平成 27 年 7 月 21 日科学技術振興機構（ＪＳＴ） Tel： 03-5214-8404(広報課 ) 東京薬科大学 T e l ： 0 4 2 - 6 7 6 - 1 6 4 9 （総務法人広報課) 腸炎発症を引き起こすマクロファージ集団を発見～消化管の炎症に特化した新たな治療法開発に期待～ポイント  腸炎発症にマクロファージ（大食細胞）の関与が想定されるが、その機能は不明だった。  ＣＤ１６９を発現する特定のマクロファージ集団が腸炎を発症させることを発見した。  腸炎の原因物質が明らかになり、消化管炎症に特異的な新たな治療法開発が期待される。ＪＳＴ戦略的創造研究推進事業において、東京薬科大学生命科学部の浅野謙一准教授らは、腸炎を引き起こす特定のマクロファージ亜集団注１）を発見し、その働きを抑制することで腸炎の発症を制御できることを明らかにしました。これまで腸炎の発症には消化管に常在してＣＸ３ＣＲ１注２）を発現するマクロファージが関与することが想定されていましたが、その実態や作用は不明でした。浅野准教授らは、消化管粘膜のＣＸ３ＣＲ１発現マクロファージの中でも、ＣＤ１６９注３）を同時に発現する特定のマクロファージ亜集団に着目しました。このマクロファージ亜集団を消失させると、マウスの腸炎モデル注４）における症状が改善されることから、この亜集団が腸炎を引き起こしていることが判明しました。さらに、この亜集団が可溶性たんぱく質（サイトカイン注５））の一種であるＣＣＬ８注６）を産生することを見いだし、その作用を抑制することにより、マウスの腸炎モデルの症状が改善されたことから、ＣＣＬ８が腸炎の原因物質の一つであることが明らかになりました。ヒトの腸炎に対し免疫機能全般を抑制する現行の療法は、通常ではほとんど発症することがない常在菌による感染症の合併などの副作用を伴います。本研究成果を活用することで、今後消化管の炎症に特異的な新たな治療法開発につながると期待されます。本研究は、東京薬科大学免疫制御学研究室の田中正人教授の協力を得て行いました。本研究成果は、２０１５年７月２１日（英国時間）に英国科学誌「ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」のオンライン速報版で公開されます。本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。戦略的創造研究推進事業研究領域：「炎症の慢性化機構の解明と制御」（研究総括：高津聖志富山県薬事研究所所長）研究課題名：「腸管センチネル細胞を標的とした炎症性腸疾患治療法の開発」研究者：浅野謙一（東京薬科大学生命科学部免疫制御学研究室准教授）研究実施場所：東京薬科大学生命科学部研究期間：平成２３年１０月～平成２７年３月 1 ＜研究の背景と経緯＞私たちの消化管は、食物や腸内細菌などの外来抗原に常にさらされています。消化管粘膜の免疫系は、有害な病原体の侵入を防ぐと同時に、生体に有益な抗原に対しては過剰に反応しないよう巧妙に調節されています。消化管に常在するマクロファージはＣＸ３ＣＲ１を発現し、インターロイキン－１０（免疫細胞の活性化状態を抑えるサイトカイン）を産生して腸内細菌に対する過剰な反応を抑制することが知られています。一方で、抑制作用とは異なり、消化管の粘膜上皮の傷害と細菌の侵入を感知して腸炎の発症に関与するマクロファージの亜集団が存在することが想定されていますが、その解析は行われていませんでした。そこで、浅野准教授らは、腸炎の新たな治療法の開発につなげるため、腸内細菌の侵入に応答するマクロファージの亜集団を同定し、マクロファージが腸炎を悪化させる仕組みの解明に取り組みました。＜研究の内容＞浅野准教授らは、これまでにＣＤ１６９を発現するマクロファージの亜集団（ＣＤ１６９陽性マクロファージ）がリンパ組織に局在し、血管やリンパ管から流入する死細胞などに対する免疫反応を制御することを明らかにしてきました。そこで「生体における最大の免疫臓器」と呼ばれる消化管でも、ＣＤ１６９陽性マクロファージが腸炎発症に何らかの役割を担うのではないかと考えました。本研究では、ＣＤ１６９発現細胞を一時的に消失できるＣＤ１６９－ＤＴＲマウス注７）と、新たに作製した抗ＣＤ１６９モノクローナル抗体注８）を用いました。この抗体により、従来の抗ＣＤ１６９抗体では困難だったフローサイトメトリー注９)を用いた細胞におけるＣＤ１６９の発現解析も可能になりました。ＣＤ１６９陽性マクロファージの粘膜内における局在を調べたところ、ＣＸ３ＣＲ１を発現するマクロファージは腸管粘膜内に一様に分布していましたが、ＣＸ３ＣＲ１とＣＤ１６９の両方を発現するマクロファージは、腸内細菌などの異物と近接する上皮の直下には存在せず、腸管粘膜内深部の粘膜筋板側に局在していることが分かりました（図１）。デキストラン硫酸（ＤＳＳ）誘導マウス腸炎モデルは、腸炎の実験モデルとして広く利用されています。野生型マウスにＤＳＳを投与すると粘膜上皮の傷害に続く激しい腸炎（ＤＳＳ腸炎）を誘導できます。しかし、ＣＤ１６９陽性マクロファージが存在しないＣＤ１６９－ＤＴＲマウスにＤＳＳを投与した場合には腸炎の症状が著しく減弱することが分かりました（図２）。また粘膜に浸潤する細胞数を調べたところ、好酸球や好中球注１０）の数は野生型マウスと同程度でしたが、腸炎を悪化させる炎症性の単球注１１）が顕著に減少しました（図３）。以上の結果から、ＣＤ１６９陽性マクロファージが上皮の傷害を感知して何らかのサイトカインを産生し、消化管粘膜へ単球の動員を促進する可能性が示されました。そこで腸炎発症時に、ＣＤ１６９陽性マクロファージで選択的に強発現するサイトカイン遺伝子を網羅的に検索しました。そのような遺伝子の１つとして見いだしたＣＣＬ８は、単球を血流から動員する作用を持つことが知られていましたが、これまで炎症性疾患における働きはよく知られていませんでした。本研究により、ＣＣＬ８はＤＳＳ投与による腸炎誘導後の５日目から徐々に消化管で発現が上昇し、主にＣＤ１６９陽性マクロファージから生み出されていることが分かりました（図４）。また、実際にＣＣＬ８が生体内で単球 2 の浸潤を誘導することも確認しました。そこで、ＣＣＬ８の機能を生体内で阻害するため、抗ＣＣＬ８モノクローナル抗体を作製し、ＤＳＳ誘導マウス腸炎モデルに投与したところ、ＤＳＳ腸炎の症状を抑制できることを確認しました（図５）。以上の研究から、ＣＸ３ＣＲ１とＣＤ１６９の両方を発現するマクロファージの亜集団が、粘膜の深部まで到達した細菌の侵入を感知してＣＣＬ８を放出し、炎症性の単球を呼び寄せ、腸炎発症の原因となることが明らかとなりました。一方、腸管粘膜内に常在するＣＸ３ＣＲ１のみを発現するマクロファージは、従来から知られている死んだ上皮細胞や常在の腸内細菌に対して過剰反応することを抑制するマクロファージの亜集団であると考えられます（図６）。＜今後の展開＞本研究において、消化管に常在するＣＸ３ＣＲ１発現マクロファージの中には、局在や機能の両面で極めて特徴的な、ＣＤ１６９を発現するマクロファージの亜集団が存在し、腸炎を引き起こす原因となることを発見しました。腸炎に対する現行の療法は、免疫機能全般を抑制するため、通常ではほとんど発症することがない常在菌による感染症の合併などの副作用を引き起こす可能性があります。ＣＤ１６９陽性マクロファージの機能や、それの発する危険信号であるＣＣＬ８の活性を抑えることが、より副作用の少ない消化管の炎症に特異的な新たな治療法開発につながると期待されます。 3 ＜参考図＞図１作製した抗ＣＤ１６９抗体を用いた腸管のマクロファージの解析腸管の蛍光組織像。ＣＸ３ＣＲ１発現マクロファージ（赤色）は粘膜内の管腔側から粘膜筋板にかけて一様に分布する（左図）のに対し、抗ＣＤ１６９抗体で蛍光染色されたＣＤ１６９陽性マクロファージ（赤色）は上皮の直下にはほとんど存在せず、粘膜筋板側に局在する（右図）。青色は細胞の核。白い横棒はスケールバー（１００μｍ）。図２ＣＤ１６９陽性マクロファージ非存在下での炎症性腸疾患抑制ジフテリア毒素を野生型マウス（ＷＴ）とＣＤ１６９－ＤＴＲマウスに投与すると、ＣＤ１６９－ＤＴＲマウスのみ、ＣＤ１６９陽性マクロファージが消失する。その処置をした両群のマウスに３．５％濃度のＤＳＳを７日間飲水投与し、８日目からは普通水に切り替えた。野生型マウスでは１週間で約３０％の体重減少や血便を伴う激しい腸炎が発症し体重の減少が認められたのに対し、ＣＤ１６９－ＤＴＲマウスではそれらの臨床症状の悪化が阻止され、腸炎に伴う体重減少が有意に抑制された。（野生型マウスと比較して統計学的有意差あり＊Ｐ＜０．０５） 4 図３ＣＤ１６９陽性マクロファージ非存在下での炎症細胞浸潤何れにもジフテリア毒素を投与した、野生型マウスにＤＳＳを飲水投与しない群（野生型無処置）、野生型マウスにＤＳＳを飲水投与した群（野生型腸炎）、およびＣＤ１６９－ＤＴＲマウスにＤＳＳを飲水投与した群（ＣＤ１６９－ＤＴＲ腸炎）について、炎症に伴って浸潤してきた単球、好中球、好酸球の腸管内の細胞数を測定した。単球の増加は野生型腸炎群において顕著であったが、ＣＤ１６９－ＤＴＲ腸炎群では増加が抑制された。一方、好中球と好酸球数は、野生型腸炎群とＣＤ１６９－ＤＴＲ腸炎群間に大差がなかった。（群間に統計学的有意差あり＊ｐ＜０．０５、n．s．は有意差を認めず）図４腸炎誘導後のＣＣＬ８産生とＣＤ１６９陽性マクロファージ選択的なＣＣＬ８産生Ａ：ＤＳＳ腸炎を誘導した野生型マウスの腸管から経時的に回収したマクロファージにおけるＣＬＬ８ｍＲＮＡ発現を定量すると、腸炎誘導５日後に有意な上昇が認められた。ＣＬＬ８ｍＲＮＡの相対発現量は、腸炎を誘導していないマクロファージにおけるＣＬＬ８ｍＲＮＡの発現量を１として算出した。Ｂ：無処置あるいはＤＳＳ腸炎を誘導した野生型マウスの腸管からＣＤ１６９陽性あるいはＣＤ１６９陰性のマクロファージを回収し、２４時間培養後の培養上清中のＣＣＬ８濃度を測定したところ、ＣＤ１６９陽性のマクロファージでのみ細胞数依存的なＣＣＬ８の産生を認め、その産生量は腸炎の場合で有意に増加した。（無処置と比較して統計学的有意差あり＊Ｐ＜０．０５）。 5 図５抗ＣＣＬ８抗体投与によるＤＳＳ誘導腸炎の抑制野生型マウスにおけるＤＳＳ誘導腸炎に、抗ＣＣＬ８抗体１００ｍｇを２日間静脈内投与したマウスでは、コントロール抗体投与群に比べ、体重減少（Ａ）、血便・大腸の短縮（Ｂ）が軽度であった。（コントロール抗体投与群と比較して統計学的有意差あり５）＊Ｐ＜０．０図６ＣＤ１６９陽性マクロファージは腸上皮の傷害を監視するとともに腸炎を引き起こす粘膜上皮細胞の一部は絶えず死んでいくとともに増殖してきた他の粘膜上皮細胞と置き換わる（ターンオーバー）。上皮直下のＣＤ１６９陰性マクロファージは、ターンオーバーに伴う死んだ上皮細胞や、腸内細菌に絶えずさらされているため、これらの抗原に対する過剰な反応を抑制する作用を持つ。しかし傷害が粘膜の深部まで進展し、死細胞や腸内細菌に由来する抗原を粘膜深部に存在するＣＤ１６９陽性マクロファージが感知すると、ＣＣＬ８を産生し、血管から炎症性の単球を動員し、異物を排除する反応（腸炎）を誘導する。この腸炎が軽微であればよいが、過度な場合は治療の対象となる。 6 ＜用語解説＞注１）消化管のマクロファージの亜集団マクロファージは、大食細胞とも呼ばれ、細菌・異物、死んだ細胞などを取り込み、分解処理する。消化管に常在するマクロファージのマーカー（細胞表面上に発現する分子）としてＣＸ３ＣＲ１が知られている。注２）ＣＸ３ＣＲ１ケモカイン（注６参照）であるＣＸ３ＣＬ１の受容体で、消化管の常在性マクロファージに発現する。注３）ＣＤ１６９ＣＤ１６９分子はシアル酸結合たんぱく質として同定された。脾臓・リンパ節などのマクロファージの一部に発現することが知られていた。感染防御に何らかの働きを担うと考えられているが、生体内での機能はまだよく分かっていない。注４）デキストラン硫酸（ＤＳＳ）誘導マウス腸炎モデルデキストラン硫酸は分子量が５，０００から５０，０００の高分子化合物で、実験動物の飲水中に溶かして投与すると、直接、上皮粘膜を傷害し、腸内細菌の粘膜への侵入を誘導すると考えられている。リンパ球を欠損したマウスでもＤＳＳ投与で腸炎が誘導されることから、自然免疫に依存した腸管の炎症モデルとして広く利用されている。注５）サイトカイン細胞から放出され、細胞同士の情報伝達物質となる可溶性たんぱく質。細胞表面の受容体に結合し、さまざまな生理活性を発現する。炎症作用を持つサイトカインがよく知られているが、細胞増殖を促進したり、インターロイキン－１０のように免疫細胞の活性化状態を抑える作用を持つものも存在する。注６）ＣＣＬ８サイトカインのうち免疫細胞に対する遊走活性を持つものを特にケモカインと呼び区別することがある。ＣＣＬ８はケモカインの一種で、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）の患者血清で上昇することがヒトと動物モデルの両方で報告されているが、他の炎症性疾患における具体的な機能も産生細胞もほとんど分かっていない。注７）ＣＤ１６９－ＤＴＲマウスジフテリア毒素はジフテリア菌（ＤＴ）が合成し、菌体外へ分泌するたんぱく質の毒素で、細胞のジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）に結合することにより、その毒作用を発現する。ヒトと異なり、げっ歯類のＤＴＲは、ジフテリア毒素にほとんど結合しない。ＣＤ１６９－ＤＴＲマウスは、このＤＴ結合能の差を活用し、ヒトＤＴＲをＣＤ１６９が発現する細胞集団に遺伝子操作で発現させるようにし、ＤＴを投与することによりＣＤ１６９発現細胞を一時的に消失させ、その細胞の機能を調べる目的で作製したマウス。 7 注８）モノクローナル抗体人為的に単一のアミノ酸配列を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択・増殖させて得た抗体。通常は特定の分子構造に対して特異的に結合する。注９）フローサイトメトリー単離した大量の細胞を一列に並ぶように高速で流しながら、その一つひとつの大きさや分子発現状態を解析する方法。注１０）好酸球・好中球いずれも白血球の一種で、好中球は細菌感染で、好酸球は寄生虫感染やアレルギー疾患で増加することが知られている。消化管に炎症が起こると好酸球や好中球が多数浸潤し、粘膜組織の破壊とともに再生を促すと考えられている。注１１）単球血液中に存在する大型の白血球で、炎症が起こった組織に浸潤すると、さらに炎症を悪化させる。＜論文タイトル＞ “Intestinal CD169+ macrophages initiate mucosal inflammation by secreting CCL8 that recruits inflammatory monocytes” （消化管のＣＤ１６９陽性マクロファージはＣＣＬ８を放出して炎症性単球を動員し、腸炎を引き起こす） doi:10.1038/ncomms8802 ＜お問い合わせ先＞＜研究に関すること＞浅野謙一（アサノケンイチ）東京薬科大学生命科学部免疫制御学研究室〒192-0392 八王子市堀之内１４３２‐１ Tel：042-676-5207 Fax：042-676-5240 E-mail: [email protected] 准教授＜ＪＳＴの事業に関すること＞松尾浩司（マツオコウジ）、川口哲（カワグチテツ）、加藤真一（カトウシンイチ）科学技術振興機構戦略研究推進部ライフイノベーショングループ〒102-0076 東京都千代田区五番町７Ｋ’ｓ五番町 Tel：03-3512-3525 Fax：03-3222-2064 E-mail：[email protected] 8 ＜報道担当＞科学技術振興機構広報課〒102-8666 東京都千代田区四番町５番地３ Tel：03-5214-8404 Fax：03-5214-8432 E-mail：[email protected] 東京薬科大学総務法人広報課〒192-0392 八王子市堀之内１４３２‐１ Tel：042-676-1649 Fax：042-677-1639 E-mail：[email protected] 9