを使っ て回収。感度（真陽性率）は、真陽性を真陽 性と偽陰性の合計で割った割合として算出。 分析したSNP総数は25,000以上。 0.000 0x 20x 40x 60x 80x 100x Depth of Coverage シークエンスカバー率の均一性の比較 すべてのライブラリーデータは、リード数を等し くするためにダウンサンプリングを行いました。 HyperPlusまたはC社 超音波破砕機＋ HyperPrepとR社 キャプチャーキットで調整さ れたライブラリーと、Ⅰ社のキットN とキャプ チャーキットで調整されたライブラリーを比較。 Ⅰ社 キットN のライブラリーは広がったカバー 率分布を示しましたが、C社 超音波破砕機と HyperPlusのカバー率分布は類似しています。 鋭いピークで裾が小さくより均一なカバー率で あることを示しています。 最小バイアスのシークエンスカバー率 • タグメンテーションや他の酵素による断片化方法に比べて、少ないシークエンスバイアス • 物理的断片化と同等の性能 • 少ないバイアスがより均一なシークエンスカバー率の実現とシークエンス費用の削減 E. coli (51% GC) 200 1.5 150 1.0 100 0.5 0.0 10 50 15 20 25 30 35 40 45 1.1 250 1.0 200 0.9 150 0.8 100 0.7 0.6 25 0 50 ウインドウ数（×103） 2.0 50 30 GC% of 100 Window Bins C社 超音波破砕機 + HyperPrep 1.8 300 35 40 45 50 55 60 65 Ⅰ社 キットN 250 1.4 200 1.2 1.0 150 0.8 100 0.6 0.4 50 0.2 0.0 45 0 70 GC% of 100 Window Bins HyperPlus 300 1.6 Normalized Coverage 250 Normalized Coverage 2.5 B. pertussis (68% GC) 1.2 ウインドウ数（×103） Normalized Coverage 300 ウインドウ数（×103） C. difficile (29% GC) 3.0 50 55 60 65 70 75 80 0 85 GC% of 100 Window Bins N社 断片化酵素 + N社 キットN GCバイアスの比較 クロストリジウム ディフィシル（左）、大腸菌（中央）、百日咳菌（右）のGCバイアスを100bp binsの標準GC含量を計算して評価。 Picard Collect GC Bias Metricsを使用し、C社 超音波破砕機 + HyperPrep、HyperPlus、Ⅰ社 キットN、N社 断片化酵素 + N社 キットN のワーク フローに対するNormalized Coverageをbins上にプロットしました。ライブラリーは1ngのインプットDNAで調製。シークエンスバイアスがないので、 すべてのbinsが均等に表されることになり、Normalized Coverageの1上に集中した水平分布で示されます。 Cat.No. 包装単位 KK8510 KAPA HyperPlus Kit 8回用 KK8512 KAPA HyperPlus Kit 24回用 KK8514 KAPA HyperPlus Kit 96回用 KK8511 KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） KK8513 KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） 24回用 KK8515 KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） 96回用 保存条件 −20℃で6ヶ月 キット内容 KAPA Frag 酵素 KAPA Frag バッファー（10X） KAPA Frag コンディショニング溶液 エンドリペア & A-テーリングバッファー エンドリペア & A-テーリング酵素 ライゲーションバッファー DNA ライゲース KAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X）※ ライブラリー増幅プライマーミックス（10X）※ 8回用 価格（税抜） FastGene Adapter Kit （イルミナ用アダプターキット） お問い合わせ ください • アダプター濃度が既知のため、インプットサンプル量に応じた ライゲーションの最適化が可能です。 • KAPA Library Quantification Kitを用いてアダプター付加 済みライブラリーDNAの定量を行うことで、製品のQCとして います。 Cat.No. 価格（税抜） FG-NGSAD24 NGS Adapter Kit （各Index 20μl) お問い合わせ ください 仕様 • 濃度 30μM • 容量 24インデックス 各20μｌ （Index No. 1∼16, 18∼23, 25, 27） 保存条件 -20℃ ＊ご注意：性能に影響するため、氷上でご使用いただく など、出来る限り室温より低い温度でお取り 扱い下さい。 ※PCR酵素なしのキットには含まれておりません。 5 KAPA HyperPrep Kit KAPA HyperPrep Kit illumina社用ライブラリー調製キット • • • • • • FFPEなどの微量DNAサンプルからのライブラリー調製に最適“ 1ng∼” サンプル調製時間の短縮 “ Total 2∼3時間 ” （従来：約5時間） 新組成バッファーによるライゲーション効率の更なる向上により、インプットサンプル“100ng∼”の“PCRフリーライブラリー調製”が可能に 全ゲノムシークエンス、ターゲットシークエンス、ChIP Seqなどの微量インプットサンプルに対応 ハイフィデリティーエンジニア酵素（KAPA HiFi）による増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上 アジレント・テクノロジー社 SureSelect XT ターゲットエンリッチメントシステムとの組み合わせ※により、WES（全エクソン解析）も可能 ※ アジレント・テクノロジー社 SureSelect XTと組み合わせる際に必要な試薬についてはお問い合わせください。 ライブラリーの収量増大と シークエンス・クオリティーの向上 • ライゲーション効率の向上による高いライブラリー収量 • エンジニア酵素（KAPA HiFi）による低いDuplication Rateと 高いカバレッジを実現 35 30 変換率％ KAPA Hyper Prep KitではインプットDNAを、より多くのアダプター 付加済みライブラリーに変換させます。コバリスで断片化されたDNA から 作 成 さ れ た ライブ ラリー は、アダ プター・ライゲーション 後 に KAPA Library Quantification Kitに より定 量 さ れ ました（左 図 参 照）。KAPA Hyper Prep KitはDNAイ ン プ ット 量（10ng、100ng、 1ug）に関わらず、最も高いアダプター付加済みライブラリーへの変換 率を示し、より少ないサイクル数での増幅で1ugのライブラリーを作製 することが出来ました。 40 KAPA Hyper Prep I社N製品 N社U製品 25 20 15 10 5 0 10 ng 100 ng 1 ug インプット量 ライブラリー作製を3時間以内に！ • エンドリペアとA-テーリングの酵素反応を一元化し、SPRI精製なし でアダプターライゲーション反応へ • One-TubeワークフローによりSPRI精製ステップを最小限に減らし、 PCRフリーなら2時間以内、PCR増幅を必要とする場合でも3時間以 内のハンズオン・タイムを実現 • 最小限の操作ステップにより、ライブラリー作製の一貫性と再現性を 向上 Hands-on Total time time 5min 5min 0min KAPA Hyper Prep Kit のワークフロー 一般的なライブラリー作製 Hands-on Total のワークフロー time time （KAPA HTP LP Kitなど） Reaction Setup Reaction Setup 5min 5min 60min End repair and A-tailing End repair 0min 30min 0min 15min Adapter ligation SPRI cleanup 15min 30min 15min 30min SPRI cleanup A-tailing 0min 30min 0min 30min Library Amplication SPRI cleanup 15min 30min 15min 30min SPRI cleanup Adapter ligation 0min 15min SPRI cleanup 15min 30min SPRI cleanup 15min 30min ∼35min ∼2.75h Library Amplication SPRI cleanup 0min 30min 15min 30min ∼1.5h ∼4.5h 6 Cat.No. 包装単位 KK8500 Hyper Prep Kit 8回用 KK8502 Hyper Prep Kit 24回用 KK8504 Hyper Prep Kit 96回用 KK8501 Hyper Prep Kit PCR酵素なし KK8503 Hyper Prep Kit PCR酵素なし 24回用 KK8505 Hyper Prep Kit PCR酵素なし 96回用 8回用 価格（税抜） 保存条件 −20℃で1年間 キット内容 お問い合わせ ください • エンドリペア＆A-テーリング バッファー • DNAライゲース • エンドリペア＆A-テーリング 酵素 • KAPA HiFi HotStart ReadyMix ※ • ライゲーションバッファー • ライブラリー増幅プライマーミックス ※アダプターは含まれておりません。 ※磁気ビーズ”AMPure XP”は含まれておりません。 ※PCR酵素なしのキットには含まれておりません。 アジレント・テクノロジー社 KAPA Hyper Prep Kit & SureSelect XT Kit 微量DNAサンプルからのターゲットキャプチャ • • • • 微量DNAサンプルからのエクソームキャプチャに最適 10ng∼（初発DNA量10ng∼で高品質データが得られる事を検証済） FFPEおよび微量インプットサンプルのアプリケーションに対応 96回用（KK8504）は自動化、マニュアルのどちらも使用可能 アジレント・テクノロジー社 Bravoにも対応可能（お問い合わせください） ハイフィデリティーエンジニア酵素（KAPA HiFi）による増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上 WES（全エクソン解析）での使用例 ワークフロー gDNAをCovarisで 目的サイズに断片化 NGS Kit 使用製品 KAPA Hyper Prep ライブラリー調製キット （日本ジェネティクス） アダプタ付き DNA断片 溶液中で ハイブリダイゼーション ビオチン化cRNA ベイトライブラリ SureSelect Target Enrichment plus Adapter TPFD-KB ILM, 96 or 96 Auto （アジレント・テクノロジー社） ストレプトアビジン 磁性ビーズ AMPure XPキット （日本ジェネティクス） KAPA ライブラリー定量キット キャプチャされたDNA だけを回収、濃縮 （日本ジェネティクス） シーケンシング ユーザー様の声 臨床データの豊富さや希少疾患( 腫瘍) への解析のため、FFPEサンプルのNGS解析が、今後、求められています。また、臨床シークエンスへの展開 を考えた場合、過去の生検標本など微量なFFPE 標本からのDNAに対するNGS解析に適した方法の確立が必要になります。FFPE 標本からの DNAは、PCR duplicationが非常に多く（時には50％以上）、データの質も悪いから、、、と敬遠しておりましたが、KAPA Hyper Prep Kit のライ ブラリー構築の効率の良さは、驚くべきものでした。KAPA Hyper Prep Kit は、FFPEを用いての臨床シークエンスの手法に大きなインパクトを あたえることは間違いありません。特に、臨床シークエンスを考えた場合、生検のFFPEしか癌組織がないような状況が多々あり、KAPA Hyper Prep Kit だと、生検のFFPEの数スライスからのDNA（50-100ng程度）でも効率よくNGSライブラリーの構築ができる可能性があるので、非 常に有望です。 理化学研究所 統合生命医科学研究センター ゲノムシーケンス解析研究チーム 中川 英刀様 前嶋 和紘様 アジレント製品につきましては、アジレント・テクノロジー株式会社の販売となります。 下記にお問い合わせください。 アジレント・テクノロジー株式会社 本社／〒192-8510 東京都八王子市高倉町9-1 カストマコンタクトセンター 0120-477-111 7 FastGene Adapter Kit FastGene Adapter Kit イルミナ用 アダプターキット • アダプター濃度が既知のため、インプットサンプル量に応じたライゲーションの最適化が可能です。 • KAPA Library Quantification Kitを用いてアダプター付加済みライブラリーDNAの定量を行うことで、製品のQCとしています。 特長 Illumina ® プラットフォーム向けFastGeneアダプターキットには、24種類のインデックス付きTruSeq TM Y字型アダプターが含まれており、Illumina ® プ ラットフォーム向けKAPAライブラリー調製キットと組み合わせることで、各種Illumina ®シーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに対応した ライブラリーを調製できます。 インデックスアダプターによって、クラスター生成前に予め複数の断片ライブラリーをプールすることができるため、一つのフローセル上でのマルチプレ ックスシーケンシングが可能です。これにより、次世代シーケンシングのワークフローが簡素化され、様々な用途での利用が可能になります。 FastGeneアダプターキットに含まれるDNAインデックスの配列は、Illumina ® TruSeq TM DNA v1/v2/LT、RNAv1/v2/LT及びChIPサンプル調製キ ットに含まれる配列と同じですので、プール内のすべてのインデックスを均等に表現できるように最適化されています。シーケンシングデータの脱マルチ プレックス処理は、Illumina ®ソフトにより自動的に実施されます。インデックス同士の配列が大きく異なっているため、シーケンシングエラーや塩基判定 エラーによりリードのインデックスが誤って判定されるリスクは最小限に抑えられています。 仕様 • 濃度 30μM • 容量 24インデックス 各20μl（Index No. 1∼16, 18∼23, 25, 27） 保存条件 -20℃ ＊ご注意：性能に影響するため、氷上でご使用いただくなど、出来る限り室温より低い温度でお取り扱い下さい。 Cat.No. FG-NGSAD24 価格（税抜） NGS Adapter Kit（各Index 20μl) 価格は2015年6月現在のものです。製品は改良のため予告なく変更する場合があります。 http://www.n-genetics.com 本 社：〒112-0004 東京都文京区後楽1丁目4番14号 後楽森ビル18F Tel. 03（3813）0961・ Fax. 03（3813）0962 西日本営業所：〒604-8277 京都府京都市中京区西洞院通御池下ル565番地 ラフィーネ御池3F Tel. 075（257）5421・ Fax. 075（257）5422 10PR1506J1K お問い合わせください
© Copyright 2024 ExpyDoc
