F o r O r d e r i n g I n f o r m a t i o n a n d Te c h n i c a l S e r v i c e , c o n t a c t y o u r l o c a l S i g m a - A l d r i c h o f f i c e 179 細胞培養用キットマイコプラズマ検出マイコプラズマによる細胞培養コンタミネーションの試験法と細胞の固定して最も効果的な方法は、 in situ DNA蛍光染色です。 1) Carnoy固定液を、使用当日に新しく調製します。この固 Bisbenzimide（Hoechst 33258）や4',6-ジアミジノ-2-フェニ定液は、メタノールと氷酢酸を3：1の割合で混合したものルインドール（DAPI）は、DNAのアデニン・チミジン（A-T）です。すべての細胞培養の固定に十分な量の固定液を調製塩基対に特異的に結合するDNA結合性蛍光色素です。マイコしてください。培養ごとに約15 mlの固定液が必要です。プラズマによりコンタミネーションした細胞培養では、核外部 2) 増殖培地をデカントせずに、各培地に約5 mlのCarnoy固定の細胞質領域に均一な形の小さな蛍光体の存在がはっきりと認液を添加し、2分間静置します。められます。培養細胞の核自体も蛍光を発します。 3) 培地をデカントし、5 mlの固定液を添加して5分間静置しアーティファクトが蛍光を発し、試験結果の判定を妨害するます。場合があります。アーティファクトはマイコプラズマよりも 4) 固定液をデカントし、新しい固定液5 mlをさらに添加して大きく、不規則な形態をしています。対数増殖期にある正常 5分間静置します。な指標細胞と試験細胞を併用することで、アーティファクトによる妨害が抑えられます。 5) 最後に、固定液をデカントし、増殖表面を約5分間風乾させます。 • 指標細胞、Vero細胞（ATCC® CCL 81またはECACC 84113001）または3T6-Swiss albino細胞（ATCC® CCL 96またはECACC 86052701） • Leightonチューブまたはガラス製カバースリップ/培養ディッシュ • 細胞培養培地（増殖培地） • メタノール • 氷酢酸 • Bisbenzimide（製品番号B 1155）またはDAPI （製品番号D 8417） • Mounting Solution McIlvanine's Buffer: Glycerol [1:1] （製品番号M 7534） • 蛍光顕微鏡（手順「培養の試験」を参照）手順サンプル細胞と指標細胞の培養 1) 指標細胞を、細胞培養培地を含むLeightonチューブまたは培養ディッシュ内に並べたガラス製カバースリップの上に低密度で播種します。使用する培地に適した条件（一般的にはCO 2濃度5%または2%で37°C）で24時間インキュベートします。対照サンプルおよび試験サンプルの播種に備え、十分な数の培養を作成してください。細胞の染色と封入 1) 蛍光色素（Bisbenzimide）を蒸留水に0.25∼0.5 µg/mlで溶解し、使用濃度の蛍光染色剤を調製します。ストック溶液は濃度50 µg/mlとし、暗所に保存してください。ストック溶液は滅菌し、染色性能が低下したら廃棄してください。注：BisbenzimideのかわりにDAPIを用いることもできます。DAPIはPBSに0.1 µg/mlで溶解してください。細胞の染色は15∼30分間行なってください。 2) 増殖表面を染色液に完全に浸し、30分間静置します。 3) 蒸留水で2回洗浄します。 4) 細胞側を下向きとして、スライドガラスの上に封入剤1滴を滴下して増殖表面を封入します。スライドは、カバーガラスとカバースリップの端を透明マニキュアで密封することで保存することが可能です。スライドは遮光し、断熱してください。正しく保存した場合、スライドが退色することなく数週間保存することができます。シグマ・アルドリッチでは、上記のHoechst染色法に必要なすべての試薬を含むMycoplasma Stain Kit（製品番号 MYC-1）を販売しています。このキットには、試験スライドとの比較用として陽性対照スライドと陰性対照スライドも付属しています。培養の試験染色サンプルの観察には落射蛍光照明を備えた蛍光顕微鏡が必要です。一般的なシステムは、53/44バリアフィルターとBG2) 指標細胞培養を分離し、0.1 mlの試験サンプルを加えます。 3励起フィルターを備えた蛍光顕微鏡です。マイコプラズマの陰性対照としては、指標細胞培養に0.1 mlの細胞培養培地観察には、通常は倍率500倍（40×12.5）で十分ですが、さらのみを加えます。陽性対照が必要とされる場合は、指標細に高倍率を用いる場合もあります。胞培養に0.1 mlのマイコプラズマ培養生菌を加えて感染させます。参考文献 3) すべての培養をさらに4日間インキュベートします。注：培養はコンフルエントに達する前に染色、観察することが重要です。サンプル細胞と指標細胞の特性に従って、インキュベーション時間と播種密度を調節してください。 1. T.R. Chen, Exp. Cell. Res., 104, 255-262, 1977. 2. R.J. Hay, et al., Nature, 339, 487-488, 1989. 3. G.J. McGarrity, et. al., In: Methods in Mycoplasmology Vol. 2 Tully and Razin (eds). Academic Press, Inc., New York, NY, 487-488, 1983. ATCC®はAmerican Type Culture Collectionの登録商標です。細胞培養用キット材料