SURE: Shizuoka University REpository http://ir.lib.shizuoka.ac.jp/ Title Author(s) 発光ファージ法による重要植物病原細菌の迅速同定シス テムの開発 露無, 慎二 Citation p. 1-58 Issue Date 2005-03 URL Version http://hdl.handle.net/10297/3034 publisher Rights This document is downloaded at: 2016-03-01T10:15:06Z 発光ファージ法による植物病原細菌の 迅速同定システムの開発 （研究課題番号 15380034） 平成15年度∼平成16年度科学研究費補助金（基盤研究（B）（2）） 研究成果報告書 禰衷 ttW，＄，，．9／；．｝S 平釦年3月 lIllllllllll OOO6522866 「 F 阜 ‖ 大学 書館 研究代表者露無慎二 （静岡大学農学部教授） 奇贈 蕗黙倶二（農字 0006522866 発光ファージ法による植物病原細菌 の迅速同定システムの開発 （研究課題番号 15380034） 平成15年度一平成16年度科学研究費補 助金（基盤研究（B）（2）） 研究成果報告書 平成17年3月 研究代表者 露無慎二 （静岡大学農学部教授） はしがき この研究課題又はこれに密接関連した研究課題として、「レポータ ーファ・…一・…ジを用いた植物検疫システムの開発」（基盤研究（B）（2）、 平成11−12年度、研究経費13，400千円）の援助を受けた。この 研究では、発光ファージを分離するための、Tn3及びTn5の逆向き 繰り返し配列をべ一スにした遺伝子融合用トランスポゾンを作成し、 これらがプラスミド上の既知遺伝子に融合され、無事発光する事を 確認した。さらに、大腸菌を中心に発光ファージを構築し、これら 尾を餅田検出システムが、各種植物病原細菌の植物検疫システムに 応用できる事を示した。本研究では、上記融合用トランスポゾンを 用いて、各種植物病原細菌検出用発光ファージを分離し、単一の病 原細菌だけではなく、複数の病原細菌を同時に検出する事によって、 簡易同手も可能なシステムを構築する事を目的とした。本研究では、 さらに当初予定した上記レポーターファージの利用の他、ファージ 粒子をビオチンや臭化エチジウムであらかじめ標識しておき、これ を多重吸着させて、特定の植物病原細菌を迅速、且っ正確に検出で きるかについても検討を行った。いずれの検出法においても、ナス 科植物青枯れ病菌、カンキツかいよう病菌を10の2−・3乗個まで、 3時間以内に検出できる事が分かった。本研究報告書は、これらの 研究成果をまとめたものである。 平成15−16年度科学研究i費（基盤研究B（2）） 研究成果報告書 15380034 1．課題番号 2．研究課題 発光ファージ法による植物病原細菌の迅速同定 システムの開発 3．研究組織 研究代表者 研究分担者 露無慎二（静岡大学農学部教授） なし 4．研究経費 平成15年度 10，600 千円 平成16年度 5，400 千円 計 16，000 千円 研究発表 （1）学会誌等 1）P．Jitareerat， H． Matsumoto， M． Umehara and S． エ…1，（2003）D−alanine−D−alanine ligase gene （dd1） of Erwz’nia chiysan th emi strain EC 16． II． Analysis of regulation of pectate lyase using ddi− mutant．」． Gen． Plan t Pa th o1．69（1）：49−54 2）P．Jitareerat 1・2， H． Matsumotoi・2， M。 Umehara2 and S． ユ』．・D−alanine−D−alanine ligase gene（dd1）of Erwinia chiysan the n1’strain EC 16．1． Isolation and Gene dosage effect on pectate lyase synthesis．」． Gen． Plan t Pa th o1．68（4）：342−349（2003） 3）S．Kusumoto， T． N． Aveny， S． Mujimn， C。 Ginting， T． Tsuge，一， and Y． Takikawa，（2004） Occurrence of blood disease of banana in Sumatra， Indonesia．∫Gα1． Pla rコfPヨtho1．70：45−49 4）G．Ponciano， H． Ishihara−and J．E． Leach， （2003）Bacterial effectors in plant disease and defense： Keys to durable resistance？ Plan t Disease 87： 1272−1282 5）S．Yoshida，一， and T． Tsukiboshi．（2003） Macerating enzymes produced by Rhl’zop us oryzae in infected mulberry roots． J．．Phytopa thol，．151：436−441 6）H．Matsumoto， M． Umerhara， H． Muroi， Y． Yoshitake， and−．（2003）Homolog of FlhDC， a master regulator for flagellum synthesis：required for pathogenicity in Erw7’1コia carotovて）ra subsp． carotovて）ra．」． Gerコ． Plan t Pa t2，1 ol．69：189−193（2003） 7）H．Matsumoto， H． Muroi， M． Umehara， Y． Yoshitake， and−（2003）Peh production， flagellum synthesis， and virulence reduced in Erワロ’刀ia carotovora subsp． carotovora by mutation in a homologue of（rytR． Mole． PZan t−Microbe．ln teract．16 （5）：289−397 8）H．Matsumoto， H．， P． Jitareerat， Y． Baba， and主 エ〔1，（2003）Comparative study of regulatory mechanisms for pectinase production by Erw1’n1辺 carotovora subsp． carotovora and ErWt’1コia c鋤sa11亡h e1η∫． Md∼． Pl・ヨ1コt−1Mil’（）roZ）e ln teract． 16 （3）： 226−237 9）H．Ishihara， G． Ponciano， J． E． Leach， and旦 ユご， （2004）Functional analysis of the 3’ end of avrBs3／pthA genes from two Xan thomonas species． P∼2yslo1．、Mole． Plan t Pa th o1．63：329−338 10）H．Ishihara， S． Uchida， Y． Masuda， K． Tamura，豊 ユニ1，（2004）Increase in telomerase activity in ． citrus inoculated with xanthomonas axonopodis pv． citri．∫Gen． Plan t Pa tho1．70：218−220 11）S．Kusumoto， T． N． Aveny， S． MUjimn， C． Ginting， T． Tsuge，一， and Y． Takikawa，（2004） 12）Haque， M．M．， and−（2005）Virulence， resistance to magainin II， and eXPression of pectate lyase are controlled by the PhoP−PhoQ two−component regulatory system responding to pH and magnesium in Er砿刀辺c血ysan them1’3937．∫Geη． Plan t Pa th o1．71：47−53． 13）Haque， M． M．， A． Yamazaki， and S． Tsuyumu（2005） Virulence， accumulation of acety1−coenzyme A and pectate lyase synthesis are controlled by PhoP−PhoQ two℃omponent regulatory system responding to organic acids in Em’1刀fa c鋤santhemi’3937．」． Gen． Plan t Pa tho1． 71：133−138 口頭発表 1）Haque， M．M． and Tsuyumu， S．，A Homologue of pehRS， A Two Component Regulatory System， Controls Exo−polygalacturonase Production and Virulence in Er助mla chrysanthemz’3937，日本植物病理学会報69 （3）：305（2003） 2）須山弘明・松本裕之・露無慎二，軟腐性Emm抱属細菌にお けるrpoH遺伝子の機能解析，日本植物病理学会報69（3）： 305（2003） 3）松岡圭介・IKToth・LJHyman・露無慎二，軟腐性ErWinia 属細菌の3大グループ間のSSH（Suppression on Substractive Hybridaization）法によるE． chiysanthemi’ 特異的配列の解析，日本植物病理学会報69（3）：306（2003） 4）石原博通・Ponciano， G．・Leach， J．E．・露無慎二 Xan thom onas属細菌のavr／Pth遺伝子ファミリー間のキメ ラがカンキツ植物に呈する反応，日本植物病理学会報69 （3）：313（2003） 5）Takashi FtUikawa， Hiromichi Ishihara， and ShirOi Tsuyumu， Suppression of active defense resistance in non−host Plants by avr／0仇gene in xanthomonads．8th International congress of Plant Pathology， Christchurch， New Zealand（2003） 6）柴田敏史、相沢慎一、露無慎二、植物病原性細菌Erwr’nia carotovora subsp． carotovora EC 1の運動性の病原性への 関与。日植病報70（3）：291（2004） 7）Haque， t M．M．， and S． Tsuyumu， Involvement of PehR−PehS Two−−component system in virulence of Em’刀ia chiysaτ］th eη1’3937． Ann． Phyt opatho1． Soc． Jpn日本植物病理学会報70（3）：292（2004） 8）Joko， T．， H。 Etoh and S． Tsuyumu， Effects of sugars on the eXPression of pe正in Enn’nia chrysa rコthemz’EC 16． 日本植物病理学会報70（3）：292（2004） 9）藤川貴史、駒井慶子、露無慎二、Xan thomonas属細菌由 来avr／Pth遺伝子産物と結合する植物細胞壁タンパク質の 研究、日植病報70（3）：293（2004） 10）駒井慶子、木村幸、小松節子、露無慎二、カンキツかいよ う病菌の病原性遺伝子ap11産物（Ap11）と相互作用するカ ンキツタンパクの解析、日植病報70（3）：293（2004） 11）山崎明広、Ulla Bonas，露無慎二、 hrpG＊xcvを導入した カンキツかいよう病菌の分泌するタンパク質の探索、日植病 関西部会講演要旨集、46（2004） 12）Hossain， M．M． and S． Tsuyumu， Role of motility in pathogenesis of Erwゴ且1辺carotovora subsp． carotovora． 日植病関西部会講演要旨集、46（2004） 13）木村幸、駒井慶子、露無慎二、カンキツかいよう形成エフ ェクターAp11と結合するカンキツペクチンメチルエステラ ーゼの解析、日植病関西部会講i演要旨集、47（2004） 14）藤川貴史、吉村淳、露無慎二、異なる遺伝背景の植物にお けるavr／ρth遺伝子産物のサプレッサー活性の比較解析、日 植病関西部会講演要旨集、46（2004） 15）佐々木則英、藤沢郁弥、露無慎二、軟腐性Erwmia属細菌 と植物との相互作用に果たすフラジエリンの役割、H17年 日本植物病理学会大会、p．172、（2005） 16）Hossain， M．M． and Tsuyumu， S． Involvement of motility in biofilm formation of Erwmia carotovora subsp． caro to vora H 17年日本植物病理学会大会、p．172、（2005） 17）Joko， T．， and Tsuyumu， S． Environmental factors involved t in the pe1E hyperinduction in 班wゴηゴa chrysanthθmi EC16． H 17年日本植物病理学会大会、 p．1 73、‘（2005） 18）関谷敏芳、石原博通、増田有美、露無慎二、カンキツかい よう病菌におけるテロメラーゼの役割とTERT（Telomerase reverse・transcriptase）遺伝子の解析、 H 17年日本植物病理 学会大会、p．175、（2005） 19）塩谷浩、藤川貴史、石原博通、露無慎二、カンキツかいよ う病菌に対するブンタンi類の抵抗反応、H17年日本植物病 理学会大会、p．175 20）藍原誠、高塚勇規、上田一郎、露無慎二、カンキツのかい よう形成特異的に発現する遺伝子の研究、H17年日本植物 病理学会大会、P．175 21）菅沼龍、露無慎二、バクテリオファージを用いたナス科植 物青枯れ病菌の高速検出に関する研究、H17年日本植物病 理学会大会、p．180 目次 第1章 基盤となるレポーターファージ法の開発 第2章 ナス科植物青枯病菌の検出法の開発 第3章 カンキツかいよう病菌の検出法の開発 第4章 おわりに 第一章 基盤となるレポーターファージ法の開発 1）発光ファージ法の原理 ファージとは？ ファージとは、細菌に感染するウイルスの事を言う。ファージは、 加来さんとそれを保護するタンパク質とから構成されている。ファ ージは、限られた範囲の細菌（宿主）にしか感染しないが、その感 染様式は、1）ファージの宿主細菌への吸着、2）核酸を宿主細胞 内に注入、3）注入された核酸の複製（数百倍）、4）宿主細胞内に おけるファージタンパク質の生合成、5）これらのタンパク質と核 酸の自動集合によるすう約のファージ粒子の形成、6）宿主細菌の 内部からの溶菌、これに続く子ファージの放出というようになって いる。この感染から溶菌までの1サイクルは、1時間程度で終わる 程驚異的な早さで完了する。宿主細菌が存在しないとき（他の細菌 が混在していても）、ファージはただの物質の集合体に過ぎず、上記 の様な溶菌サイクルを全うする事が出来ない。従って、ファ・・一・・…ジの 感染活動を見る事により、その宿主細菌の存在を知る事が出来る。 発光遺伝子 自然かには、蛍、ホタルイカのように、ルシフェラーゼという酵 素反応によって光エネルギーを放出して発光に導くシステムを持っ た生物が多数存在する。各種ファージの遺伝子に発光遺伝子をつな げておくと、宿主細胞にのみ特異的に感染し、ファージゲノムの複 製とともに、短時間のうちに発光遺伝子のコピー数も複製される。 その結果、大量の酵素が生産され、大量のフォトンを生産するよう になる。これを高感度の検出器（フォトンカウンター）を用いる事 によって、細菌の存在を迅速、r且つ鋭敏に検出する事が出来るよう になる。 一般の大腸菌の検出のため、我々は、海洋細菌Vibrio fisherfiの 1ux遺伝子群（図1）をレポーター遺伝子とした発光ファージ（図2） を作出した。その結果、1個の大腸菌の存在を90％以上の精度で、 3時間以内に検出できる事を示す事が出来た。本法を用いて大腸菌 0157株をも数個のオーダーで検出する事ができた。（図3） 図1 V7力がoガs力αガの1uxカセット 1uxカセット 図3 大腸菌0157：H7株の検出限界 4000知 （加 300e’ 2000 h 1000 回 1 5 10 15 20 Well number 25 3④ 第2章 ナス科植物青枯れ病菌検出法の開発 A．レ・一 一フ ージ による pBS−E18は、ファージPRS1のゲノムクローンであり、M13プラ イマーにより両端のDNAシークエンスがすでに調べられていた。こ FASTA （http：／／www．ddbj．nig．ac．jp／search／fasta−j．htmi）に送信し、 相同性検索を行なった結果、既報のRalstoni’a solanaceai’ttmファー一 ジP4282のリゾチウム遺伝子と高い相同性を持つことが分かった。 しかしながら、このDNA配列は、500bp程度のパーシャルなもの であった。 そこで、pBS−E18にライゲーションされたPRS1のP4282リゾ チウムホモログ遺伝子、及びその周辺のDNAシークエンスを調べた。 1． EZ：：Tn pMOD：：Km「を利用したカナマイシン耐性遣伝 子のpBS−E18への導入 In vitroトランスポゾンインサーションによる、 pBS−E18へのカ ナマイシン耐性遺伝子の挿入を行ない、反応液をエレクトロポレー ションによりDH5αへ導入、形質転換体の作成を試みた結果、52 個のシングルコロニーを回収することができた。これらのうち3つ はベクターpBluescriptSK一上のアンピシリン耐性遺伝子にトラン スポゾンが導入されており、アンピシリン感受性となっていた。 2． ザンハイブリダイゼーションによるpBS−E18kへのカ ナマイシン耐性遣伝子のランダムーカ所挿入の確認 回収されたAmp・、 Km・のpBS−E18kのシングルコロニー49個か らミニプレップによりプラスミドを回収し、制限酵素Sacl、 Kpn lで 切断した。制限酵素切断サンプルを電気泳動しバンドパターンを確認 した後、pUC4k由来のカナマイシン耐性遺伝子をプローブとしたサ ザンハイブリダイゼーションを行なった。 この結果、49個のうち、2サンプルはカナマイシン耐性遺伝子のシ グナルが2つ確認されており、残りの47個は、シグナルが1つであ り、カナマイシン耐性遺伝子挿入数は1つであるということが示唆さ れた（図4）。 3．P4282リゾチウムホモログ遣伝子周辺のDNAシークエン ス及びその解析 シグナルが1つである事が確認されたサンプルをDNAシークエ ンサーにかけ、pMODのMosaic endの両端に設計されたプライマ ーpMOD−F、 pMOD−Rを用いてpBS−E18にクローニングされた PRS1ゲノム断片のDNA配列を調べた。 また、このP4282リゾチウムホモログ遺伝子は、 pBS−E18の末 端にあり、その下流のDNA配列は、このクローニングサンプルでは 40bp程度しか調べる事ができなかった。そのため、プライマー LysDS walkingを作成し、プライマーウォーキングをおこない、下 流のDNA配列を調べた。下流の配列を調べる際にはPRS1ゲノムを 鋳型とした。DNAシークエンスは1サンプルにつき4回行ない、そ の結果をアライメントして正確な配列になるように補正していった。 この結果、P4282リゾチウムホモログORFを含む6．2kbのp BS−E18のクローニングされたDNA配列および、その下流の配列を 決定する事ができた。 この配列を遺伝子解析ソフトウェアGENETYXおよびORF Finder（NCBI；http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．htm1） で調べた結果、pBS−E18にクローニングされた配列の中にP4282 リゾチウムホモログORFを含む推定上のORFが4つ、その下流に 1つのORFが存在するということが示唆された（図5）。 P4282リ ゾチウムホモログORFの上流に存在する推定上ORFを上流より ORF1、 ORF2、 ORF3とし、下流にある推定上ORFをORF5とし た。 P4282リゾチウムホモログ遺伝子全体でP4282と相同性検索をか けると塩基配列で83．0％ニアミノ酸配列で82．6％と、非常に高い相 同性を持っているということが分かった（図6）。また、C一ターミ ナル側は、非常に高い相同性を持ち、ほぼ100％の相同性で保存さ れていた。逆にN一ターミナル側は相同性が低く、バリアブルであ った。 その他のORFについても推定上のアミノ酸配列で相同性検索を 行なった結果、ORF1では特に高い相同性を持つアミノ酸配列は無 く、ORF2は、ファージ、ウィルスのコートタンパクとパーシャル な領域ではあるが、30％程度の相同性を持っていた（Data not shown）。 ORF3，5については、 E−Valueが高く、相同性を持つ可能 性のあるタンパクは得られなかった。 4．プロモーター活性の確認 ORF1とORF2の間の領域にプロモーターが存在する可能性が推 定されたため、2つのプライマー−E18 promoter sense Hind3とE18 promoter antisense BamH1を用いてPCRを行い増幅し、これを p GEM−−T EASYにサブクローングした。さらにpUC118につなぎ 直し、その下流に同様にプライマー1uxA sense BamH1、1uxB antisense EcoR1を用いてPCR増幅した1uxABをつないだ。この サンプルに対し、E18 promoter sense Hind3と、1uxB antisense EcoR1を用いてPCR増幅し、これをブロードレンジベクター p】LAFR3につないだ。インサートの向きは血cプロモーターと逆向 きに繋がったものをスクリーニングした。 これをRalstonia soZanacearum EPPS1、 Esc力e必c波cok’ DH10Bにエレクトロポレーションにより導入し、それぞれの菌株に ついて形質転換体を作成した。この際、lacプロモーターと同じ向き に繋がったものについてもコントロールとして同様に形質転換体を 作成した。 これらの形質転換体について微弱発光計数装置（浜松ホトニクス） で、発光を調べた結果、lacプロモーターと同じ向きのものについて は、どちらの形質転換体についても発光が見られた。しかしながら、 逆向きのものについては、Escherichia c（）k’ DHIOBでは発光は確認 されず、Ralstonia solanacearum EPPSIでのみ発光が見られた（図 7）。ここでは、バクテリオファージPRS1を感染させたもの、感染 させないものについて発光検出をおこなったが、ファージの有無に よらず強い発光が検出された。 u 次にこのプロモーターの特異性を調べるためXavethomonas axonopodis pv． citri L−9に、同様のコンストラクトを導入し、発光 測定をおこなった。 この結果、Xanthomonas axon（）po（fis pv． citri L−9においても 皿1sfon抱solanacearttm EPPS 1と同様に、強い発光が確認された （図8）。 これらの結果を元にしてマーカーエクスチェンジコンストラクト の作成を行った。マーカーエクスチェンジは、P4282リゾチウムホ モログORFと1uxABを置き換えるリプレイスメントになるように 設計した。 5．マーカーエクスチェンジコンストラクトの作成 以下のマーカーエクスチェンジコンストラクトの作成スキv・・一一・ムを 図9、図10および図11に示した。 P4282リゾチウムホモログORFの上流550bp（以後1ysUS）を プライマー1ysUS sense Sa11、1ysDS antisense Bg12で、 luxABを プライマー1uxA sense Bg12、1uxB antisense Af12で、 P4282リゾ チウムホモログORFの下流500bp（以後1ysDS）をプライマー1ysDS sense Afl2、1ysDS antisense BamH1でそれぞれPCRをし、それ ぞれをpGEM−−T Easyにライゲーションした。 次に1ysUSをlacに同じ向きになるようにEcoR Iでベクター pUC118に、1uxABをEcoR IでベクターpBluescript SK一にライ ゲーションした（それぞれpUC−US、 pBS−BA）。 そして、pBS−BA由来の1uxABをpUC−USにSac l、Kpn lで ライゲーションした（pUC−USBA）。これをBglllで切断し、セル フライゲーションをし、不要な配列を除いた（pUC−USBA self）。 pUC−USBAおよび、 pUC−USBA selfにおいて、テトラデカナール を加え、発光測定を行なったところ、強い発光が確認された（図1 2）。 さらにAf111、 BaMH Iで切断した1ysDSをライゲーションしよ うと試みたが、ベクターの一部、或いはインサートの一部が消失し てしまい、コンストラクトの作成ができなかった。 そこで、pUC−−USBA selfの1ysUS∼1uxABをEcoR I、S画1で 切断し、lacプロモーターと逆向きになるようにpBluescript SK一に ライゲーションした（pBS−USBA anti）。ここにM”、 BamH Iで 切断した1ysDSをライゲーションした（pBS−ME）。PBS−MEより、 1ysUS∼1uxAB∼1ysDSをSa11、BamH Iで切断しpUFRO47にラ イゲーションし、マーカ“エクスチェンジコンストラクトとした （pUFR−ME）。 このコンストラクトに対し、プライマー1ysUS sense Sa11、1ysDS antisense BamH 1を用いてPCRを行なったところ、推定した位置 にバンドを確認できた（Fig．10）。また、制限酵素sal I、BamH I による切断でも、同様にインサートが確認された（図14）。 6．コンプリメンテーションコンストラクトの作成 P4282リゾチウムホモログ遺伝子をpET21（＋）ベクターに、 SD配 列を含むようにプライマーを設計し増幅した断片をライゲーション し、大腸菌BL21（DE3）を用いたpETシステムにより大量発現した。 SDS−PAGEで解析した結果、推定通りのサイズ（71kDa）にでバン ドを確認できた（図15）。jkaZstonia solanacearum EPPSIを含む 上昇寒天にスポットをしたが活性を確認できなかった（図16）。発 現タンパクを混合し、静置したものを平板希釈法により、プレート にスプレッドするという方法でも同様に、活性が観察されなかった （Data not shown）。そのため、発現したタンパクがリゾチウムで はなく、また相同性が非常に高いことから、ハウスキーピングな遺 伝子である可能性を考慮し、マーカーエクスチェンジファージをリ カバリーするためのコンプリメンテーションコンストラクトの作成 を行なうことにした。コンプリメンテーションコンストラクトはプ ロモーター活性を持つ領域（以後E18−200p）を上流に、その下流 にSD配列を含むように、 P4282リゾチウムホモログ遺伝子をライ ゲーションしようと試みた。スキームを図17に示した。 El8−200pをプライマーEユ8 promoter sense Hind 3、E18 promoter antisense BamH 1で増幅し、 Hind皿、 BamH Iでベク ターpUC118にライゲーションした（pUC−200p）。 次にP4282リゾチウムホモログ遺伝子をプライマー1ys sense BamH1、1ys antisense EcoR1で増幅し、 pUC200pにライゲーシ ョンした（pUC−200Plys）。 PUC−200plysよりHind皿、EcoR IでE18−200p∼1ysを切断し、 pLAFR3にライゲーションし、コンプリメンテーションコンストラ クトとした（pLAFR−200pLys）。 B．ビ ン フ ージによる レポーターファージ法のほか、ファージの細菌への吸着を検出基 準とするビオチン標識ファージを用いた検出法についても検討を行 なった。 1． バクテリオファージPRS 1のタンパク質としての濃度 測定およびビオチン標識 バクテリオファージPRS 1が1010pfu／m1でどの程度のタンパク 濃度であるかを調べた結果、およそ0．33mg／m1であることが分か った。そこで、タンパク濃度で0．5mgのファージをとり、ビオチン 標識を行なった。ビオチン標識後、タイター測定を行なったところ、 ビオチン標識による吸着への大きな阻害は見られず、吸着効率に劇 的な変化はなかった（図18）。 次に、ビオチン標識がされているかを確認するため、PVDFメン ブレンにサンプルをスポットし、ビオチンーアビジンAPアッセイ をし、NBT、 BCIPで発色させた。 その結果、すべてのフラクションで発色反応が見られた。また、 すべてのフラクションにおいて発色反応のシグナルに差は見られな かった。ラベルされていないファージ、ビオチンのみでは発色反応 が見られなかったため、PRS 1がビオチンで標識されているといえた （図19）。 2．ビオチン標識ファージの検出限界濃度の検討 ビオチン標識ファージPRS1の検出限界濃度を調べるため、濃度 調整を行ない、106から102個のファージをメンブレンにスポット していった。そして、基質としてNBT・BCIPおよび、 CDP−Star を用いてそれぞれ発色反応、発光反応を調べた（図20）。この結 果、発色反応、発光反応において優位な差が見られるのは104個程 度までであり、103個では、差が見られるものの、誤差範囲になり 得てしまう程度であった（図21）。 3．宿主バクテリアの検出限界菌数の検討 ビオチン標識ファージが104個以上必要であるということが分か ったため、次に宿主バクテリアの検出限界菌数について調べた。 検出に用いる標識ファージを107個で固定し、Ralstonia solanacearum EPPS 1の菌数を106から10CFUまで減らしていき、 これに標識ファージを、107個混ぜた場合、どのように検出されるか を調べた（図22）。この結果、102CFU以上の宿主バクテリアの存 在していれば、優位な差として検出されるということが分かった。 また、106から103CFUついては、発光による検出の数値に大きな 差は見られなかった（図23）。 第3章カンキツかいよう病菌の検出法の開発 1．バクテリオファージCPIの遣伝子の解析 CPIゲノムの制限酵素処理による泳動パターンの解析 得られたファージゲノムを制限酵素Hin（f皿、 Pst l及びKpn Iで切断した後の泳動パターンより、CPIのゲノムサイズは約 40Kbpであることが判明した。（図26）ファージゲノムの複製 は直鎖状で細菌に導入された後に、ゲノムの末端にある相補的な 一本鎖末端（COS領域）が塩基対を形成し環状化され、ローリン グサークル方式により環状ゲノムから長い一本鎖DNAを形成し ていく。一本鎖DNAのcos領域をターミナーゼが切断し、その 断片から二本鎖へと合成することによってゲノムを増幅する。こ れらがファージ頭部へと収納されるが、このとき収納される DNAの量はファージ染色体の長さそのもので決定される。ファ ージゲノムにレポーター遺伝子を導入する際に重要なことは、遺 伝子導入したファージのゲノムが頭部に収まりきるかになる。λ ファージではDNAの約106％以内に収めれば、導入が可能とな る。CP Iゲノムは40Kbpであるので、2．4Kbpまでのレポータ ー遺伝子を導入できる。 CPIゲノムのクローニング 制限酵素処理（Hind皿とPst I）したファージゲノムよりフ ァージライブラリを作成した。（図27）それらをCPIゲノムを プローブとしたサザンハイブリダイゼーションにより、ファージ ゲノムであることを確認した。（図28）一部の切断断片はクロ ーニングすることができなかった。これは、切断末端の一方が COS領域でベクターとの切断部位が異なったために、ライゲーシ ョンによる接合ができなっかたと考えられる。また、リゾチウム などの溶菌酵素をコードしている遺伝子が菌内で発現し、大腸菌 が溶菌してしまいクローニングができなかった可能性が考えら れる。今後、別の制限酵素（Sau3A Iなど）を用いることにより ファージゲノムを細かく（約500bp）して、より広くクローニ ングを行っていく必要がある。また、CPIと近縁であると考え られるXat〕thomonas oryzae bacteriophage XplOのヘッドプ ロテインをコードする遺伝子上でプライマーを作成しPCRを行 ったところ、目的の位置に増幅断片（図29）が得られ、その断 片をクローニングすることができた。このことから、ファージ CP IとXP10のコートプロテインは似た配列をもっており、分 類学的に近いことが示唆された。 DNAシーケンスの解析 得られたライブラリとPCR断片のクローンをDNAシーケン シングした結果、インサートの配列を得ることができた。それら をDDBJのFastaによる相同性検索をかけ遺伝子の予測を行っ た。その結果、ファージ遺伝子の翻訳の過程で使われるエクソヌ クレアーゼやRNAポリメラーゼ、ターミナーゼ、エンドヌクレ アーゼ、また、ファージのコートプロテインや尾部を形成するタ ンパクをコードする遺伝子、そのほかにタンパク分解酵素をコー ドする遺伝子と高い相同性が得られた。（Table 1．2．3．）ファージ のコートプロテインは転写量が多く、ファージの外皮を形成する。 この領域にレポーター遺伝子を導入し、コートプロテインとレポ ーター遺伝子産物の複合体として発現させファージを形成させ ればその発光量を測定でき、レポーターファージとして病原菌の 検出ができる。 2．ビオチン標識ファージを用いたレポーターファージ法の検 証 ファージへのビオチン標識 ビオチン（図30）をファージに結合させたビオチン標識ファ ージ（1010pfu）をメンブレンに固定化し、アルカリホスファタ 一ゼラベルされたストレプトアビジンをビオチンに結合させ NBT・BCIPによる発色によりファージヘビオチンが結合したこ とを確認した。また、コントロールで標識していないファージを 同様に発色させたところ、弱いながらも発色が見られた。これは ファージを精製していく過程で宿主の残渣が残ってしまったこ とが原因であると考えられる。したがって、ファージの精製を塩 化セシウム密度勾配法を用いて、精製度をより上げていく必要性 がある。 ビオチン標識ファージの検出限界 ビオチン標識ファージを10乗ずつ段階的に希釈してメンブレ ンにスポットして、NBT・BCIPでの発色による検出限界を調べ た。（図31）その結果、106pfuのビオチン標識ファー一ジを検出 することができた。これより、病原菌の検出には106pfu以上の ビオチン標識ファージを検出に用いる必要があると示唆された。 よって、病原菌検出の以下の実験において、ビオチン標識ファー ジを1010pfu用いて検出することにした。 NBT・BCIPでの発色による病原菌の検出限界 基質にNBT・BCIPを用いての病原菌（L9）の検出では、104cfu の病原菌を検出することができた。（図33）104cfuの菌を感 染発色させたときの度合いは、106pfuのビオチン標識ファージ を発色させたときくらいの度合いであり、このことから菌1つ に対して約100∼1000のファージが吸着していると考えられ る。NBT・BCIPでの発色による検出限界は104cfuで低いこと、 発色の識別があいまいになってしまうことから基質にNBT・ BCIPを用いる手法では有用性がないことが示唆される。また、 菌液のみをメンブレンに固定化し発色を行ったところ、発色が 起こってしまった。これは、抗体であるストレプトアビジンが 菌の細胞膜もしくは、細胞外多糖質へと結合してしまったため であろうと考えられる。これを解決するためには、未吸着のビ オチン標識ファージを除く過程でのバッファーのナトリウム濃 度を上げて多糖質を取り除く、ブロッキングの時間を長くして ストレプトアビジンの結合をより特異的にするなど条件を変え て実験を行っていく必要がある。 CDPStarでの発色による病原菌の検出限界 基質にCDPStarを用いての病原菌（L9）の検出では、103cfu の病原菌を検出することができた。（図34））102cfuに感染さ せたファージもコントロールに比べて差はあったが、標準偏差 から考えて優位な差とはいえなかった。今回の実験においては、 病原菌にビオチン標識ファージを感染させる時間を30分で行 ったが、その時間をさらに長く（60分∼）すればファージの菌 への吸着数がより多く発光量が増し検出感度が高まると考えら れる。CDPStarを用いた発光測定では、計数装置を用いてその 発光量を数値化できるためNBT・BCIPを用いた発色検定より も識別が正確になる。よって、この手法を確立すれば病原菌の 早期検出への有効な方法となる。 おわりに 本研究によって、植物病原細菌ナス科植物青枯れ病菌jkalstonia solanacearumに感染するファージを単離し、ファージゲノムのシ ークエンス解析を行い、この内、リゾチーム生産構造遺伝子相同領 域領域のクローンを利用し、この領域に海洋細菌Vibrio fisherfiの ルシフェラーゼ遺伝子1uxA， B遺伝子を融合させたマーカーエクス チェンジ用プラスミドを構築した。なお、この時点で既に、基質テ トラデカナールを添加後発光する事を確認できたが、さらに、これ をファージに相同組み換えで組換えファージを構築した。また、フ ァージ粒子をビオチンで標識し、これを青枯れ病菌に吸着させた後 に、酵素標識ストレプトアビジンと作用させる事によって、10の 2乗の青枯れ病菌を検出する事が出来た。カンキツかいよう病菌 Xan thomonas axonopodis pv． citriでは、これに感染するCP 1フ ァージについて、コートタンパク質遺伝子相同領域に上記1囲，B を挿入したレポーターファージを用いる事により、また、直接臭化 エチジウムで標識したファージ粒子を高いmoiで吸着させる事によ り、カンキツかいよう病菌を10の2乗まで検出できた。以上のよ うに、植物病原細菌の検出さらには簡易同定に、発光ファージ法が 有用である事、さらに遺伝子操作を必要としない標識ファージが同 程度の検出が可能である事を示す事が出来、今後本同定システムが 植物検疫の現場で広く利用されるものと期待している。 最後に、本研究は科学研究費補助金（基盤研究（B）（2））の援助 なしには、到底上記の様な成果を上げる事が出来なかった。本研究 報告書を纏めるにあたって、この援助に対して衷心よりお礼申し上 げたい。 図4Km「single insertion conf㎞ation double insertion ↓ ↓ 『CNC M 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M 轡燈 ㎞R→ λSty I KrnR inserted samples ＊Kanamycin cas sette from pUC4k was used as the probe． λStγ 1 図5Predicted genetic map around PRS l putative lysozyme gene 200bp gap（promoter region） ・■一 ｡；Putative ORF Markerexchange target（high homology；lysozyme？） ★ORF Finder（NCBI）was used to make the map． ▼ 図6P4282 lysozlyme vs PRS I putative lysozyme alignmetn ORFO41ys amino 1：竺三整墾；蒜；閨罐麗匿ピ酷：；魑纏㍗： 工工 0エQ P4282 ］iysin a−acid ORFO41ys am⊥no P4282 Lysin a−acid 塁：：EN9三霞：：麟霊霊藷罐；≡；：灘響 YTN fAAS 鷲 ORFO41ys am⊥no 113： S P4282 Lysin a−acid 106： ORFO41ys amino 173： P4282 Lysin’a−acid 166： ORFO41ys amino NGGT工工VATDGGRWK mGGT工工VATDGGRWK 工 P罐ll P G GASQ工 112 S TTYTRAFVTGYYAAGDGGGGAYWYDPTD sTYTRAFVTGYYAAGDGGGGAYWYDPTD SiETVSAKQFGAK工D 工TSL DDSTV工NNAKA．P工」DALGKRLY lEVSAKΩE’GAK工D DDSTV工NNAKAPLDALGKR工Y hT ［ ；；1：麗⑳題霊謬ll擁1：：：ぽ蕊麗1鑑：鑑：譲 7・6 （∠5 （∠（∠ つ」（∠ （∠に」 うムハ∠ ◎♂◎U （∠ロ」 1占−占 P4282 Lysin a−acid ORFO41ys amino 293： P4282 Lysin a−acid 286： ORFO41ys amino 353： P4282 ］二ysin a−acid 346： TCDGLEAFNAPGVAS GAAWYNSGLTVRDVE工GTGGRFGGAFSLKDFFRVN工E肝GCT’352 345 VSQV工N皿GSWΩCTFRMT酬GDNAPT工LΩRTGLSTT皿TYSSGLLGPE 工SCWDCS uSΩV工NLAGSVVQCTFRN工TANGDNAPT工LQRTGLSTTAATYSSGLLGPE HSCWDCS arn Lno 413：工RFB肛GVNHQAGLM工DFNΩMDMET甘QYGFYLKAACN工NGG工工NPAPNSAGTAAW工GVF ORFO41ys P4282 Ly・in a−acid 406・エRFNエGVNHΩAGIU）CエDENQ1！n）1）CETFΩYGFYLKAACNエNGG工工NPAPNSAGTAAWエGVF ORFO41ys amino 473： P4282 Lysin a−acid 466： P4282 Lysin a−acid 646： （∠【」 44 7・∠U （∠に」 蕊 585 592 SGA rGA 工 工V工」GNE PAT工TNT l TVLGNE FAT工TNT P4282 Lysin a−acid 586： OREO41ys amino 653： −山0 FETTNGA工工DGLDVNAZ，NVPGTPGSSYGI！［V工GNGVNKCVGTT工KNCRFRGAAS S FLS 532 FETTNGA工工DGLDVNAI［，NVPGTPGSSYGI！［VエGNGVNKCVGTTエKNCRFRGAASSFLS 525 ORFO41ys amdno 533： P4282 ］）ysin a−acid 526： ORFO41ys amino 593： 44 爵工堅ll ［ T PGT工 oGT工 TV】 一w 工 工工 NVSGGSΩT工PSGTL］NVAV］lilく 工工 SGGSQT工PSGTLNVAV工」K 652 645 ’◎’◎ ∩コnO 47’ 「 図7Promoter activity check in EPPS1 Promoter activity assay 廿⊂ 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 EPPSl NO EPPSl substrate EPPS1＋ PRSl NO EPPS1＋ PRSl DH10B DH 10B NO substrate substrate Substrate；tetradecanal 図8 Promoter activity check in L−9 LN30 L−9 substrate LN30 L−9 substrate EPPSl su］bstrate ＋pLAFR−200p−lux4B Substrate；tetradecanal 図9Marker exchange constnlct scheme 1 us ②Ligation luxAB ∀ F ③Ligation ④Ligati。mS’ilS， sα・1 −KPnI Kpn 1 Bgl I 図10Marker exchange construct scheme 2 ⑤Self−ligation （Bgl n digestion） Bgl I A771 BamH I BαmHI Bgl u Bgl n BamH I The direction of these inserted DNA fragments were same with iαc promoter． 図11Marker exchange constnlct scheme 3 ⑥Ligation pBS−USBA anti BamH I 四1▼ Sal 1 Afl n BamH I Sal I BamH I The direction of the inserted DNA fragments were opposite with lac promoter． 7 図1 2 pUC−USBA s elf lz”cAB activity c ofirmation by chemiluminesece assay 1 200000 1 000000 8 0 00 0 0 600000 400000 200000 s∨ 0 pUC−US NO pUC−USBA NO pUC−US substrate pUC−USBA substrate Substrate；tetradecanal 図13pUFR−ME PCR confirrnation ←3kb ←2kb M 1 2 3 4 5 Primer combination；luxA sense＋luxB M 1 2 3 4 5 US sense＋DS antisense（predicted length 3ユkb） antisense（predicted length 2kb） pUFR−ME 図14pUFR−ME confirmation by restriction enzyme digestion pBS−ME Sal I＆BamH I digestion pUFR−ME Sal I＆BamH I digestion 図1 5 Putative lysozyme protein over expression M Empty Empty NO 工PTG 勾N sOユ Lysl Lys2 Lys2 IPTG NO 1PTG 83kDa ｛← 62kDa 47kDa 32kDa 25kDa Dissolved in 8M Urea Target protein（predicted length 71kDa） 図16Expressed protein spot assay Expressed lysozyme Phage PRS 1（control） 図17Complementation construct scheme Ligation Promoter region （E18−200p） Putative PRS I Lysozyme 図18Biotinylated−bacteriophage adsorption efficiency check Fraction number Titer（pfU／ml） Fraction1 3。0×108 Fraction2 3．2×108 Fraction3 3．5×108 Fraction4 4．0×108 、 eraction5 Original廿ter；1．0×1010PFU 2．0×108 Titer after labeling；5．6×109PUF 図19Biotinylated phage adosorption detection Number of Biotinylated bacteriophage particles 106 105 104 103 Control（non−labeled 106PRS 1） 102 Control（biotinylated B SA） Substrate；NBT＆BCIP 図20 Chemiluminescence detection assay overview Biotinylated bacteriophage Blocking， Avidin 1cm2PVDF Air−dry binding＆Washing Tranfer membrane to a dish． containing lml AP buffer Metallic dish t Add O．1nmol CDP−Star＆ detection ● 図21Chemiluminescence assay result（after 45min） biotinylated phage chemiluminescence assay 600000 ▽⊂ 500000 400000 e←『戸’ 300000 1 200000 100000 一 0 〆ぷ〆ぷ〆ぷ〆．〆㍉〆 “〆〆ぷ Substrate；CDP−Star 図23 Chemiluminescence adsorption assay overvlew Biotinylated bacteriophage PBS washing＆ 十 Vacuum−filltration Target bacteria 旦 Durapore membrane Vacuum一 Blocking， Avidin filter（pore size；0．22｝t1） 血ltration binding＆Washing 1 Tranfer membrane to a dish containing lml AP buffer Metallic dish Add O．1nmol CDP−Star＆ detection 図24 Chemiluminescence ads orption as say result 轟’ ぷ評 ＋107biotinylated−phage particles Adsorption time；20min Substrate；CDP−Star カンキツかいよう病菌によるかいよう症状 尾崎克巳 図24．カンキツかいよう病菌によるかいよう症状 7 二・鴫ン 1 く マノぼ ・l 1＿’逗 【二㍍， バクテリオファージCPIの電子顕微鏡写真 安藤・室井 図25．バクテリオファージCPIの電子顕微鏡写真 MCPI」Pst 1 CP I Hind皿 図26．CPIゲノムの制限酵素処理断片の泳動パターン MT52T53T72T60T61TIT58T45T32T33T55 pUC 118 pUC 118 図27．CPI制限酵素処理断片のクローン 図28．ハイブリダイゼーションによるインサートの確認 CP I Genome CPI 図29．PCRによるヘッドプロテインの増幅 XP 10 相同遺伝子 クローン P39R T61F 相同性 期待値 ’Bacteriophage U5 thymidylate synthase 64．92％ 3．20E−05 汲aacteriophage Tula thymidylate synthase U2．63％ U．40E−07 汲dnterobacteria phage T6 thymidylate synthase U4．56％ V．10E−07 ・、Eぷc舵γ1c乃1αcoli O157：H7 EDL933 55．66％ 3．10E−12 fEぷo乃eγlc万αcolj O l 57：H7 EDL933 threonine synthase T6．39％ S．70E−12 f焔17仇01720η0301りノzαεbacteriophage Xp 10 T5．93％ P．50E−09 55．33％ 1．00E−12 63．75％ 9．30E−51 63．61％ 4．40E−20 63．37％ 0．23 cNA biosynthesis；autoregulated heat shock proteins 狽?窒窒獅奄獅≠唐?@large subunit P39F ’％α12仇017zo17αぷ07っノzαe bacteriophage Xp lO cNA polymerase lacking N−terminal exonuclease domain T58F ㌧叱αη仇01γzo孤301ッ批εbacteriophage XplO ??盾獅浮モ撃?≠唐?@related to epsilon chain of DNA polymerase T60F ’焔17仇01フ20170ぷ01っノzαεbacteriophage Xp l O ?獅р盾獅浮モ撃?≠唐?@of the HNH family with predicted DNA− b奄獅р奄獅〟@module in the C−terminus T61R ”λ辺17仇017zo170ぷoノタzαe bacteriophage XplO ?獅р盾獅浮モ撃?≠唐?@of the HNH family Table1．相同性検索結果1 相同遺伝子 クローン T58R ㌧駈〕η仇017zo17αぷ01っノzαεbacteriophage Xp 10 相同性 期待値 60．24％ 1．30E−36 V0．64％ R．00E−07 54．41％ 0．11 67．21％ 1．20E−18 U4．41％ T．20E−13 67．99％ 9．80E−26 U3．11％ X．80E−14 59．70％ 0，023 cNA−dependent RNA polymerase ｡ノ49アoZ）α6τeγτz4〃2τ2417zφc‘θア2ぷstr・C58 cNA−directed RNA polymerase P51R ・Sカ20γ12Zzoi5‘z／〃2〃2eliloが1021 `BC transporter， periplasmic solute−binding protein P42F ㌧癒庇加1720ηα301ッzαebacteriophage XplO @ ● 狽≠奄戟@length tape measure proteln ES乃ewαηe11αoηe∫6た72ぷ1ぷ］〉限（−1 ● 垂窒盾垂?≠№?@LambdaSo， tail length tape meausure proteln P40 ㌧叱∂17仇01フ20170301γzαεbacteriophage XplO 垂窒盾狽?≠唐?@of the ClpP family E、P3εz∠∂01720ηα5 phage D3 唐奄高奄撃≠秩@to Streptomyces coelicolor ClpP protease P45 ・」Boγ4eτello bγoηc疏3qワカcα blp Protease Table2．相同性検索結果2 相同遺伝子 クローン P42R ゜焔17仇oη70η0307・vzoe bacteriophage Xp l O ／ 相同性 期待値 66．83％ 1．10E−12 65．53％ 3．20E・・72 65．10％ 1．90E−52 59．97％ 1．60E−48 66．02％ 9．70E−54 T7．23％ Q．10E−26 モ盾獅唐?窒魔?п@phage protein TlF ㌧梅12仇017zo170301・vzoe bacteriophage Xp l O ●！ モ盾獅唐?窒魔?п@phage protein；central region TlR ㌧梅17仇017zo1昭307・vzαe bacteriophage Xp 10 ／ モ盾獅唐?窒魔?п@phage protein；central region T55R ㌧酩αη仇01720η0301ッzαebacteriophage XplO モ盾獅唐?窒魔?п@phage protein；central region P43 ㌧塩17仇01720ηαぷo門！膓αεbacteriophage Xp l O @ ●〆． ??≠п@ortal roteln fBacteriophage philO26b @ UtatiVe Ortal rOtein Table3．相同性検索結果3 Sulfb−NHS−LC−Biotin（PIERCE） 一Na＋i io” NH2 十 O N・も N NHS スペーサー 旦ユ ビオチン m 一Na＋ ρ N，flv’vNv）R 十 H N−OH 0 図30．ファージへのビオチン標識 ビオチン標識ファージ（pfU） 1010 107 109 106 108 105 図31．ビオチン標識ファージの検出限界 ビオチン標識ファージ バッファー バッファーを加える ◎◎⑧撹属秒） 齢’1°5u”） メンブレン（PVDF）に固定化 ビオチンとアビジンを結合させる ee：e．基質：NB＿PまたはCDPStar ／ 図32．ビオチン標識ファージを用いた病原菌の検出方法 菌数（cfU） 109 108 107 106 105 104 Biotinylated CP I 105（菌のみ） 基質：NBT・BCIP 図33．ビオチン標識ファージを用いた病原菌（L9）の検出1 25000 完 ⊂ 20000 8 8 ＼ 15000 1 9 ＼310000 0圃 網 5000 0 104 103 102 control 轍旬 計測：60分後 基質：CDPStar 図34．ビオチン標識ファージを用いた病原菌（L9）の検出2
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