〇
0
A
特 許 協 力 条 約 に 基 づ い て 公 開 され た 国 際 出 願
(12)
7
(19)
5
2
世界 知 的所有権機 関
国際事 務 局
(43) 国 際 公 開 曰
2011 年 6 月 9 日 （
09.06.2011)
え（
ITAGAKI
Hatsue)
区芝浦 四丁 目 2 番
ス 株 式 会 社 内 Tokyo
国際特 許分 類 ：
(51)
G01N
33/569
(2006.01)
C07K
16/12
(2006.01)
C12N
15/09
(2006.01)
C12Q
1/68 (2006.01)
G01N
33/53
(2006.01)
(21)
国際 出願 番 号 ：
(22)
国 際 出 願 日：
(25)
国際 出願 の 言 語 ：
日本 語
(26)
国際 公 開の 言語 ：
日本 語
(30)
(71)
PCT/JP20
年
2010
優 先権 デー タ：
特 願 2009-2761 15
寺願 2010-023 102
12
月
3
[JP/JP];
号
8
〒 1088559 東 京 者 港
三 菱 化 学 メデ イエ ン
(JP).
(74)
代 理 人 ：森 田 憲 一 ， 外 (MORITA
Kenichi
et al);
〒 1730004 東 京 都 板 橋 区 板 橋 二 丁 目 6 7 番 8 号
板 橋 中 央 ビル 5 階 Tokyo (JP).
(81)
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内 保
護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
10/07 1652
曰（03. 12.2010)
BB,
BG,
BH,
BR,
BW,
CR, CU, CZ, DE, DK,
BY,
BZ,
DM,
CA,
GB, GD, GE, GH, GM,
GT, HN,
12
JP
JP, KE,
KG,
KM,
KN,
KP,
2
JP
LS,
LU,
LY,
MA,
MD,
ME,
出願 人 （
米 国 を 除 く全 て の 指 定 国 に つ い て )：三
菱 化 学 メデ ィエ ンス株 式 会 社 （
Mitsubishi
Chemi
cal Medience
Corporation)
[JP/JP]; 〒 1088559 東 ¾ 者
港 区 芝 浦 四 丁 目 2 番 8 号 Tokyo (JP).
MX,
NG, NI,
NO,
200
2010
年
年
月 4 曰（04.12.2009)
月 4 曰 （04.02.2010)
発 明 者 ；お よ び
発 明 者 / 出願 人 （
米 国 に つ い て の み )：皆 川 温 子
〒 1088559 東 者 港
(MINAGAWA
Atsuko)
[JP/JP];
区芝浦 四丁 目 2 番 8 号
三 菱 化 学 メ デ イエ ン
ス 株 式 会 社 内 Tokyo JP ) . 廣 島 豊 正 (HIROSHI
M A Tovomasa)
[JP/JP1; 〒 1088559 東 京 都 港 区 芝 浦
四丁 目 2 番 8 号
三 菱 化 学 メ デ ィエ ンス株 式
会 社 内 Tokyo (JP). 島 田
康 司（
SHIMADA
Yasushi) [JP/JP]; T 1088559 東 京 都 港 区 芝 浦 四 丁 目 2
番 8 号
三 菱 化学 メデ ィエ ンス株 式 会 社 内
杉 山
禾□ 之 （
Tokyo
JP).
SUGIYAMA
Kazuyuki)
〒 1088559 東 京 都 港 区 芝 浦 四 丁 目 2 番 8
[JP/JP];
号
三
化 学 メ デ ィ エ ン ス 株 式 会 社 内 Tokyo
優 樹 (Mitobe Yuki) [JP/JP]; 〒 1088559
(JP). 水 戸 部
東京都 港 区芝浦 四丁 目 2 番 8 号
三菱化学 メ
デ ィ エ ン ス 株 式 会 社 内 Tokyo (JP). 板 垣
はつ
LT,
MY,
MZ,
NA,
CH,
CL,
CN,
CO,
DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
HR, HU,
KR,
KZ,
ID, IL, IN, IS,
LA,
MG,
NZ,
LC,
MK,
LK,
MN,
OM,
LR,
MW,
PE, PG, PH,
PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,
SV, SY, TH, TJ, TM,
VC, VN,
(84)
ZA, ZM,
TN, TR, TT, TZ, UA,
UG, US, UZ,
ZW.
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保
護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユ ー ラ シ ア
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ョ一 ロ ッパ
(AL,
AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK,
GB, GR, HR, HU,
NL,
NO,
(BF,
PL,
IS, IT, LT, LU,
IE,
PT, RO,
RS, SE, SI, SK,
BJ, CF, CG, CI, CM,
GA,
GN,
21
条 (3))
EE, ES, FI, FR,
LV,
MC,
SM,
MK,
TR),
GQ, GW,
ML,
MT,
OAPI
MR,
NE, SN, TD, TG).
添付 公 開書 類 ：
一
一
国際調 査報 告 （
条約第
明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リス ト
(規 則 5.2(a))
<
(54) Title:
METHOD
MYCOPLASMA
FOR DETECTING
発 明 の 名 称 ：マ イ コ プ ラ ズ マ
生 物 を検 出 す る 方 法
(54)
(57) Abstract:
pneumoniae
moniae
MICROORGANISMS
BELONGING
T O MYCOPLASMA
PNEUMONIAE
AND/OR
GENITALIUM
Disclosed
and/or
are a detecuon
Mycoplasma
o r Mycoplasma
genitalium
genitalium
二 」. — モ ニ エ 及 び ノ 又 は マ イ コ プ ラ ズ マ
method
and a detecnon
infections.
kit,
The detection
each ior quickly
method
ジ ェニ タ リウ ム に 属 す る微
and specincally
and detection
diagnosing
kit use DnaK
Mycoplasma
o f Mycoplasma
pneu
as an indicator.
要 約 ： マ イ コ プ ラ ズ マ ニ ュ ー モ ニ エ 及 び / "又 は マ イ コ プ ラ ズ マ
ジ ェニ タ リウ ム 感 染 症 を 迅 速 か
つ 特 異 的 に 診 断 す る た め の 検 出 方 法 及 び 検 出 キ ッ トを 提 供 す る 。 マ イ コ プ ラ ズ マ ニ ュ ー モ ニ エ 又 は マ
ィ コ プ ラ ズ マ ジ ェ ニ タ リウム の D n a K を 指 標 とす る 。
(57)
明
発 明の名称
マ イ コ プ ラズ マ
細
書
：
ニ ュー モ ニ エ 及 び
又 はマ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ
ム に属 す る微 生 物 を検 出 す る 方 法
技術分野
本発 明 は、一般 的 な肺 炎の原 因微 生物 で あ るマ イ コ プラズ マ
[0001 ]
ェ (Mycop l asma pneumon i ae)
Mycop l asma
gen i t a l i urn)
及ひ
又 はマ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ
シ ェ ニ タ リウ ム
(
に 属 す る微 生 物 の 検 出 に 特 異 的 な 分 子 を 指 標 とす る
、 該 微 生 物 の 検 出 方 法 、 及 び 該 微 生 物 の 検 出 用 試 薬 キ ッ トに 関 す る 。
背景技術
[0002]
(
) マ イ コ プラズ マ
マ イ コ プラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 肺 炎 の 患 者 割 合 と症 状
ニ ュ ー モ ニ エ 感 染 症 は 、 市 中 非 定 型 肺 炎 に 分 類 され 、 市
中 肺 炎 に 占 め る 割 合 は 成 人 で は 3 0 〜40% 、 15 〜25 歳 の 若 年 成 人 に 限 る と 6 0 〜 7
0 % に 及 ぶ と され て い る 。 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ の 感 染 経 路 は経 気 道
感 染 で あ り、 学 校 な ど の 施 設 や 家 族 内 で の 感 染 が 拡 大 す る こ と も 少 な くな い
。 また マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ感 染 症 に お い て 、 肺 炎 は感 染 症 の 約 3〜
5 % に 起 こ り、 残 りは 気 管 支 炎 、 上 気 道 炎 、 不 顕 性 感 染 と な る 。 特 徴 的 な 症 状
と して 感 染 初 期 か ら喀 痰 を 伴 わ な い 頑 固 な 咳 嗽 で 、 発 熱 、 頭 痛 、 咽 頭 痛 、 悪
寒 、 全 身 倦 怠 な ど の 症 状 を 伴 う場 合 も あ る 。
[0003]
( 2 )
マ イ コ プラズ マ
マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ感 染 症 の 検 査 の 現 状
ニ ュ ー モ ニ エ 感 染 症 の 検 査 と して 、 患 者 咽 頭 拭 い 液 か ら
の 培 養 検 査 、 患 者 血 清 を用 いた 抗 体 検 査 が 一 般 的 で あ る 。 培 養 検 査 は マ イ コ
プラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 自体 が 特 殊 な 培 地 で しか 発 育 しな い こ と 、 手 技 が 困
難 な こ とや 、 最 終 的 な マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ の 同 定 に は P C R 検 査
を 実 施 す る 必 要 性 が あ る こ と か ら 、 限 られ た 施 設 で しか 検 査 で き な い の が 現
状 で あ り、 ま た 培 養 に 数 週 間 が 必 要 と な る た め 、 迅 速 に 結 果 が 得 られ る 検 査
が 求 め られ て い る 。
[0004]
一 方 、抗 体 検 査 は 、 一 般 的 に は培 養 検 査 に比 べ 、手 技 が 容 易 で迅 速 に結 果
が 得 られ る た め 、 良 く用 い られ る 検 査 で あ る が 、 マ イ コ プ ラ ズ マ の I g M 抗
体 価 は 持 続 性 が あ る た め 、 以 前 の 感 染 か 、 今 回 の 感 染 か の 判 断 が 難 しい こ と
、 抗 体 価 上 昇 ま で に 時 間 が か か る こ とが 問 題 とな る 。 それ らを解 決 す るた め
、 感 染 急 性 期 と 回 復 期 の 経 時 的 な 抗 体 価 の 上 昇 に よ る 判 断 が 推 奨 され て い る
力、 回 復 期 ま で の 抗 体 検 査 を 行 う こ と は 非 常 に 時 間 を 要 す る た め 、 治 療 が 遅
れ 、 患 者 に と っ て は 症 状 の 長 引 き や 悪 化 を 招 い た り、 更 に は 二 次 感 染 に よ る
感 染拡 大 の 悪 影 響 を及 ぼす 可 能 性 が あ る。
[0005]
ま た 、 上 記 の 問 題 を解 決 す るた め 、 マ イ コ プ ラズ マ
を診 断 す るた め の 有 用 な マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ感 染症
ニ ュー モ ニ エ に属 す る微 生 物 を特
異 的 に 検 出 す る 抗 体 や 検 出 方 法 が 開 示 され て い る 。
例 え ば 、 特 許 文 献 1 は 、 約 4 3 キ ロ ダ ル トン
（KDa)
の マイ コプラズ マ
二
ユ ー モ ニ エ の 膜 抗 原 蛋 白 質 に 対 す る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を 用 い た 免 疫 検 出 法
が 記 載 さ れ て い る 。 ま た 、 特 許 文 献 2 は 、 リボ ソ ー ム 蛋 白 質 L 7
対 す る抗 体 を用 い、 マ イ コ プ ラズ マ
L 1 2 に
ニ ュ ー モ ニ エ の 検 出 を 精 度 良 く行 う こ
と が で き る こ と が 記 載 され て い る 。 ま た 、 特 許 文 献 3 は 、 マ イ コ プ ラ ズ マ ニ ュー モ ニ エの P
蛋 白 質 に 対 す る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 で 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
属 の 他 の 種 又 は 共 存 す る 菌 叢 の 他 の 病 原 種 と は 1 % も し くは そ れ 未 満 の 交 差
反 応 性 しか 示 さ な い モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に よ っ て 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー
モ ニ エ 感 染 の 迅 速 か つ 特 異 的 な 診 断 が 可 能 と な る こ と が 記 載 され て い る 。
[0006]
しか し、 上 記 抗 体 及 び 当 該 抗 体 を 用 い る 検 出 法 は 、 臨 床 検 体 中 の マ イ コ プ
ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ に属 す る微 生 物 を検 出 す るた め に は 、 該 微 生 物 を含 む
検 体 の 煩 雑 な 前 処 理 が 必 要 な 場 合 も あ り、 未 だ 、 特 異 性 や 感 度 が 低 くマ イ コ
プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ に対 す る特 異 的 な診 断 の た め に は不 十 分 で あ る とい
う問 題 が あ る 。
[0007]
( 3 )
マイ コプラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム と疾 患
非 淋 菌 性 尿 道 炎 の 主 要 な 起 炎 菌 と して は ク ラ ミ ジ ァ
v d i a trachomat
is)
トラ コ マ チ ス
(Ch i a m
が 知 られ て い る 。 しか し、 非 淋 菌 性 尿 道 炎 患 者 に お い て
ク ラ ミジ ァ
トラ コ マ チ ス が 検 出 され る の は 3 0 〜 40% 程 度 で あ り、 多 く は そ
の 症 状 が 何 に 由 来 す る か 明 らか で な い 。 ク ラ ミ ジ ァ
トラ コ マ チ ス 以 外 に つ
い て は 、 マ イ コ プ ラ ズ マ 属 及 び ゥ レア プ ラ ズ マ 属 の 微 生 物 が 注 目 され て お り
、特 にマ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム は 、 非 淋 菌 性 尿 道 炎 及 び 性 行 為 感 染
症 の 起 炎 菌 の 1つ と して 示 され て い る 。
[0008]
( 4 ) マ イ コ プラズ マ
マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 の 検 査 の 現 状
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 は 、 論 文 で は 培 養 法 や P C R 法 に
よ る 報 告 例 が あ る が 、 これ らの 方 法 は 迅 速 な 診 断 を 行 う こ と が で き な い た め
、迅 速 か つ特異 的 に臨 床検 体 中の マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム に 属 す る
微 生 物 を 検 出 す る 方 法 が 求 め られ て い る 。
先行技術文献
特許 文献
[0009]
特 許 文 献 1 ：特 開 昭 6 3 -
2 9 8 号公報
特 許 文 献 2 ：国 際 公 開 W O 2 0 0 1
0 5 7 1 9 9 号 パ ンフ レツ ト
特 許 文 献 3 ：特 開 平 5 — 3 0 4 9 9 0 号 公 報
発 明の概 要
発 明 が 解 決 しょ う とす る 課 題
[001 0]
従 来 の 方 法 に よれ ば 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
又 はマイ コプ
ジ ェ ニ タ リウ ム に 属 す る微 生 物 を 、 迅 速 か つ 特 異 的 に 検 出 す る こ と
は で き な か った 。 よ って 、 マ イ コ プ ラ ズ マ . ニ ュー モ ニ エ 及 び
プラズ マ
又 はマイ コ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 を 迅 速 に 診 断 す る こ とが で き ず 、 治 療 が 遅
れ 、 患 者 に と っ て は 症 状 の 長 引 き や 悪 化 を 招 い た り、 更 に は 二 次 感 染 に よ る
感 染 拡 大 の 悪 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ る の が 現 状 で あ る 。 これ ら マ イ コ プ ラ
ズ マ へ の 感 染 を迅 速 に検 出
診 断 で きれ ば 、 マ イ コ プ ラ ズ マ に 有 効 な マ ク ロ
ラ イ ド系 抗 生 物 質 の 投 与 が 可 能 と な り、 感 染 初 期 に 的 確 な 治 療 を 開 始 す る こ
とが 可 能 とな る 。
—方 、 マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ とマ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リゥ ム
は 、 血 清 学 的 に は 非 常 に 近 い こ と が 知 られ て い る が 、 上 述 した よ う に 、 マ イ
コ プラズ マ
所
ニ ュー モ ニ エ とマ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム の 感 染 す る 場
（
組 織 や 器 官 な ど） が 異 な る こ とか ら、 両 微 生 物 を 特 異 的 に 検 出 す る こ と
が 可 能 な 分 子 を 同 定 で き れ ば 、 該 分 子 を 指 標 と して 、 両 感 染 症 を 診 断 す る こ
と が 可 能 と な る と考 え た 。
本 発 明 は 上 記 問 題 に 鑑 み て な され た も の で あ り、 マ イ コ プ ラ ズ マ
モ ニ エ及 び
又 はマ イ コ プラズ マ
ニ ュー
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 を 迅 速 か つ 特 異 的
に 診 断 す る た め の 分 子 を 特 定 し、 該 分 子 を 指 標 と した 検 出 方 法 、 検 出 キ ッ ト
を 提 供 す る こ と を 目 的 と した 。
課 題 を解 決 す る た め の 手 段
[001
本 発 明 者 らは 、 上 記 の よ うな 現 状 に鑑 み て 鋭 意 検 討 を 重 ね た 結 果 、 マ イ コ
プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
又 はマ イ コ プラズ マ
迅 速 か つ 特 異 的 に検 出 す るた め に マ イ コ プ ラズ マ
マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 を
ニ ュー モ ニ エ及 び
又は
ジ ェ ニ タ リウ ム が 属 す る微 生 物 の 有 す る D n a K を 指 標 と
す る こ と を 見 出 した 。 D n a K 蛋 白 質 は 、 熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 7 0
k Prote i n 70 、 Hsp70)
(Heat
Shoe
と も 呼 ば れ 、 細 胞 が 熱 等 の ス トレス 条 件 下 に さ ら され
た 際 に 発 現 量 が 上 昇 して 細 胞 を 保 護 す る 蛋 白 質 の 一 群 と して 発 見 され 、 現 在
で は 翻 訳 され た 蛋 白 質 の 細 胞 内 で の 輸 送 や r efo I d i ng ( 分 子 シ ャ ペ ロ ン 機 能 ）
に 関 与 す る こ と が 知 られ て い る 。 免 疫 学 的 測 定 法 に お い て D n a K 蛋 白 質 を
指 標 とす る 利 点 は 、
（1
) D n a K 蛋 白 質 は 蛋 白 質 の 輸 送 や refo l d i ng に 関 与 す
る 蛋 白 で あ る こ と か ら 、 常 に 発 現 して い る 蛋 白 質 で あ る こ と 、
の 1 % 程 度 が D n a K で あ る こ と、
（3)
（2)
総 蛋 白質 中
存 在 様 式 は 、 単 量 体 で は な く、 3 量 体
、 6 量 体 、 そ れ 以 上 の 多 量 体 が 存 在 して い る こ と で あ る 。
本 発 明 は こ の 知 見 に 基 づ い て 成 し遂 げ られ た も の で あ る 。
[001 2]
す な わ ち 、 本 発 明 に よ れ ば 、 以 下 の も の が 提 供 され る 。
[ 1]
マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
の D n a K を 指 標 とす る こ と を 特 徴 とす る 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
又 はマ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム の 検 出 方 法 。
ジ ェ ニ タ リウ ム
ニ ュー モ ニ エ
[ 2 ]
D n a K 蛋 白質 を免 疫 学 的 に分 析 す る、
[ 3 ]
マ イ コ プラズ マ
[ 1 ]
の方法。
ニ ュー モ ニ エ又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム
に特異 的 な抗 D n a K 抗体 。
[ 4 ]
[ 3 ]
の 抗 D n a K 抗 体 を含 む 、 マ イ コ プ ラズ マ
マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ又 は
ジ ェ ニ タ リ ウ ム の 検 出 用 キ ッ ト。
[ 5 ]
D n a K 遺 伝 子 を 指 標 とす る 、
[ 6 ]
マ イ コ プラズ マ
[ 1 ]
の方法。
ニ ュー モ ニ エ又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム
に 特 異 的 な プ ラ イ マ 一 又 は プ ロー ブ 。
[ 7 ]
[ 6 ]
の プ ラ イ マ 一 又 は プ ロー ブ を 含 む 、 マ イ コ プ ラ ズ マ . ニ ュ ー モ
ニ ェ又 はマ イ コ プラズ マ
[001 3 ]
ジ ェ ニ タ リ ウ ム の 検 出 用 キ ッ ト。
本発 明 にお いて "該微 生物 "
はマ イ コ プラズ マ
とは、 マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ あ る い
ジ ェ ニ タ リ ウ ム を 意 味 し、 特 に 、 病 原 性 を 有 し、 下 記 で
述 べ る 疾 患 の 原 因 菌 と して 診 断 の 意 義 の 高 い 微 生 物 を い う 。 本 発 明 に お い て
、 " 該 微 生 物 と特 異 的 に 反 応 す る 抗 体 "
とは 、該 微 生 物 の種 あ る い は属 に特
異 的 に反 応 す る抗 体 を指 す が 、微 生 物 感 染症 の 診 断 に お いて は該 微 生 物 の種
に特 異 的 に反 応 す る抗 体 が 特 に有 用 とな る。
発 明の効 果
本 発 明 に お け る 特 定 分 子 を 指 標 と した マ イ コ プ ラ ズ マ
[001 4 ]
又 はマ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム に 属 す る微 生 物 を検 出 す る 方 法 に よ
れ ば 、 該 微 生 物 が 引 き 起 こす マ イ コ プ ラ ズ マ
コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
ニ ュー モ ニ エ及 び
又はマイ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 を 、 迅 速 か つ 特 異 的 に 診 断 を 行 う こ とが
で きる。
図面の簡単 な説 明
[001 5 ]
[ 図 1] マ イ コ プ ラ ズ マ
P
ニ ュ ー モ ニ エ M 1 2 9株
（P 1 遺 伝 子 型 ： I 型 ） と F H株
遺 伝 子 型 ：I I 型 ） に お け る D n a K 遺 伝 子
（
配列番号 6 ) の塩基配列
（
（
第 1 〜 7 2 0 番 ） を 比 較 した 結 果 を 示 す 説 明 図 で あ る 。
[ 図 2] 図 1 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
子の塩基配列
ニ ュー モ ニ エ両株 に お け る D n a K 遺 伝
（
第 7 2 1 〜 1 4 4 0 番 ） を 比 較 した 結 果 を 示 す 説 明 図 で あ る
[ 図 3] 図 1 及 び 図 2 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る D n
a K 遺伝子の塩基配列 （
第 1 4 4 1 〜 1 7 8 8 番 ） を 比 較 した 結 果 を 示 す 説
明図で ある。
[ 図 4] マ イ コ プ ラ ズ マ . ニ ュ ー モ ニ エ Μ129株
（Ρ 1 遺 伝 子 型 ： I 型 ） と F H株
（
Ρ 1 遺 伝 子 型 ：I I 型 ） に お け る Ρ 1 遺 伝 子 （
Μ129株 ：配 列 番 号 7 、 F H株 ：配
列番号 8 ) の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 1 〜 7
7 番 ） を 比 較 した 結 果 を
示す説 明図で ある。
[ 図 5] 図 4 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る
Ρ
遺伝子の
塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 7 1 8 〜 1 4 1 6 番 ） を 比 較 した 結 果 を 示 す 説
明図で ある。
[ 図 6] 図 4 及 び 図 5 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る
Ρ
遺伝子の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 1 4 1 7 〜 2 1 3 6 番 ） を 比 較 した 結
果 を示 す 説 明 図 で あ る。
[ 図 7] 図 4 〜 図 6 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る
Ρ
遺
伝子の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 2 1 3 7 〜 2 8 5 6 番 ） を 比 較 した 結 果
を示 す 説 明 図 で あ る。
[ 図 8] 図 4 〜 図 7 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る
Ρ
遺
伝子の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 2 8 5 7 〜 3 5 6 4 番 ） を 比 較 した 結 果
を示 す 説 明 図 で あ る。
[ 図 9] 図 4 〜 図 8 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 両株 に お け る
Ρ
遺
伝子の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 3 5 6 5 〜 4 2 8 4 番 ） を 比 較 した 結 果
を示 す 説 明 図 で あ る。
[ 図 10] 図 4 〜 図 9 に 続 き 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ 両株 に お け る Ρ
遺伝子の塩基配列 （
Μ129株 に 関 して 第 4 2 8 5 〜 4 8 8 4 番 ） を 比 較 した 結
果 を示 す 説 明 図 で あ る。
発 明 を実施 す るた めの 形 態
以 下 、本 発 明 を更 に詳 細 に説 明す るが 、 以 下 の構 成 要 件 の 説 明 は 、本 発 明
の 実 施 態 様 の 代 表 例 で あ り、 本 発 明 は これ らの 内 容 の み に 特 定 され る も の で
はな い。
本発 明の マ イ コ プラズ マ
[001 7 ]
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リ
ゥ ム の 検 出 方 法 は 、 該 微 生 物 の D n a K を 指 標 と して 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ユ ー
モ ニ エ及 び
プラズ マ
又 は マ イ コ プ ラ ズ マ . ジ ェ ニ タ リウ ム
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
方 、 あ る いは、 マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リ ウ ム の 両 方 ） を 検 出 す る こ と を 特 徴 と して お り、 これ
又 はマ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ感 染 症 及
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 を 診 断 す る こ とが で き る 。
本 発 明 に よ り診 断 され る マ イ コ プ ラ ズ マ
[001 8 ]
ジ ェニ
ニ ュー モ ニ エ及 び マ イ コ
らの 微 生 物 を 検 出 す る こ と に よ り、 マ イ コ プ ラ ズ マ
び
（
す なわ ち、マイ コ
ジ ェ ニ タ リウ ム の い ず れ か 一
タ リゥ ム の 両 方 、 特 に 好 ま し くは マ イ コ プ ラ ズ マ
プラズ マ
二
ニ ュー モ ニ エ感 染 症 とは 、 マ イ
コ プラズ マ肺 炎 で あ る。 また 、 マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 と は
、 非 淋 菌 性 非 ク ラ ミジ ァ 性 尿 道 炎 、 子 宮 頸 管 炎 で あ る 。
マ イ コ プラズ マ
[001 9 ]
ニ ュ ー
ニ ュー モ ニ エ感 染 症 を診 断 す る際 に は 、 マ イ コ プ ラズ マ
モ ニ エ が 存 在 す る可 能 性 の あ る試 料 を使 用 す れ ば 良 い が 、例 え ば 咽
頭 拭 い 液 、 鼻 腔 拭 い 液 、 鼻 腔 吸 引 液 、 鼻 汁 、 喀 痰 、 肺 胞 洗 浄 液 が 挙 げ られ る
。 マ イ コ プラズ マ
マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 感 染 症 を 診 断 す る 際 に は 、 マ イ コ プ ラ ズ
ジ ェ ニ タ リウ ム が 存 在 す る 可 能 性 の あ る試 料 を使 用 す れ ば 良 い が 、 例 え
ば 尿 、 尿 道 や 子 宮 頸 管 擦 過 物 が 挙 げ られ る 。 上 記 2 つ の 感 染 症 が い ず れ で あ
る か の 識 別 は 、 測 定 対 象 とす る試 料 の 採 取 場 所 に よ っ て 決 定 す る こ とが で き
る。
本 発 明 に お い て 指 標 とす る D n a K は 、 例 え ば 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
[0020]
モ ニ エ 由来 の D n a K 蛋 白質
（N C Β I 番 号 ：NPJ 1 0 1 22)
( N C B I 番 号 ：NG_00091 2 REG I ON : 521 837. . 523624)
マ
ジ ェ ニ タ リゥ ム 由 来 の D n a K 蛋 白 質
n a K 遺伝子
（N C B I 番 号 ：L43967
、
ニ ュ ー
D n a K 遺伝子
又 は、 マ イ コ プラズ
（N C Β I 番 号 ：AAG71 527)
REG I ON : 37491 9 . . 376706)
、
D
で ある。上
記 に挙 げた 蛋 白質 あ る い は遺 伝 子 は 、 該 微 生 物 に属 す る一 つ の 菌株 の例 で あ
り、本 発 明 に お いて 対 象 とす る該 微 生 物 の 有 す る D n a K 配 列 は上 記 D n a
K 蛋 白質 あ る い は遺 伝 子 に相 当す る配 列 を示 す 。
ニ ュー モ ニ エ の D n a Κ
また 、実 施 例 8 に示 した よ うに マ イ コ プ ラズ マ
遺 伝 子 は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ の P
遺 伝 子 の 型 が異 な る株 間 に
お いて も 1 0 0 % _ 致 し、 また 、異 な る分 離 地 お よび 、過 去 5 0 年 間 に お い
て も変異 が 認 め られ な か った 。 そ この こ とか ら、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ
ニ ェの D n a K 遺 伝 子 及 び D n a K 蛋 白質 の 配 列 は安 定 して い る と考 え られ
る。 よ って 、前 記 N C B I で公 開 され て い る遺 伝 子 配 列 あ る い は蛋 白質 配 列
を参 照 す る こ とが 好 ま しい。
[0021 ]
1 . 抗 体 を用 いた 該 微 生 物 の検 出方 法 及 び キ ッ ト
本 発 明 の マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リ
ゥム を検 出す る方 法 の 第 一 の 態 様 と して は 、該 微 生 物 に特 異 的 な抗 D n a Κ
抗 体 を用 い る こ とを特 徴 と して い る。 な お 、特 異 的 な抗 体 を選 択 す る際 に は
、該 微 生 物 へ の 感 度 が 少 な くと も 1 0
C F U
5
C F U
m L 以上 、 更 に好 ま し くは 1 0 3 C F U
生 物 へ の 感 度 は少 な くと も 1 0 7 C F U
m L 以上 、 好 ま し くは 1 0
4
m L 以上 あ り、 対 象 外 の微
m L 以 下 、 好 ま し くは 1 0
8
C F U
L 以 下 で あ る。
本 発 明 で用 い る こ との で き る抗 体 は 、 ポ リク ロ一 ナ ル 抗 体 又 は モ ノ ク ロ一
ナ ル 抗 体 の いず れ も使 用 す る こ とが で き、 以 下 の 方 法 あ る い は そ の他 の 類 似
の 方 法 に よ って取 得 す る こ とが で き るが 、 これ らの 方 法 に限 定 され る もの で
は な い。
[0022]
該 抗 体 の 作 製 方 法 の 第 一 の 態 様 と して は 、上 記 D n a K 蛋 白質 の 全 長 あ る
い は そ の 部 分 べ プチ ドを用 いて作 製 す る こ とが で き る。該 D n a K 蛋 白質 の
遺 伝 子 配 列 及 び ァ ミ ノ 酸 配 列 が 既 知 の微 生 物 に つ いて は 、他 の微 生 物 に お け
る該 蛋 白質 の ァ ミ ノ 酸 配 列 との 類 似 性 の 少 な い領 域 に つ いて ペ プチ ド断 片 を
合 成 す れ ば 良 い。抗 体 を作 成 す るた め の ぺ プチ ドの 長 さは特 に限 定 され な い
が 該 D n a K 蛋 白質 に対 す る抗 体 の 場 合 、 こ の 蛋 白質 を特 徵 づ け られ る長 さ
が あれ ば 良 く、 好 ま し くは 5 ァ ミノ酸 以上 、特 に好 ま し くは 8 ァ ミノ酸 以上
の べ プチ ドを用 いれ ば 良 い 。 この べ プチ ドあ る い は全 長 蛋 白質 を そ の ま ま 、
又は K L H
(keyho l e- l i mpet hemocyan i n ) や B S A
( bo i ne serum a l bumi n
) と い った キ ャ リア 蛋 白質 と架橋 した 後 、 必 要 に応 じて ア ジ ュバ ン トと と も
に動 物 へ 接 種 せ しめ 、 そ の 血 清 を 回収 す る こ とで 該 D n a K 蛋 白質 を認 識 す
る抗 体 （
ポ リク ロー ナ ル 抗 体 ） を含 む 抗 血 清 を得 る こ とが で き る 。 ま た 抗 血
清 よ り抗 体 を精 製 して使 用 す る こ と もで き る 。 接 種 す る動 物 と して は ヒッ ジ
、 ゥ マ 、 ャ ギ 、 ゥサ ギ 、 マ ウス 、 ラ ッ ト等 で あ り、 特 に ポ リク ロ一 ナ ル 抗 体
作 製 に は ゥサ ギ 、 ャ ギ な どが 好 ま しい 。 ま た 、 ハ イ プ リ ドー マ細 胞 を作 製 す
る公 知 の 方 法 に よ りモ ノ ク 口一 ナ ル 抗 体 を得 る こ と も可 能 で あ るが 、 この 場
合 は マ ウス が 好 ま しい 。
ま た 該 蛋 白質 の 全 長 又 は 5 残 基 以 上 、 望 ま し くは 8 残 基 以 上 の ア ミノ酸 配
[0023]
列 を グル タ チ オ ン S — トラ ンス フ ェ ラ一 ゼ な ど と フ ユ一 ジ ョン蛋 白質 と した
もの を精 製 して 、 又 は未 精 製 の ま ま 、 抗 原 と して 用 い る こ と もで き る 。 成 書
(Ant i bod i es ; A l aboratory
r Laboratory
Press)
manua l , E . Har l ow et a l . , Go l d Spr i ng Harbo
に 示 され た 各 種 の 方 法 な らび に遺 伝 子 ク ロー ニ ン グ法
な どに よ り分 離 され た ィ ム ノ グ ロ プ リン遺 伝 子 を用 い て 培 養 した 細 胞 に発 現
させ た 遺 伝 子 組 み 換 え抗 体 に よ って も作 製 す る こ とが で き る 。
更 に上 記 の よ うに作 製 した 抗 体 か ら、 公 知 の 手 法 に従 って 、 マ イ コ プ ラズ
[0024]
マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
マ イ コ プ ラズ マ
又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リウム （
す なわ ち、
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
れ か 一 方 、 あ る い は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リゥム の いず
ニ ュー モ ニ エ及 び マ イ コ プ ラズ マ -
ジ ェニ タ リウム の 両 方 、 特 に 好 ま し くは マ イ コ プ ラズ マ
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
ジ ェニ タ リウム の 両 方 ） に特 異 的 に反 応 し、 それ 以 外 の 病
原 菌 に反 応 しな い抗 体 を選 択 す る こ とに よ って 、 特 異 性 の 高 い該 抗 体 を作 製
す る こ とが で き る 。
[0025]
本 発 明 の マ ー カ一 抗 原 と して 用 い る こ とが で き る該 D n a K に 対 す る抗 体
は 、前 記 の 方 法 以 外 に も、 以 下 の 方 法 あ る い は そ の 他 の 類 似 の 方 法 に よ って
取 得 す る こ とが で き るが これ らの 方 法 に 限 定 され る もの で は な い 。
[0026]
a ) 該 D n a K 蛋 白質の遺伝子配列及 びア ミノ酸配列が既知の微 生物 につ い
ては、他 の微 生物 にお ける該蛋 白質のァ ミ ノ 酸配列 との類似性の少 な い領域
につ いてぺ プチ ド断片 を合成 し、それ を免疫原 と してポ リク ロ一ナル抗体 、
あるいは モ ノ ク ロ ー ナル抗体 を作製す る ことによ り目的の抗体 を取得す る こ
とがで きる。
また、既知の該遺伝子の両端部位 にお ける D N A 配列 をプライマー と した
P C R 法 による遺伝子増幅 、相 同部分配列 を錶型 プ ロー ブと したハ イ プ リダ
ィゼー シ ヨン法 な ど通常の遺伝子操作手法 を用 いる ことによ り該遺伝子の全
長配列 を取得す る ことがで きる。
その後 、他 の蛋 白質遺伝子 との フュー ジ ョン遺伝子 な どを構築 し、大腸 菌
等 を宿 主 と して公知の遺伝子導入手法 によ り宿 主 内に該 当フュー ジ ョン遺伝
子 を挿入 し、大量 に発現 させた後 に フユ一 ジ ョン蛋 白質 と して用 いた蛋 白質
に対す る抗体 ァ フィ二テ ィー 力ラム法 な どによ り発現 蛋 白質 を精製す る こと
によ り目的 とす る蛋 白質抗原 を取得す る ことがで きる。 この場合 、該 D n a
K 蛋 白質の全長蛋 白質が抗原 とな るため対象外の微 生物間で保存 され て いる
ア ミノ酸部分 に対す る抗体 を取得 して も本発 明の 目的に合致 しな い。従 って
、本法 によ って取得 した抗原 に対 しては公知の手法 によ りモ ノク ローナル抗
体 を産生す るハ イ プ リ ドー マ を取得 し、該 当す る微 生物 とのみ反応す る抗体
を産生す るク ロー ンを選択す る ことによ り目的の抗体 を取得す る ことがで き
る。
[0027]
b ) 該 D n a K 蛋 白質のア ミノ酸配列が未知の微 生物 につ いては 1 つには該
D n a K 蛋 白質のァ ミノ 酸配列が菌種 間で 8 0 〜 1 0 0 % 、好 ま しくは 9 0
〜 1 0 0 % 相 同で ある ことによ り、そのア ミノ酸配列の相 同部分の配列 を基
に して P C R 法 による特定配列部分の遺伝子増幅や相 同部分配列 を錶型 プ ロ
— ブと したハ イ ブ リダィゼ一 シ ヨン法 な ど通常の遺伝子操作手法 を用 いる こ
とによ り該蛋 白質遺伝子 を容易 に取得す る ことがで きる。
目的 とす る蛋 白質抗原の取得 は、該蛋 白質遺伝子 と他 の蛋 白質遺伝子 との
フュー ジ ョン遺伝子 な どを構築 し、大腸 菌等 を宿 主 と して公知の遺伝子導入
手法 によ り宿 主 内に該 当フュー ジ ョン遺伝子 を挿入 し大量 に発現 させ る。そ
の後 に、 フユ一 ジ ョン蛋 白質 と して用 いた蛋 白質 に対す る抗体 ァ フィ二テ ィ
一 力ラム法 な どによ り、発現 蛋 白質 を取得す る ことがで きる。 この場合 、該
D n a K 蛋 白質の全長蛋 白質が抗原 とな るため対象外の微 生物間で保存 され
て いるア ミノ酸部分 に対す る抗体 を取得 して も本発 明の 目的に合致 しな い。
従 って、本法 によ って取得 した抗原 に対 しては公知の手法 によ りモ ノク ロ一
ナル抗体 を産生す るハ イ プ リ ドー マ を取得 し、該 当す る微 生物 とのみ反応す
る抗体 を産生す るク ロー ンを選択す る ことによ り目的の抗体 を取得す る こと
がで きる。
[0028]
c ) あるいは該 D n a K 蛋 白質のア ミノ酸配列が未知 な場合の別 な方法 と し
て、既知の該 D n a K 蛋 白質のア ミノ酸配列の うち該微 生物間で保存 され て
いる共通配列部分 に相 当す る 5 〜 3 0 ア ミノ酸の合成べ プチ ドを作製 し、そ
のぺ プチ ド配列 に対 し公知の方法 でポ リク ロ一ナル抗体 あるいは モ ノ ク ロ一
ナル抗体 を作製す る。該抗体 を用 いたァ フィ二テ ィカラム ク ロマ 卜によ って
目的の微 生物細胞破砕液 を精製す る ことによ り、高度 に精製 され た該 D n a
K 蛋 白質 を取得す る ことがで きる。蛋 白質の精製度が不足 して いる場合 は、
公知の精製手法 で あるイオ ン交換 ク ロマ トグラフィ一 、疎水 ク ロマ トグラフ
ィ一 、ゲル濾過 な どの手法 を用 いて、精製度 を高め る ことがで きる。得 られ
た精製 D n a K 蛋 白質抗原 を基 に して公知の方法 によ りハ イ プ リ ドー マ を取
得 し、 目的の微 生物 に特異 的に反応す るハ イ プ リ ドー マ を選択す る ことによ
り目的の抗体 を取得す る ことがで きる。
[0029]
該抗体 の作製方法の第二の態様 と しては、実施例 1 に示す よ うに、マイ コ
プラズマ
ニ ュー モニエを免疫原 と し、該 D n a K 蛋 白質 に反応す るマイ コ
プラズマ
ニ ュー モニエ及 び
又 はマイ コプラズマ
ジ ェニ タ リウム に特異
的な抗体 を作製す る ことがで きる。
また、同様 に して、マイ コプラズマ
ジ ェニ タ リウム を免疫原 と して作製
す る こともで きる。上記微 生物 も免疫原 とす る場合 、免疫原の調製 は公知の
方法 によ って行 うことがで きる。公知の方法 と して、超音波処理 、熱処理 、
界 面活 性剤 処 理 、ホル マ リン処 理 、凍 結 融解 処 理 、塩 酸処 理 が あ げ られ る。
[0030]
上 記 の方 法 に よ って得 られ た該微 生物 に特異 的 な本発 明の抗体 は、種 々の
免疫 学 的分析 法 に用 い る ことに よ り、 目的 とす る該微 生物 に特異 的 な各種 の
検 出試 薬 及 びキ ッ トを提 供 す る ことが で き る。
[0031 ]
この抗体 は、公 知 の全 ての免疫 学 的分析 法 に利 用 す る ことが で き る。例 え
ば、ポ リス チ レンラテ ックス粒 子 上 に該 抗体 を吸着 させ た凝 集 反 応 法 、 マ イ
ク ロタイ タ一 プ レー ト中で行 う E L I S A 法 、 ィム ノク ロマ ト法 、着色 粒 子
あ る いは発 色 能 を有 す る粒 子 、磁 気粒 子 、酵 素 も しくは蛍光体 で標 識 され た
該 抗体 を、単独 あ る いは複 数 で組 み 合 わ せ たサ ン ドイ ッチ法 等 に利 用 す る こ
とが で き る。
[0032]
また 、本発 明の D n a K を指標 とす る検 出方 法 に お いて は、積 極 的 に細 胞
を破 壊 しな くて も特異 的 にマ イ コ プラズ マ
プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
又 はマ イ コ
ジ ェニ タ リウム を検 出す る ことが で き るが 、更 に高 感 度 に測 定す
るた め に公 知 の微 生物 の処 理 方 法 を使 用 す る ことが で き る。具体 的 に は、 Τ
r i t o n X — 1 0 0
、 T w e e n — 2 0 、 S D S をは じめ とす る種 々の界
面活 性剤 を用 いた抽 出試 薬 に よ る処 理 法 、適 当な プ ロテ アー ゼ な どの酵 素 を
用 い る酵 素処 理 法 、物 理 的方 法 に よ る微 生物細 胞 の破 砕 をは じめ既 知 の細 胞
構 造 の破 砕 手 法 が用 い られ る。界 面活 性剤 等 の組 み 合 わ せ に よ り微 生物 ごと
に試 薬 に よ る最 適 な抽 出条件 を設 定す る ことが 望 ま しい。
[0033]
また 、本発 明 に お ける、抗体 を用 い る該微 生物検 出用試 薬 キ ッ トとは、 当
該検 出方 法 を用 いた検 出用試 薬 キ ッ 卜に相 当す る。
本発 明の抗体 を少 な くとも 1 種 含 ん で いれ ば良 く、使 用 す る免疫 測 定法 に
合 わ せ て 、使 用 す る抗体 の数 や種 類 や組 み 合 わ せ は適 宜 変 更す る ことが で き
る。更 に、試 料 の前 処 理 と して 、上 記 の抽 出法 に よ る前 処 理 液 を含 ん で も良
い。
[0034]
2 . 遺 伝 子 を用 いた該微 生物 の検 出方 法 及 びキ ッ ト
D N A の抽 出方 法 と して は、公 知 の方 法 を適 用 す る ことが で き る。例 えば
、試 料 を界 面活 性剤 に よ る可 溶 化 や 、除 タ ンパ ク剤 に よ る除 タ ンパ ク等 の操
作 を行 って 、 D N A を取 得 す る方 法 等 が 挙 げ られ る 。 好 ま し くは 、 後 述 す る
該 D n a K 遺 伝 子 の 解 析 が 可 能 な もの で あれ ば 、例 え ば 、 引 き続 い て P C R
法 に よ る遺 伝 子 増 幅 を行 う場 合 に は 、 P C R 反 応 の 阻 害 物 質 を含 ま な い状 態
に 調 製 して お く こ とが 好 ま しい 。
試 料 の 前 処 理 方 法 と して は 、 上 述 した 抗 体 を用 い た 該 微 生 物 の 検 出 方 法 と
同様 な 方 法 を使 用 す る こ と も で き る 。
[0035]
D N A 抽 出 量 と して は 、 次 に 行 う該 D n a K 遺 伝 子 の 解 析 が 可 能 な 量 が 抽
出 され て いれ ば よ い 。 P C R 法 に 供 す る場 合 に は 、例 え ば 、 1 反 応 あ た り 5
〜 5 0 f g 以上 で あ る。
[0036]
抽 出 され た D N A を用 い て 、 該 D n a K 遺 伝 子 の 解 析 を行 う。 該 D n a K
遺 伝 子 の 解 析 は 、 公 知 の 方 法 に従 って 行 わ れ る 。例 え ば 、 P C R 法 に よ る該
D n a K 遺 伝 子 の 増 幅 を検 出 す る方 法 や 、 プ ロー ブ法 に よ り該 D n a K 遺 伝
子 を特 定 す る方 法 が あ る 。例 え ば 、 P C R 法 に よ る該 D n a K 遺 伝 子 の 増 幅
は 、 目的 の 塩 基 配 列 が 増 幅 され る もの で あれ ば い か な る もの で も よ い し、 プ
ロー ブ法 に よ る該 D n a K 遺 伝 子 の 特 定 は 、 目的 の 塩 基 配 列 が 特 定 され る も
の で あれ ば い か な る もの で も 良 い 。
[0037]
該 D n a K 遺 伝 子 の 目的 の 塩 基 配 列 の 増 幅 あ る い は 特 定 を行 うた め に は 、
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 及 び
又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リウ ム
に は 8 0 〜 1 0 0 % 相 同 性 を 示 し、 そ れ 以 外 の 病 原 微 生 物 に は 好 ま し くは 6
0 ½ 以 下 の 相 同 性 を 示 す 配 列 を適 宜 選 択 して 用 い る こ とが で き る 。 ま た 、 こ
れ らの プ ラ イ マ 一 や プ ロー ブ は 、 目的 の D N Α 断 片 が 増 幅 で きれ ば 、 上 記 の
塩 基 配 列 に 変 異 や 欠 失 や 付 加 が あ つて も 良 い 。
[0038]
例 え ば 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ の D n a K 遺 伝 子 を増 幅 す る際 に
は 、 後 述 の 実 施 例 に あ る よ うに 、 N C B I で 公 開 され て い る マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ の D n a Κ 遺 伝 子 配 列 （N C B I 番 号 ：NG_00091 2
2 1 837. . 523624)
REG I ON
: 5
を 元 に P C R 増 幅 プ ラ イ マ 一 を設 計 す る こ とが で き る 。 具 体
的 に は 、 前 記 D n a K 遺 伝 子 の 全 長 を増 幅 す る た め に 、 セ ンス プ ラ イ マ 一 M
p D n a K
S 及 び ア ン チ セ ンス プ ラ イ マ 一 M p D n a K
A を使 用 す る こ
とが で き る 。
— 方 、 マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム D n a K 遺 伝 子 を 増 幅 す る 際 に は
、 N C Β I で 公 開 され て い る マ イ コ プ ラ ズ マ
伝 子 配 列 ( N C B I 番 号 ：L43967
ジ ェ ニ タ リゥ ム の D n a Κ 遺
REG I ON : 37491 9 . . 376706)
を元 に P C R 増
幅 プ ラ イ マ ー を 設 計 す る こ とが で き る 。
[0039]
ま た 、 実 施 例 8 に 示 した よ う に マ イ コ プ ラ ズ マ
遺 伝 子 は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ の P
ニ ュー モ ニ エ の D n a K
遺 伝 子 の 型 が 異 な る株 間 に
お い て も 1 0 0 % _ 致 し、 ま た 、 異 な る 分 離 地 お よ び 、 過 去 5 0 年 間 に お い
て も 変 異 が 認 め られ な か った 。 この こ とか ら、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ
ェ の D n a K 遺 伝 子 を特 異 的 に検 出 す るた め に は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー
モ ニ エ の 株 間 の 相 違 を考 慮 す る 必 要 は な く、 他 菌 株 との 相 違 を考 慮 す る こ と
に よ っ て 、 設 計 す る こ とが 可 能 と な る 。
また 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ の D n a K 蛋 白 質 の 配 列 も 安 定 して
い る と考 え られ る こ とか ら、 これ を 用 い て 作 製 した 抗 体 は 、 遺 伝 子 型 、 地 域
、 年 代 に よ っ て 反 応 性 に 差 は な い と考 え られ 、 広 範 な 地 域 、 年 代 に お い て 使
用 す る こ とが で き る 。
[0040]
本 発 明 の 遺 伝 子 を 用 い る 該 微 生 物 検 出 用 試 薬 キ ッ 卜と は 、 当 該 検 出 方 法 を
用 い た 検 出 用 試 薬 キ ッ 卜に 相 当 す る 。 マ イ コ プ ラ ズ マ
又 は マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ及 び
ジ ェ ニ タ リウ ム の 特 異 的 な 検 出 方 法 に 用 い られ る た め
の キ ッ トで あ っ て 、 目的 の 該 D n a K 遺 伝 子 に 特 異 的 な 塩 基 配 列 を 増 幅 す る
た め の 2 種 類 の プ ラ イ マ ー を 少 な く と も含 む こ と を 特 徴 とす る 。
ま た 、 別 の 態 様 と して は 、 目的 の 該 D n a K 遺 伝 子 に 特 異 的 な 塩 基 配 列 を
特 定 す る た め の 1 種 類 の プ ロ 一 ブ を 少 な く と も含 む こ と を 特 徴 とす る 。
更 に 、 試 料 の 前 処 理 と して 、 上 記 の 抽 出 法 に よ る前 処 理 液 を 含 ん で も 良 い
実施例
[0041 ]
以 下 、 実 施 例 に よ っ て 本 発 明 を 具 体 的 に 説 明 す る が 、 これ らは 本 発 明 の 範
囲 を限 定 す る もの で は な い 。
[0042]
《実 施 例 1
：マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 及 び マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ
リウ ム 特 異 的 抗 原 の 同 定 、 及 び 、 該 特 異 的 抗 体 の 作 製 》
(
)
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 及 び マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ リウ ム
に特 異 的 な モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 作 製
( 1 -
1 )
免 疫 菌株 の 培 養 及 び免 疫 抗 原 の 調 製
マ イ コ プ ラズ マ
7株
ニ ュ ー モ ニ エ 6 株
Bru
（FH
Mac
M52
P 11 428
：ATGG よ り 購 入 ） を 、 株 毎 に そ れ ぞ れ 、 PPL0 グ ル コ ー ス ブ ロ ス
M 1 29-B
（ゥ マ 血 清
、 新 鮮 酵 母 エ キ ス 、 酢 酸 タ リ ウ ム 含 有 ） に 接 種 し 、 3 7 °C で 7 日 間 、 好 気 条 件 下
で 培 養 し た 。 遠 心 回 収 し た 各 菌 体 を 洗 浄 後 、 PBS に 懸 濁 し て 凍 結 融 解 処 理 し た
も の を 免 疫 抗 原 と した 。
[0043]
( 1 -
2 )
免 疫
免 疫 感 作 に は 、 雌 性 Ba l b/c
マ ウス
6週 齢
（日 本 ク レ ア 社 ） を 使 用 し た 。 各
菌 体 に 由 来 す る 抗 原 溶 液 を 、 そ れ ぞ れ 、 フ ロ イ ン 卜の コ ン プ リ ー トア ジ ュ バ
ン ト
（S
I GMA 社 ） で 乳 化 し 、 抗 原
を マ ウ ス に 皮 下 注 射 した 。 こ の 後 、 免
疫 原 に 対 す る 抗 体 価 の 上 昇 が 認 め ら れ る ま で 、 2 週 間 お き に フ ロ イ ン 卜の イ ン
コ ン プ リ ー トア ジ ュ バ ン ト
（S
I GMA 社 ） で 乳 化 し た 抗 原 5 0
。 更 に 、 細 胞 融 合 3 日 前 に PBS で 希 釈 し た 抗 原
[0044]
( 1 -
3 )
g を 皮 下 注 射 した
を 腹 腔 内 に 注 射 した 。
ハ イ プ リ ドー マ 作 製
定 法 に 従 っ て 、 以 下 の 操 作 を 行 っ た 。 免 疫 感 作 マ ウ ス よ り無 菌 的 に 取 り出
した 脾 臓 細 胞 と 骨 髄 腫 細 胞
)
（P3U1 )
を ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 1 500
(Roche
社
を 用 い て 融 合 し 、 9 6 穴 プ レ ー トに 播 種 し た 。 HAT 培 地 を 用 い て ハ イ プ リ ドー
マ 細 胞 を 選 択 培 養 し 、 こ れ ら の 培 養 上 清 に 対 し て 以 下 の E L I SA 条 件 で ス ク リ ー
ニ ン グ を 実 施 し た 。 E L I SA の 固 相 化 に は 、 免 疫 原 と し た 6 種 類 の 各 株 に 由 来 す
る、各 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 抗 原 1 〃 g/mL
を 使 用 した 。 ブ ロ ッ キ ン グ
処 理 後 、 培 養 上 清 を 添 加 し 、 4 °C で 一 晩 反 応 さ せ た 。 洗 浄 液 で 3 回 洗 浄 後 、 200
0 倍 希 釈 HRP 標 識 ゥ サ ギ 抗 マ ウ ス l g 抗 体
させ た 。 洗 浄 液 で 3回 洗 浄 後 、 基 質
（Dako 社 ） を 添 加 し 、 室 温 で 1 時 間 反 応
（TMBZ)
溶 液 を 添 加 し 、 室 温 で 10 分 間 反 応
さ せ た 。 反 応 停 止 後 、 450nm の 吸 光 度 を 測 定 し た 。 こ れ に よ り 選 出 さ れ た ハ イ
プ リ ドー マ に つ い て 限 界 希 釈 法 に よ る ク ロ一 ニ ン グ を 実 施 し、 ク ロー ン株 を
樹 立 した 。 そ の 内 1 6 株 よ り産 生 され る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に つ い て 、 以 下
の 検 討 を 行 っ た 。 得 られ た ク ロー ン株 は 、 6 種 の 各 株 に 由 来 す る 免 疫 抗 原 の
いず れ と も反 応 す る もの で あ る 。
[0045]
(
-
4 ) モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 認 識 蛋 白質 の 分 子 量 の 確 認
ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ トに よ り、 上 記 1 6 種 の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 認 識 蛋 白
質 の 分 子 量 を 確 認 した 。 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ抗原
（FH 株
）
を
、 SDS-PAGE し、 続 け て ニ トロ セ ル ロー ス メ ン ブ レ ン に プ ロ ッ ト した 。 各 ク ロ
— ン の 培 養 上 清 を メ ン ブ レ ン に 添 加 し、 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 洗 浄 液 で 3
回 洗 浄 後 、 1000 倍 希 釈 HRP 標 識 ゥ サ ギ 抗 マ ウ ス l g 抗 体 を 添 加 し、 室 温 で 1 時 間
反 応 させ た 。 洗 浄 液 で 3 回 洗 浄 後 、 基 質
（4- ク ロ 口- 1- ナ フ トー ル ） 溶 液 を 添
加 し、 室 温 で 10 分 間 反 応 さ せ た 。 発 色 後 、 蒸 留 水 で 洗 浄 し、 反 応 を 停 止 した
そ の 結 果 、 1 0 種 が 6 2 〜 69KDa 、 6 種 が 4 0 〜 45KDa の 分 子 を 認 識 して い る こ
と が 判 明 した 。 そ の こ と か ら 、 取 得 数 が 多 く抗 原 性 が 高 い と考 え られ る 6 2 〜 6
9KDa の 分 子 に つ い て 、 続 い て 抗 原 の 同 定 を 試 み た 。
[0046]
( 1 -
取 得 抗体 のサ ブク ラス の 同定
5 )
I s o Str
i
(Roche 社 ） を 用 い て 6 2 〜 69KDa の 分 子 を 認 識 す る モ ノ ク ロー ナ ル
抗 体 1 0 種 の サ ブ ク ラ ス を 確 認 した と こ ろ 、 6 種 が H 鎖 G 1
が H鎖 G 1
L 鎖 え、 1 種 が H 鎖 2 b
種が H鎖 2 a
[0047]
( 2 )
L 鎖
L 鎖
L 鎖
：、 1 種 が H 鎖 2 b
：、 1 種
L 鎖 え、
で あ る こ とが 判 った 。
マ イ コ プ ラ ズ マ . ニ ュ ー モ ニ エ 及 び マ イ コ プ ラ ズ マ . ジ ェ ニ タ リウ ム
特異 的抗原 の 同定
( 2 -
) モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 認 識 抗 原 の 精 製
( 2 -
-
) 菌体 培養
抗 原 精 製 に は 、 これ ま で に 全 遺 伝 子 配 列 が 決 定 され て い る マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ Μ129- Β7 株 菌 体 を 用 い た 。 マ イ コ プ ラ ズ マ
29- Β7 株 ） を 、 PPL0 グ ル コ ー ス ブ ロ ス
ニ ュー モ ニ エ
（
Μ1
（ゥ マ 血 清 、 新 鮮 酵 母 エ キ ス 、 酢 酸 タ リ
ゥ ム 含 有 ） に 接 種 し 、 3 7 °C で 7 日 間 、 好 気 条 件 下 で 培 養 し た 。 遠 心 回 収 し た 菌
体 を 洗 浄 後 、 PBS に 懸 濁 し て 凍 結 処 理 し た 。
[0048]
( 2 -
1 -
CNBr-act
ァ フ ィ 二 テ ィ 一 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ る 認 識 抗 原 の 精 製
2 )
i vated
Sepharose
4B
(GE ヘ ル ス ケ ア 社 ） に 、
（1 )
で 得 られ た モ
ノ ク ロ 一 ナ ル 抗 体 MGM1 2 を カ ラ ム 担 体 に 結 合 さ せ 、 抗 原 精 製 用 ァ フ ィ 二 テ ィ 一
カ ラ ム を 作 製 し た 。 カ ラ ム 担 体 へ の 結 合 は 、 0 . 1 mo l / L NaHG0 3 -NaOH 、 0 . 5 mo I
/ L NaCI
(pH8.
下 で I g G 5mg/mL
3)
g e l を 4 °C 、 一 晚 反 応 さ せ た 。 未 反 応 基 の ブ
ロ ッ ク に は 、 0 . 2 mo l / L グ リ シ ン 緩 衝 液
マ イ コ プラズ マ
（pH8)
を用 いた 。
ニ ュ ー モ ニ エ 菌 体 よ り抽 出 し た 蛋 白 質 を カ ラ ム に ァ プ ラ
ィ し 、 非 吸 着 画 分 を 溶 出 し た 後 、 3 mo l / L チ ォ シ ア ン 酸 ナ ト リ ウ ム に よ り カ ラ
ム 吸着 画 分 を溶 出
回 収 し た 。 こ れ を 5 0 國 o l / L PBS
で 透 析 した も の を
(pH7)
精 製 品 と した 。
[0049]
( 2 -
2 )
( 2 -
2 -
取 得 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 認 識 蛋 白 質 の 同 定
)
認 識 蛋 白 質 の SDS-PAGE 上 で の 分 子 量 確 認
精 製 抗 原 を 、 SDS-PAGE 及 び ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ トに よ り解 析 し た 。 精 製 抗 原 0
. 1 〃 g を SDS-PAGE
し、 続 け て ニ トロ セ ル ロ ー ス メ ン ブ レ ン に プ ロ ッ ト した 。 モ
ノ ク ロ 一 ナ ル 抗 体 MGM1 2 又 は モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 MGM1 9 の
10
g/mL
I g G溶 液 を
、 そ れ ぞ れ 、 メ ン ブ レ ン に 添 加 し、 室 温 で 1時 間 反 応 さ せ た 。 洗 浄 液 で 3 回 洗
浄 後 、 1 000 倍 希 釈 HRP 標 識 ゥ サ ギ 抗 マ ウ ス l g 抗 体 を 添 加 し 、 室 温 で 1 時 間 反 応
させ た 。 洗 浄 液 で 3回 洗 浄 後 、 基 質
（4- ク ロ 口 - 1- ナ フ トー ル ） 溶 液 を 添 加 し
、 室 温 で 反 応 さ せ た 。 発 色 後 、 蒸 留 水 で 洗 浄 し、 反 応 を 停 止 した 。
いず れ の 抗 体 も精 製 抗 原 を認 識 す る こ とが 確 認 で き た 。
[0050]
( 2 -
2 -
2 )
精 製 抗 原 の N末 端 ァ ミ ノ 酸 配 列 解 析
定 法 に 従 っ て 、 精 製 抗 原 蛋 白 の N末 端 1 0 ア ミ ノ 酸 残 基 を 解 析 し た 。 精 製 抗 原
を SDS-PAGE
し 、 PVDF メ ン ブ レ ン に プ ロ ッ ト し た 試 料 を 50% メ タ ノ 一 ル
% ト
リ フ ル ォ ロ 酢 酸 、 メ タ ノ ー ル で 洗 浄 後 、 乾 燥 し 、 N末 端 よ り 1 0 サ イ ク ル の ア ミ
ノ 酸 配 列 分 析 を 実 施 し た 。 解 析 装 置 に は 、 プ ロ テ イ ン シ ー ケ ン サ 一 PPSQ-23A
( 島 津 製 作 所 ） と PTH ア ナ ラ イ ザ ー SPD-1 0 A
( 島 津 製 作 所 ） を 使 用 した 。
そ の 結 果 、 以 下 の 配 列 が 得 られ た 。
S T D N G L
I
I G I
(配 列 番 号 1 )
定 法 に 従 っ て 、 デ ー タ 一 ベ ー ス Swi ss-Prot
配列 はマイ コプラズ マ
を 用 い た 検 索 に よ り、 得 られ た
ニ ュ 一 モ ニ エ の Ghaperone
prote
i n DnaK の 2 〜 1 1 残 基
目 の 配 列 と 完 全 に 一 致 し た 。 ま た 、 こ の ア ミ ノ 酸 配 列 よ り推 定 さ れ る 該 DnaK
の 分 子 量 は 65KDa で あ り 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト上 で の 抗 体 認 識 抗 原 の 分 子 量 と
ほ ぼ 一 致 した 。
以 上 よ り、 上 記 で 取 得 され た 抗 体 は 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
マイ コプラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 及 び
ジ ェニ タ リゥ ム 特 異 的 な 抗 D n a K 抗 体 で あ る こ と を確 認
す る こ とが で きた 。
[0051 ]
《実 施 例 2
：E L I S
Α法
に よ る取 得 抗 体 の 感 度 及 び 交 差 性 の検 討 》
実 施 例 1 で 得 ら れ た モ ノ ク 口 一 ナ ル 抗 体 の 内 、 モ ノ ク 口 一 ナ ル 抗 体 MGM1 2 及
び モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 MGM1 9 を 使 用 し て 該 抗 体 の 感 度 及 び 交 差 性 の 検 討 を 行 つ
た。
(
) 試験 菌株 の培養 及 び調製
( 1 -
1 )
感度試験 用 菌株
表 1 に示す マイ コプラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ 8 株 を PPL0 グ ル コ ー ス ブ ロ ス
（
ゥ マ 血 清 、 新 鮮 酵 母 エ キ ス 、 酢 酸 タ リ ウ ム 含 有 ） に 接 種 し 、 3 7 °C 、 4 日 間 好
気 培 養 し 、 ブ ロ ス の p Hが 6 . 8 と な っ た も の を 試 験 菌 と し て 用 い た 。 ブ ロ ス 中 の
菌 数 は 滅 菌 PBS に て 1 0 段 階 希 釈 液 を 作 製 、 そ の 各 希 釈 液 を PPL0
(ゥマ血清 、新
鮮 酵 母 エ キ ス 、 酢 酸 タ リ ウ ム 含 有 ） 寒 天 培 地 上 に 1 0 パ 1_ 接 種 後 、 3 7 °C 、 1 0 日 間
培 養 した 。 寒 天 培 地 上 の 発 育 集 落 を 4 0 倍 の 光 学 顕 微 鏡 に て 集 落 数 を 測 定 し、
菌 数 を 算 出 した 。
[0052]
ほ 1]
[0053]
( 1 (
reapl
2 )
交 差 性 試 験 用 菌株 ー
-
) で 示 した マ イ コ プ ラ ズ マ
as a
,
≤
a属の
ニ ュ ー モ ニ エ 以 外 の MvcoD l asma 屋
U
そ れ ぞ れ の 菌 株 を表 2 に 示 した ブ ロス 及 び 培
養 条 件 に て 培 養 した 。 な お 、 培 養 は 3 7 °C で 実 施 した 。 ま た 、 表 2 に お け る 「
好 気 」 及 び 「嫌 気 」 は 、 そ れ ぞ れ 、 好 気 培 養 及 び 嫌 気 培 養 で あ る こ と を 示 す
。 ブ ロス 中 の 菌 数 は 滅 菌 PBS に て 10 段 階 希 釈 液 を 作 製 、 そ の 各 希 釈 液 を PPL0 (
ゥ マ 血 清 、 新 鮮 酵 母 エ キ ス 、 酢 酸 タ リウ ム 含 有 ） 寒 天 培 地 上 に 10
L接 種 後 、
3 7 °C 、 10 日間 培 養 した 。 寒 天 培 地 上 の 発 育 集 落 を 4 0 倍 の 光 学 顕 微 鏡 に て 集 落
数 を 測 定 し、 菌 数 を 算 出 した 。 試 験 菌 数 は 10 6 〜 10 7Gfu /mL で 実 施 した 。
[0054]
ほ 2]
3 ) 交 差 性 試 験 用 菌株 — 2
( 1 -
-
) 及 び （1 _ 2 ) で 使 用 した Mvcoo l asma 属 、 Ureap l asma 属 、 Acho l
e D l asma
属 以 外 の 細 菌 、 真 菌 の 交 差 反 応 性 試 験 に 供 した 微 生 物 及 び そ の 培 養 条
(
件 を 、 表 3 〜 6 に そ れ ぞ れ 示 した 。 な お 、 使 用 培 地 と して は 、 ハ ー トイ ン フ
ュ 一 ジ ョン ァ ガ 一 （デ ィ フ コ社 ） 、 トリプ チ ケ ー ス ソ ィ I I ヒッ ジ 寒 天 培 地 （
べ ク トン
M 寒天培地
サ ブ 口_
デ ッキ ン ソ ン 社 ） 、 チ ョ コ レ ー ト寒 天 培 地 （日水 社 ） 、 変 法 G A
（日水 社 ） 、 ス キ ロー 寒 天 培 地 （
べ ク トン
デ ッキ ン ソ ン 社 ） 、
デ キ ス トロ一 ス ァ ガ 一 （デ ィ フ コ社 ） を使 用 した 。
これ らの 菌 は 寒 天 培 地 で 培 養 後 、 滅 菌 P B S に 10 7 〜 10 8cfu/mL に な る よ う に
浮 遊 させ 、 試 験 菌 と した 。 菌 数 測 定 は 滅 菌 P B S に 浮 遊 させ た 試 験 菌 液 を 同
緩 衝 液 に て 10 段 階 希 釈 し、 そ の そ れ ぞ れ を 寒 天 培 地 に 5 0 パ L 接 種 し、 培 地 上
に 発 育 した 集 落 を 肉 眼 に て 測 定 した 。
な お 、 表 中 の 菌 株 No. 欄 の 空 白部 分 は 、 臨 床 材 料 か ら分 離 同 定 され た も の で あ
〔
〕0058
〕
[0060]
( 2 )
E L I S A 法 に お け る感 度 及 び 交 差 性 の検 討
( 2 -
)
( 2 -
-
E L I S A 法の構築
)
固相化抗体調製方法及 び固相化方法
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 MGM1 9 を 含 む 腹 水 を 硫 安 分 画 後 、 rProte
FF
。
[0061
]
i n A Sepharose
(GE ヘ ル ス ケ ア 社 ） を 用 い て I g G精 製 し 、 BGA 法 に て 蛋 白 質 定 量 を 実 施 し た
9 6 ゥ ヱ ル の マ イ ク ロ プ レ ー トに 精 製 I g G抗 体
( 2 -
1 -
2 )
（l
O
を 固 相 化 した 。
g/mL)
ア ル 力 リ性 ホ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 用 抗 体 調 製 方 法 及 び 標 識 体 作
製方法
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 MGM1 2 を 含 む 腹 水 を 硫 安 分 画 後 、 MEP Hyperce
l
— ル 社 ） を 用 い て I g G精 製 を 実 施 し た 。 更 に 、 I g G を ペ プ シ ン に て F (ab'
、
( 日本 ポ
) 2化 後
) 2 を ア ル カ リ性 ホ ス フ ァ タ 一 ゼ と 架 橋 反 応 を 行 い 、 ア ル カ リ性 ホ ス フ
F (ab'
ァ タ ー ゼ 標 識 抗 体 を 作 製 した 。
[0062]
( 2 -
1 -
3 )
EL I SA 法 の 実 施 方 法
固 相 化 9 6 ウ ェ ル マ イ ク 口 プ レ ー トを 洗 浄 後 、 1 %BSA を 含 む 0 . 1mmo l / L TBS
pH7. 5 )
で 室 温 、 1 時 間 ブ ロ ッ キ ン グ し た 。 試 験 菌 液 10 0 リ 1_ を 添 加 し 、 室 温 で
時 間 反 応 さ せ た 。 洗 浄 後 、 ア ル カ リ性 ホ ス フ ァ タ 一 ゼ 標 識 抗 体
)
(
を 添 加 し、 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 洗 浄 後 、 基 質
（pNPP)
（10 パ / mL
溶 液 で 30分 間
発 色 さ せ 、 反 応 停 止 後 に 405nm で の 吸 光 度 を 測 定 し た 。
[0063]
( 3 )
感度試験
試験 菌
（1 — 1 )
を 前 述 の EL I SA に て 測 定 し 、 吸 光 度 が 0 . 0 5 以 上 認 め ら れ た
最 高 希 釈 倍 率 の 試 験 液 か ら 菌 数 を 算 定 して 表 7 に 示 した 。
表 7 の 結 果 か ら 、 本 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 使 用 し た EL I SA に よ っ て 、 マ イ コ
プラズ マ
[0064]
ニ ュ ー
モ ニ エ に 対 す る 感 度 は 、 10 3 〜 10 4 cfu/mL
で あ る こ とが 判 った
ほ 7]
[0065]
( 4 )
交差性試験
試験菌
o l asmaJ
（1 _ 2 )
(表 2 に記 載 の マ イ コ プ ラズ マ
Ureao l asma 厲
、
Acho l e l asma 鹿 ) 及 び
ニ ュー モ ニ エ 以 外 の!
t 馬央 鹵
に1
—3 )
(表 3 〜
6 に 記 載 の 他 細 菌 、 真 菌 ） を 前 述 の EL I SA に て 測 定 した 。
マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 以 外 の 微 生 物 で は 、 全 て 、 吸 光 度 が 0 .
0 未 満 で あ った 。 一 方 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
0
ジ ェ ニ タ リウ ム で は 、 吸 光 度
が 0 . 0 5 以 上 認 め られ た 最 高 希 釈 倍 率 の 試 験 液 か ら菌 数 を 算 定 した と こ ろ 、 6 . 9
x 10 4cfu/mL
で あ った 。
これ らの 結 果 に 示 した と お り、 本 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を 使 用 した EL I SA で は
[0066]
マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リ ウ ム と は 交 差 性 が 認 め られ る が 、 そ れ 以 外 の 微
生 物 に は 交 差 性 が 無 い こ とが わ か った 。
以 上 よ り、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ
リ ウ ム 感 染 症 を 診 断 す る 際 に 障 害 に な る 可 能 性 の あ る 、 多 くの 細 菌 及 び 真 菌
と は 交 差 しな い こ と が 確 認 され た 。
[0067]
《実 施 例 3
(
：ィ ム ノ ク ロ マ ト法 に よ る 取 得 抗 体 の 感 度 及 び 交 差 性 の 検 討 》
) ィ ム ノ ク ロ マ ト法 の 構 築
( 1 -
1 ) 検 出 用 標 識 物 で あ る 金 コ ロ イ ド標 識 抗 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ェ抗体 の作 製
ニ ュー モ
直 径 40nm の 金 コ ロイ ド溶 液 （田 中 貴 金 属 社 ） 18mL に 5 0 國 o l / L リン酸 緩 衝 液
(pH
)
2mL
を 加 え る こ と で p H を 調 製 した 金 コ ロイ ド溶 液 に 、 l
OO
g/mL
のモ
ノ ク ロ一 ナ ル 抗 体 MGM1 2 溶 液 2 . 5mL を 加 え て 攪 拌 した 。 1 時 間 攪 拌 した 後 、 1 質
量 ％ポ リエ チ レ ン グ リコー ル （
Mw. 20000 、 和 光 純 薬 社 ） 水 溶 液 を 1mL 加 え攪 拌
し、 続 い て 10 質 量 ％BSA 水 溶 液 （
S I GMA 社 ） を 2mL 加 え攪 拌 した 。 この 溶 液 を 4 °C
、 8000G 、 15 分 間 遠 心 した 後 、 1mL 程 度 を 残 して 上 清 を 取 り除 き 、 超 音 波 発 生
機 に よ り金 コ ロイ ドを 再 分 散 した 。 この 後 、 20mL の BSA を 含 む リン酸 緩 衝 液 に
分 散 し、 再 び 4 °C 、 8000G 、 15 分 間 遠 心 した 後 、 1mL 程 度 を 残 して 上 清 を 取 り除
き 、 超 音 波 発 生 機 に よ り金 コ ロイ ドを 再 分 散 し、 金 コ ロイ ド標 識 抗 体 溶 液 を
作 製 した 。
[0068]
( 1 -
2 )
( 1 -
金 コ ロイ ド保 持 パ ッ ドの 作 製
1 )
で 作 製 した 金 コ ロイ ド標 識 抗 体 溶 液 を 上 記 BSA を 含 む リン酸 緩 衝
液 で 希 釈 し、 2 0 國 X 300
國 に
切 った ガ ラ ス フ ァ イ バ 一 パ ッ ド （ミ リポ ア 社 ） に
染 み 込 ま せ 、 一 晩 室 温 で 乾 燥 し、 金 コ ロイ ド抗 体 保 持 パ ッ ドを 作 製 した 。
[0069]
( 1 -
3 )
抗 体 固 定 化 メ ン ブ レ ン （ク ロマ トグ ラ フ担 体 ） の 作 製
3 0 國 x 300 國 に
切 断 した ニ トロセ ル ロー ス メ ン ブ レ ン （ミ リポ ア 社 ） に 関 し
て 以 下 の よ うな 方 法 に よ り、 抗 体 を 固 定 化 し抗 体 固 定 化 メ ン ブ レ ン を 作 製 し
た 。 メ ン ブ レ ン の 長 辺 を 下 に し、 下 か ら 1 6 國 の 位 置 に 、 5mg/mL と な る よ う に
調 製 した 固 定 化 用 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 MGM1 9 溶 液 を 塗 布 機 （
B i oDot 社 ） を 用 い
て 幅 1 國 程 度 の ラ イ ン状 に 塗 布 し、 乾 燥 させ て 、 抗 体 固 定 化 メ ン ブ レ ン を 作 製
した 。
[0070]
( 1 -
4 )
ィ ム ノ ク ロマ トグ ラ フ キ ッ トの 組 み 立 て
バ ッ ク 粘 着 シ ー ト （日栄 化 工 社 ） に 抗 体 固 定 化 メ ン ブ レ ン 、 金 コ ロイ ド保
持 パ ッ ド、 吸 収 パ ッ ド （日本 ポ ー ル 社 ） を 重 ね て 貼 り付 け 、 これ ら重 ね 貼 り
部 材 を 、 部 材 の 長 辺 側 を 6 國 幅 に な る よ う に カ ッ タ ー で 切 断 して い く こ と で ィ
ム ノ ク ロマ トグ ラ フ用 テ ス トス トリ ッ プ を 作 製 した 。 これ ら を ハ ウ ジ ン グ ケ
— ス に 入 れ 、 試 験 用 ィ ム ノ ク ロマ トグ ラ フ キ ッ トと した 。
[007 1 ]
( 1 -
5 )
試験方法
Tr i tonX-1 00 を含む リン酸緩衝液 で培養 菌、PBS 洗浄菌、培養上清 、培養 菌
の沈殿 を溶解 し、各濃度の試験用 マイ コプラズマ
ニ ュー モニエ抗原 （
又は
菌株 ）溶液 を作製 した。各試験用 ィ ム ノ ク ロマ トキ ッ トに、各濃度の試験用
マイ コプラズマ
ニ ュー モニエ抗原 （
又 は菌株 ）溶液 を100 パ1_ 滴 下 し、 15 分
後 に抗体 固定 メンブ レンの抗 マイ コプラズマ
ニ ュー
モニエモ ノク ローナル
抗体 を塗布 した部位 に 目視 で染色 が見 られ た場合 は 「
陽性」、染色 が見 られ
なか った場合 は 「
陰性」 と判別 した。
[0072]
( 2 ) 感度試験
実施例 2 の試験 菌 （1 — 1 ) を前述の ィ ム ノ ク ロマ ト法 にて測定 し、テス
トライ ンに出現 した染色 が認め られ た最高希釈倍率の試験液か ら菌数 を算定
して、表 8 に示 した。
[0073]
[0074]
[ 表 8]
表 8 の結 果か ら、本 モ ノク ローナル抗体 を使用 したィム ノク ロマ ト法 にお
いてマイ コプラズマ
ニ ュー
モニエに対す る感度 は、 103〜 104cfu/mL で ある こ
とが判 った。
[0075]
( 3 ) 交差試験
実施例 2 の試験 菌 （1 — 2 )
ェ以外のMycop l asma J
3 )
(表 3
〜
、
(表 2 に記載のマイ コプラズマ
Ureap l a s aJfc
Acho l e l as a
ニ ュー モニ
及 ひ試験 菌 (
―
6 に記載の他細 菌、真菌） を前述のィム ノク ロマ ト法 にて測定
した 。
マ イ コ プラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム 以 外 の 微 生 物 は 、 全 て 、 陰 性 、 す な わ ち
、 染 色 が 認 め られ な か っ た 。 一 方 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム で は 染
色 が 認 め られ 、 最 高 希 釈 倍 率 の 試 験 液 か ら菌 数 を 算 定 した と こ ろ 、 6 . 9 x 10 4c f
u/mL で あ っ た 。
[0076]
これ らの 結 果 に 示 した と お り、 本 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を 使 用 した ィ ム ノ ク
ロ マ ト法 で は マ イ コ プ ラ ズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム と は 交 差 性 が 認 め られ る が 、
そ れ 以 外 の 微 生 物 に は 交 差 性 は 認 め られ な か っ た 。
以 上 よ り、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェニ タ
リウ ム 感 染 症 を 診 断 す る 際 に 障 害 に な る 可 能 性 の あ る 、 多 くの 細 菌 及 び 真 菌
と は 交 差 しな い こ と が 確 認 され た 。
[0077]
《実 施 例 4
：臨 床 検 体 の 評 価 》
マ イ コ プ ラ ズ マ 感 染 症 の 疑 い が あ る 患 者 3 名 及 び 健 常 人 3 3 名 か ら、 咽 頭
拭 い 液 を 採 取 し、 実 施 例 3 の ィ ム ノ ク ロ マ ト法 に 従 っ て 、 マ イ コ プ ラ ズ マ ニ ュ ー モ ニ エ の 検 出 を 実 施 した 。 そ の 結 果 、 表 9 に 示 す 通 り、 マ イ コ プ ラ ズ
マ 感 染 症 の 疑 い が あ る 患 者 3 名 で は 陽 性 反 応 が 認 め られ 、 健 常 人 3 3 名 で は
陰 性 で あ った 。
ま た 、 同 検 体 よ り定 法 に 従 っ て D N A を 抽 出 し、 マ イ コ プ ラ ズ マ
モ ニ エ P 1遺 伝 子 の 一 部
番 号 ：NG—00091 2 )
(M. pneumon i a e M 1 29-B7
幅 す る 、 Jensen ら (APM I S .
用 いて 、 マ イ コ プラズ マ
989
97 (
) : 1046-8.
)
を増
の定性 P C R 法の改法 を
ニ ュ ー モ ニ エ の 遺 伝 子 検 出 を 実 施 し、 両 者 を 比 較
した 。 そ の 結 果 、 表 9 に 示 す 通 り、 陽 性 、 陰 性 共 に 両 者 は 一 致 した 。
[0078]
ニ ュー
ほ 9]
[0079]
陽 性 一 致 率 ：1 0 0 %
(3 /
陰 性 一 致 率 ：1 0 0 %
全 体 一 致 率 ：1 0 0 %
(3 3 /
(3 6 /
3 )
3 3 )
3 6 )
次 に 、 ィ ム ノ ク ロマ ト法 及 び 定 性 P C R 法 に て いず れ も陽 性 で あ った 検 体
の D N A を用 い 、 マ イ コ プ ラ ズ マ . ジ ェニ タ リウ ム 16s rRNA 領 域 の 一 部
en i t a l i u m G7
番 号 ：L43967)
2002 ；
40 (4) : 1451-5.
ジ ェニ タ リウ ム 定 量 P C R 法 の 改
ジ ェニ タ リウ ム の 遺 伝 子 検 出 を実 施 した 。 そ
の 結 果 、 表 1 0 に 示 す 通 り、 全 例 か らマ イ コ プ ラ ズ マ
ジ ェニ タ リウ ム の 遺
伝 子 は検 出 され な か った 。
な お 、 この 手 法 で 、 マ イ コ プ ラ ズ マ . ジ ェニ タ リウ ム の 遺 伝 子 の 増 幅 が 可
能 な こ と は確 認 され て い る 。
[0080]
[0081 ]
[ 表 10 ]
以 上 の 結 果 、 本 発 明 の 抗 体 を使 用 して 、 特 異 的 に マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュ ー
モ ニ エ を検 出 し、 マ イ コ プ ラ ズ マ 感 染 症 を診 断 す る こ とが 可 能 な こ とが 示 さ
れた。
[0082]
《実 施 例 5 ：マ イ コ プ ラ ズ マ
g
を増 幅 す る Yosh i da ら ( J C I i n Mi crob i o l .
) の マ イ コ プ ラズ マ
法 を用 い て 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
（M.
ニ ュー モ ニ エ 培 養 菌 株 の D n a K 遺 伝 子 の 増
測 定 対 象 は 、 ATGG よ り購 入 した マ イ コ プ ラ ズ マ
umon i a e F H ：ATCC No. 15531 、 M . pneumon
i a e Mac ：ATCC No. 15492 、 M . pneumon
i a e Mutant
mon i a e M52 ：ATCC No. 15293 、 M . pneumon
mon i a e M 1 29-B7
i a e Bru
（M.
pne
：ATCC No. 15377 、 M . pneumon
2 2 ：ATCC No. 39505 、 M .
i a e P 1 428
：ATCC No. 29342 お よ び 、 M . pneumon
を 用 い た 。 これ らの マ イ コ プ ラ ズ マ
9894)
ニ ュー モ ニ エ 8 株
neu
：ATCC No. 29085 、 M . pneu
i a e UTMB-1 0 P ：ATCC No. 4
ニ ュ ー モ ニ エ 8 株 を PPLO 培 地 に
て 培 養 し 、 D N A を 抽 出 した 。
D N A 抽 出 は 、 ス マ イ テ ス トEX-R&D キ ッ ト （医 学 生 物 学 研 究 所 ） を 用 い 、 1
Ommo l / L T r i s - HG し 1 國 o l / L EDTA
Buffer
pH8. 0
( 二 ツボ ン ジ ー ン ）
（以 下 、
に 懸 濁 し 、 _40 °C に 凍 結 保 存 した 。
T E Buffer)
抽 出 した D N A は 、 1 6 s rRNA 領 域 の マ イ コ プ ラ ズ マ 共 通 定 量 P C R に て 、
遺 伝 子 コ ピー 数 を 測 定 し 、 そ れ ぞ れ 2 x 10 6 か ら 2 x 10 ° cop i e s /
ffer
L ま で 、 T E Bu
を 用 い て 10 倍 階 段 希 釈 し 、 D n a K 遺 伝 子 の 検 出 に 使 用 した 。
6s
rRNA 領 域 の マ イ コ プ ラ ズ マ 共 通 定 量 P C R は 、 以 下 の 通 り実 施 した 。
16 s
rRNA 遺 伝 子 領 域 を 増 幅 す る マ イ コ プ ラ ズ マ 属 に 共 通 な プ ラ イ マ 一 を 設
計 し 、 リ ア ル タ イ ム P C R 法 を 用 い 、 標 準 品 を 元 に 、 抽 出 した M . pneumon
D N A の 遺 伝 子 コ ピー 数 を 算 出 した 。 リ ア ル タ イ ム P C R は 、 L i ghtGyc
astStart
DNA Master
SYBR Green
I
(Roche
App l i e d Sc i ence)
i ae
l er
F
を用 いた 。
プ ラ イ マ ー 配 列 は 以 下 を 使 用 した 。
M . pneumon
i a e M 1 29-B7
FmY4
：5 '
nt
MGSO-2
：5 '
nt
comp l ete
genome
-TGGGGAGCAAA (C/T)
1 9 , 081-1
19 ,
00
： GenBank
9 , 356
i o n No. NG—00091 2
(配 列 番 号 2 )
AGGATTAG-3'
20mer
-CACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3
9 , 332-1
Access
'
(配 列 番 号 3 )
25mer
P C R 条 件 は 、 9 5 °C で 10 分 反 応 さ せ 、 次 い で 、 9 4 °C 、 10 秒 で 変 性 、 6 0 °C 、 2
秒 で ァ ニ 一 リ ン グ 、 7 2 °C で 12 秒 を 5 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
標 準 品 に は 、 M . pneumon
i ae
(M1 2 9 株 )
の 1 6 s rRNA の 一 部
の 302 〜 1072 番 目 ） を 組 み 換 え した pT7B l u e T-Vector
(771 b p ： 6 s
rRNA
(タ カ ラバ イオ ） の 希 釈
系列
（1
07
10 5
10 3
10 2
を用 いた 。
O'cop i es/test)
標 準 品 の コ ピー 数 は 、 以 下 の 計 算 式 に 基 づ き 算 出 した 。
DNA 濃 度
（； g/mL)
=
ABS (260nm)
x 5 0 お よ び 、 1 Kbp DNA の 1 pmo l = 0 . 6 6
バg よ り
[ 数 1]
copyicopiesl
mL)
次 に、 マ イ コ プラズ マ
ニ ュー モ ニ エ D n a K 遺 伝 子 の P C R に よ る増 幅
は 、 以 下 の と お り実 施 した 。 P C R 反 応 液 は 、 大 塚 蒸 留 水
に 、 Premi x EX Taq Hot
0pmo
\/
Start
Vers i o n
(TaKaRa)
（
大 塚 製 薬 ） 18 リ 1_
2 5 リし セ ン ス プ ラ イ
MpDnaK_S 及 び ア ン チ セ ン ス プ ラ イ
L MpDnaK_A を 各
10pmo l /
1 〃 L 加 え 、 4 5 〃 L の マ ス タ 一 ミ ッ ク ス チ ヤ 一 と し、 抽 出 D N A を 5 〃 L 添 加 、 計
5 0 〃 L と した 。 P C R 陰 性 コ ン トロー ル に は 、 T E Buffer
を用 いた 。 D n a K
遺 伝 子 全 長 1 , 788bp を 増 幅 す る た め に 、 上 記 セ ン ス プ ラ イ
は、 D n a K 遺
伝 子 の 開 始 コ ドン の 5 ' 側 上 流 8 1 b p に 、 ア ン チ セ ン ス プ ラ イ
ン の 3 ' 側 下 流 53bp に 設 計 した 。 具 体 的 に は M . peumon i a e
No.
S
NG—00091 2 )
M1 29
MpDnaK.S
：5 ' -CTCAAACGCTAAAAGTGCTAACG-3 '
MpDnaK.A
：5 ' -AAACCATTATTACAGGTCAAATAAGAC-3
次 に P C R 反 応 は 、 Mastercyc
7 2 °C
(GenBank
の 521 , 756 番 目か ら521 , 782 番 目 を セ ン ス プ ラ イ
523, 655 番 目か ら523, 677 番 目 を ア ン チ セ ン ス プ ラ イ
秒 で 変 性 、 5 0 °C
は、終始 コ ド
l er
MpDnaK—
MpDnaK_A と した
23mer
'
(配 列 番 号 4 )
27mer
(配 列 番 号 5 )
( エ ツペ ン ドル フ ） を 使 用 し、 9 4 °C
3 0 秒 で ア ニ ー リ ン グ 、 7 2 °C
Acc
30
2分 を50サ イ ク ル 行 い 、 最 後 に
5 分 イ ン キ ュ ベ ー トの 条 件 で 実 施 した 。 反 応 後 、 卩 〇
産 物 5 パ 1_ を 用 ぃ
2 % ァ ガ ロー ス 電 気 泳 動 し、 ェ チ ジ ゥ ム ブ 口 マ イ ドで 染 色 後 、 紫 外 線 照 射 に
よ り、 約 1 , 900bp の 増 幅 バ ン ドを 確 認 した 。
上 記 で 調 製 した マ イ コ プ ラ ズ マ
8 株 す べ て に お い て 、 10 2cop i es/test
ニ ュ ー モ ニ エ 8 株 に 対 して 検 討 した 結 果
ま で 増 幅 が 確 認 され た 。
《実 施 例 6
[0085]
：ヒ 卜か ら分 離 され た マ イ コ プ ラ ズ マ 培 養 菌 株 と の 交 差 性 》
測 定 対 象 は 、 ATGG よ り購 入 した マ イ コ プ ラ ズ マ 1 7 株
C No. 33530
70 、 U.
e
urea
、 Μ· homi n i s ：ATCC No. 231 14 、 Ureap l asma parvum
l y t i cum ：ATCC No. 2761 8 、 M . fermentans
gen i t a l i u m ：ATG
：ATCC No. 7009
：ATCC No. 19989 、 Acho l
、 A . ocu l i ：ATCC No. 5 1 735 、 M . penetrans
l a i d l awi i ：ATCC No. 23206
l asma
（M.
：ATCC No. 55252 、 M . p i rum ：ATCC No. 25960 、 M . ora l e ：ATCC No. 2371 4 、 M . s a
I i var i u m ：ATCC No. 23064
C No. 23636
p
i matum
、 M . arthr
i t i d i s ：ATCC No. 1961 1 、 M . bucca
I e ：ATC
、 M . fauc i u m ：ATCC No. 25293 、 M . I i o p h i I u m ：ATCC No. 271 0 4 、 M .
：ATCC No. 25948 お よ び 、 M . spermatoph
i I u m ：ATCC No. 49695)
を用
い た 。 これ らの マ イ コ プ ラ ズ マ 1 7 株 を 各 PPL0 培 地 に て 培 養 し、 実 施 例 5 と
同 様 に D N A を 抽 出 し、 16 s rRNA 領 域 の 定 量 P C R に て 、 遺 伝 子 コ ピー 数 を
測 定 し、 そ れ ぞ れ 2 x 10 5 cop i e s /
L に 希 釈 した 。
測 定 対 象 と して 上 記 マ イ コ プ ラ ズ マ 1 7 株 を 使 用 した こ と 以 外 は 実 施 例 5
[0086]
と同様 に マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ D n a K 遺 伝 子 P C R を 検 討 した 結
果 、 17 株 す ベ て 増 幅 バ ン ドは 確 認 され な か っ た 。 M . peumon i a e の D n a K 遺 伝
子 増 幅 可 能 な D Ν Α 濃 度 の 10 , 000 倍 濃 度 の D N A 試 料 で も 交 差 性 は 認 め られ
な か った こ とか ら、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ D n a K 遺 伝 子 P C R は
非 常 に 特 異 性 が 高 い こ とが わ か った 。
[0087]
《実 施 例 7
：臨 床 検 体 か らの マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ D n a K 遺 伝 子
の増幅》
測 定 対 象 の 検 体 は 、 国 立 感 染 症 研 究 所 「病 原 体 検 出 マ ニ ュ ア ル 」 p . 1309-1 3
44
「マ イ コ プ ラ ズ マ 肺 炎 」 の 項 に 記 載 され て い る マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ェ Ρ 1 遺 伝 子 領 域 の nested
PGR に て 、 陽 性 で あ っ た 臨 床 検 体 4 6 例
ニ ュー モ
（咽 頭 拭 い
液 4 0 例 、 鼻 汁 2 例 、 鼻 咽 頭 吸 引 液 1例 、 鼻 咽 頭 拭 い 液 3 例 ） お よ び 、 陰 性 で あ つ
た 30例
（
健 常 人 咽 頭 拭 い 液 10 例 、 臨 床 検 体 咽 頭 拭 い 液 10 例 、 鼻 汁 4 例 、 鼻 咽 頭
吸 引 液 3例 、 鼻 咽 頭 拭 い 液 3例 ） の 抽 出 D N A を 用 い た 。
[0088]
マ イ コ プラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ D n a K 遺 伝 子 の P C R を 実 施 した 結 果 、 P
1 遺 伝 子 P C R 陽 性 4 6 例 全 て に お い て D n a K 遺 伝 子 の 増 幅 が 確 認 され た 。 _
方 、 P 1 遺 伝 子 P C R 陰 性 3 0 例 は 、 い ず れ も D n a K 遺 伝 子 の 増 幅 は 認 め られ
な か った 。
[0089]
[0090]
[ 表 1 1]
《実 施 例 8
D n a
：培 養 菌 株 お よ び 臨 床 検 体 の D n a K 遺 伝 子 塩 基 配 列 の 解 析 》
Κ 遺 伝 子 P C R に て 増 幅 の 認 め られ た 、 実 施 例 5 の ATGG 株 8 株 、 実
施例 7 の臨床検体 8 例
塩
酉己歹|J を 、
Ox I Genet
i
（咽 頭 拭 い 液 7 例 、 鼻 咽 頭 拭 い 液 1 例 ） の P C R 産 物 の
Dy e Termi
i c Ana l yzer
nator
v3. 1
(App l i e d B i osystems)
を 使 用 し 、 3 13
に て 角 売 した 。
(App l i e d B i osystems)
そ の 結 果 、 上 記 、 ATGG 株 8 株 お よ び 、 臨 床 検 体 8 例 の P C R 産 物 は 、 D n
a K 遺 伝 子 1 , 788bp
あ る M1 2 9株
(Acc
(配 列 番 号 6 )
No.
が 、 す べ て 100% — 致 し 、 GenBank に 登 録 の
NG—00091 2 )
お よ び F H株
(Acc
No.
CP002077)
と も 100%
— 致 した 。 図 1 〜 図 3 に M 1 2 9 株 と F H株 の 相 同 性 を 示 す 。
—方 、 P 1 遺 伝 子 につ いて 、参 考 文献
Y,
996,
p.
447-449
Vo l .
34,
No.
2)
（JOURNAL OF CL I N I CAL
M I CR0B I 0L0G
に従 って 、 P C R — R L F P 法 に よ
つ て 型 鑑 別 を 行 っ た と こ ろ 、 実 施 例 5 の ATGG 株 8 株 は 2 群 に 分 か れ た 。 具 体
的 に は 、 M 1 29-B7 株 、 M52 株 、 P I 1428 株 、 Mutant
22株 の 4 株 が I 型 に 分 類 で き
、 F H株 、 Bru 株 、 Mac 株 、 UTMB-1 0 P株 の 4 株 が I I 型 に 分 類 で き た 。 図 4 〜 図 1
0 に 代 表 的 な M1 2 9株
（配 列 番 号 7 )
と F H株
（配 列 番 号 8 )
の相 同性 を示す 。
こ の 結 果 か ら 、 D n a K 遺 伝 子 は 、 P 1 遺 伝 子 型 の 異 な る 株 間 で も 100% — 致
し、 ま た 、 異 な る 分 離 地 お よ び 、 過 去 5 0 年 間 に 分 離 され た 株 お い て も 、 塩 基
配 列 の 変 異 が 認 め られ な い た め 、 獲 得 した 抗 体 は 、 遺 伝 子 型 、 地 域 、 年 代 に
よ っ て 反 応 性 に 差 は な い と 考 え られ た 。
産 業上の利用可能性
本 発 明 に よれ ば 、 口腔
鼻 腔 擦 過 物 、 尿 、 組 織 サ ン プル 、 体 液 又 は 培 養 物
か ら採 取 され た 検 体 中 に 含 ま れ る マ イ コ プ ラ ズ マ
は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 、 及 び
又
ジ ェ ニ タ リウ ム を 特 異 的 に 感 度 良 く検 出 す る こ とが で
き、特 に マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー モ ニ エ に よ っ て 惹 起 され る 非 定 型 肺 炎 の 診
断 、 あ る い は 、 マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム に よ っ て 惹 起 され る 非 淋 菌
性 尿 道 炎 及 び 性 感 染 症 の 診 断 に 重 要 で あ り、 医 薬 品 の 産 業 上 有 用 で あ る 。
以 上 、 本 発 明 を 特 定 の 態 様 に 沿 っ て 説 明 した が 、 当 業 者 に 自 明 の 変 形 ゃ 改
良 は本 発 明 の 範 囲 に含 まれ る 。
請 求 の範 囲
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ
ム の D n a K を 指 標 とす る こ と を 特 徴 とす る 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
— モ ニ エ又 は マ イ コ プ ラズ マ
ニュ
ジ ェ ニ タ リウ ム の 検 出 方 法 。
D n a K 蛋 白質 を免 疫 学 的 に分 析 す る 、 請 求 項 1 に記 載 の 方 法 。
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ
ム に特 異 的 な抗 D n a K 抗 体 。
請 求 項 3 に記 載 の 抗 D n a K 抗 体 を含 む 、 マ イ コ プ ラズ マ
モ ニ エ又 は マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュ ー
ジ ェ ニ タ リウ ム の 検 出 用 キ ッ ト。
D n a K 遺 伝 子 を 指 標 とす る 、 請 求 項 1 に 記 載 の 方 法 。
マ イ コ プ ラズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ
ム に 特 異 的 な プ ラ イ マ 一 又 は プ ロー ブ 。
請 求 項 6 に 記 載 の プ ラ イ マ ー 又 は プ ロー ブ を 含 む 、 マ イ コ プ ラ ズ マ
ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラズ マ
ジ ェ ニ タ リウ ム の 検 出 用 キ ッ ト
INTERNATIONAL
A.
CLASSIFICATION
G01N33/5
OF SUBJECT MATTER
69 (2
(2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
International application No.
SEARCH REPORT
6
1 ) i ,
C 0 7K1
G01N33/53
6/1
2 (2 0 0
1 ) i ,
C 1 2N1
5/09
(2 0 0
1 )
f
C 1 2Q1
/68
(2 0 0 6 . 0 1 )
According to International Patent Classification (IPC) or t o both national classification and IPC
B.
FIELDS SEARCHED
Minimum
G 0 1N3
documentation searched (classification
3 / 5 6 9 ,
C0 7K 1 6/ 12 ,
system followed by classification symbols)
C 1 2N1
5 / 0 9 ,
C12Q1 / 68 ,
G 0 1N3
3 / 5 3
Documentation searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Kokai
Shinan
Koho
Jitsuyo
1922-1
Shinan
Koho
996
Jitsuyo
1 971-2011
Toroku
Shinan
Jitsuyo
Toroku
Koho
1996-2011
Shinan
Koho
1994-2011
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
JST
Plus
/ JME
DOCUMENTS
C.
DPlu
s / J ST 7
CONSIDERED
Category*
8 0 ( JDreaml
l )
,
CAplus
T O B E RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
X/A
WO
0 1 / 5 7 1 9 9
0 9
Augu
s t
A l
( A s ahi
2 0 0 1
l ine
s
Ka s e i
Relevant t o claim No.
Co r p . ) ,
6
(0 9 . 0 8 . 2 0 0 1 ) ,
page
2 ,
&
US
2 0 0 4 / 0 0 1 4 9 43
1 9
t o
&
CN
1 4 0 62 7 9
2 2
A l
A
&
AU
3 0 5 3 2 0 1
&
TW
2 8 2 3 68
B
J P 05 - 3 04 990 A
( Behringwerke
AG. ) ,
1 9 November
1 9 93 (1 9 . 1 1 . 1 9 93 ) ,
A
A
5 641 63 8
A
& EP
53 74 97
&
DE
4134297
A
& AU
2712 192
& CA
2080713
A
J P
63 - 0 0 0 2 9 8
A
0 5
January
1 9 8 8
2 5 43 8 4
( Cetu
s
A 2
AU
*
Special categories of cited documents:
document defining the general state of the art which i s not considered
to be of particular relevance
"E
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
L
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited t o establish the publication
date of another citation or other
special reason (as specified)
"O"
document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion or other means
"P"
t o the international
See patent family annex.
"T"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying the invention
"X
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive
step when the document i s taken alone
"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled i n the art
filing date but later than
&
Date of the actual completion of the international search
2 0 1 1
(3 1 . 0 1 . 1 1 )
Name and mailing address of the ISA/
Japane
s e
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210
Patent
A
Co r p . )
"A
,
A2
(05 . 0 1 . 1 98 8 ) ,
Further documents are listed in the continuation of Box C .
January
.- 6
& US
E P
3 1
(STN )
document member of the same patent family
Date of mailing of the international search report
0 8
February
Authorized officer
Of f i c e
Telephone No.
(second sheet) (July 2009)
,
2 0 1 1
(0 8 . 0 2 . 1 1 )
INTERNATIONAL
SEARCH
International application No.
REPORT
PCT / JP2
C (Continuation).
Category*
010/ 07 1 652
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
A
DAS CHER C . C . e t a l . , Heat
Shock
R e spon s e i n
Mycopla
smas , Genome -Limited
Organi
sms , J .
Bacte
r i o l . , 1 9 9 0 . 0 4 , V o l . 1 7 2 , No . , P . 1 8 2 3 - 1 8 2 7
1- 6
A
US 5 1 5 8 8 7 0 A
( BASEMAN
J . B . ) ,
2 7 Octobe
r 1 9 92 (2 7 . 1 0 . 1 9 92 ) ,
( a mi l y ： none )
1- 6
A
J P 2002- 3 06169 A
( Pfi z e r Product
s I nc . ) ,
2 2 Octobe
r 2 0 02 (22 . 1 0 . 2 002 ) ,
& EP 12 45 677 Al
& DE 6 0 1 2 5 5 0 7 D
& CA 2 3 4 0 4 5 5 A
& AT 3 4 953 0 T
& DK 1 2 4 5 6 7 7 T
& ES 2 2 7 7 8 93 T
& PT 1 2 4 5 6 7 7 E
& CA 2 3 4 0 4 5 5 A l
1- 6
A
J P 2004- 73185 A
( The
I n s t i tute
R e s earch
) ,
11
a r ch 2004 (11 . 03 . 2004 ) ,
& US 65 3 7 7 7 3 B l
& CA 2 1 7 8 5 2 6 A
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
& EP
f or
Genomi
75 600 6 A2
c
1- 6
INTERNATIONAL
Box No. I I
Observations
This international
. □
where
SEARCH
certain
International
REPORT
claims were found
unsearchable
(Continuation
application
of item 2 of first
search report has not been established in respect o f certain claims under Article
No.
sheet)
17(2)(a) for the following
reasons:
Claims Nos.:
because they relate t o subject matter not required
2. □
t o b e searched b y this Authority,
namely:
Claims Nos.:
because they relate t o parts of the international application that do not comply with the prescribed
extent that n o meaningful international
search can b e carried out, specifically:
requirements
t o such an
Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences o f Rule 6.4(a).
Box No. Ill
Observations
This International
Se e
. □
ext
where
Searching Authority
r a
unity
of invention
found multiple
i s lacking
inventions
(Continuation
of item 3 of first
i n this international
application,
sheet)
as follows:
sheet
A s all required
additional
search fees were timely
paid by the applicant,
this international
search report covers all searchable
claims.
2. [ x ]
A s all searchable claims could b e searched without effort justifying
additional
fees, this Authority
did not invite payment of
additional fees.
3. □
A s only some o f the required additional
search fees were timely paid b y the applicant,
only those claims for which fees were paid, specifically
4. □
N o required
restricted
Remark
additional
search fees were timely paid b y the applicant.
t o the invention
on Protest
first mentioned
The additional
this international
search report covers
claims Nos.:
Consequently,
this international
search report i
in the claims; it i s covered b y claims Nos.:
search fees were accompanied
b y the applicant's
protest and, where applicable,
b y the applicant's
protest but the applicable
the
payment o f a protest fee.
The additional
search fees were accompanied
fee was not paid within
N o protest accompanied
Form PCT/ISA/210
(continuation
the time limit specified
in the invitation.
the payment of additional
o f first sheet (2)) (July 2009)
search fees.
protest
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
Cont inuati
on o f Bo
No . I
International application No.
ェェ of conti nuat ion of f i r st sheet (2 )
The t echni cal feature
common t o the invent ion o f claim
1 and the
invent ion of claim 6 i s dete ct ion o f Mycopl asma pneumoniae or Mycopla sma
geni tal ium . The common t echni cal feature , howeve r , cannot b e con si de red
as a spe c i al techni cal feature
s ince i t doe s not make a contribut
ion
over the pri or art i n view o f the di sclo sure of do cument 1 (WO 2001/ 057199
Al ) . I n addit ion , there
i s no othe r same or corre spondi ng spe c i al
t echni cal feature
among tho se inventi on s - Cons equent l y , the claims o f
thi s inte rnat ional
appl i cati on contain
the fol lowing two (group s of )
invent ions .
(I nventi on group 1 ) the invent ion s of claims
1- 5
I nvent ions r elated t o a method for detecti ng Mycopla sma pneumoni ae or
Mycopl asma geni tal ium , whi ch i s characte r i zed b y u s ing DnaK o f Mycopl asma
pneumoni ae or Mycopla sma geni tal ium as an indi cato r ; an antibody
u sed
f or the method ; and a k i t u sed f or the method
(I nventi on group 2 ) the invent ion s of claims
6 and 7
I nvent ions r elated t o a primer or probe whi ch i s speci f c t o Mycopla sma
pneumoni ae or Mycopl asma genital ium
Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
A .
J P 2 0 1 0 /
0 7 1 6 5 2
発 明 の 属 す る分 野 の 分 類 （
国 際 特 許 分 類 （I P C ) )
Int.Cl.
B .
P C T
G01N33/569 (2006. 01) i
G01N33/53 (2006. 01) i
，C07K16/12
(2006. 01) i
，C12N15/09
(2006. 01) i
，C12Q1/68
(2006. 01) i
調 査 を行 っ た分 野
調 査 を行 っ た 最 小 限資 料 （
国 際特 許 分 類 （I P C ) )
Int.Cl.
G01N33/569,
C07K16/12,
C12N15/09,
C12Q1/68,
G01N33/53
最 小 限 資 料 以 外 の 資 料 で調 査 を行 っ た 分 野 に含 ま れ る もの
日本 国 実 用 新 案 公 報
日本 国公 開 実 用 新 案 公 報
日本 国 実 用 新 案 登 録 公 報
日本 国 登 録 実 用 新 案 公 報
1 9 2 2 — 1 9 9 6 年
1 9 7 1 — 2 0 1 1 年
1 9 9 6 — 2 0 1 1 年
1 9 9 4
2 0 1 1 年
国 際調 査 で使 用 した電 子 デ ー タベ ー ス （
デ ー タベ ー ス の 名 称 、調 査 に使 用 した用 語 ）
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580
C .
(JDreamll)
、CAplus
(STN)
関連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リ一 水
X/A
引用 文 献 名
A 1 (旭 化 成 株 式 会 社 ） 2001. 08. 0 9 ，
0 01/57199
第 2 頁第 1 9
A
2 2
& US 2004/0014943
A l & AU 3053201
6 ，7/1-5
A
& CN 1406279
A & T W 282368
J P 05-304990
A (ベ ー リン グ ヴェ ノレく'丁 · ァ ク チ ェ ン グ ゼ ル シ ャ フ ト）
1993. 11. 19 ， & US 5641638
& AU 2712192
B
A & EP 537497
A & CA 2080713
A2 & DE 4134297
1-6
A
A
c 欄 の続 き に も文 献 が列 挙 され て い る。
*
関連 す る
請 求項 の 番 号
及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示
パ テ ン トフ ァ ミ リー に 関す る別 紙 を参 照 。
引用 文 献 の カ テ ゴ リー
ΓΑ 」特 に 関連 の あ る文 献 で は な く、一 般 的 技 術 水 準 を示 す
の 日の 後 に公 表 され た 文 献
「
τ 」 国 際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 され た文 献 で あ っ て
もの
ΓΕ 」国 際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 で あ るが 、国 際 出願 日
出願 と矛 盾 す る もの で は な く、発 明 の原 理 又 は理 論
の 理 解 の た め に 引用 す る もの
r x 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 の み で発 明
の新 規 性 又 は進 歩 性 が ない と考 え られ る もの
ΓΥ 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 と他 の 1 以
以 後 に公 表 され た もの
「L 」優 先 権 主 張 に疑 義 を提 起 す る文 献 又 は他 の 文 献 の発 行
日若 し く は 他 の 特 別 な 理 由 を確 立 す る た め に 引 用 す
る文 献 （
理 由 を付 す ）
Γθ 」 口頭 に よ る開 示 、使 用 、 展 示 等 に言 及 す る文 献
「Ρ 」国 際 出願 日前 で 、か つ 優 先 権 の 主 張 の 基 礎 とな る 出願
国 際調 査 報 告 の発 送 日
国 際調 査 を完 了 した 日
3 1 .
0 1 .
2 0 1 1
国 際調 査機 関 の名 称 及 び あ て 先
日本 国特 許 庁 （I S A
J Ρ )
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関三 丁 目 4 番 3 号
様式 P C T
l S A
上 の文 献 との 、 当業 者 に とっ て 自明 で あ る組 合 せ に
よ っ て進 歩 性 が な い と考 え られ る も の
Γ& 」 同一 パ テ ン ト フ ァ ミ リー 文 献
2 1 0
0 8 .
0 2.
2
特許 庁審 査官 （
権 限 の あ る職 員 ）
海野
電話番 号
(第 2 ペ ー ジ） （2 0 0 9 年 7 月 ）
2 0
J
1
3 9 0 6
佳子
0 3 — 3 5 8 1 — 1 1 0 1
内線
3 2 5 2
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
C
(続 き） .
P C T /
J P 2 0 1 0/
関 連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
A
引用 文 献 名
J P 63-000298
DAS しriER C.
et
al.
Genome-Limited
，
Heat
Organisms,
1988. 01. 0 5
1-6
i n Mycoplasmas,
1-6
コー ポ レイ シ ョ
A2 & AU 7068587
し.
関連 す る
請 求 項 の番 号
及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の 表 示
A (シ タ ス
& EP 254384
A
¾nock
J.
Response
Bacteriol.
，
1990. 0 4 ， Vol.
1992. 10. 27,
(フ ァ ミ リー
172
No. 4 ， P. 1823-1827
A
US 5158870
A
J P 2002-306169
A (BASEMAN J .
& EP 1245677
DK 1245677
J P 2004-73185
B.
A ( フ アイ ザ 一
A 1 & DE 60125507
T & ES 2277893
)
な し)
1-6
' プ ロ ダ ク ツ . イ ン ク ） 2002. 10. 2 2 ，
D & CA 2340455
Τ & ΡΤ 1245677
A & AT 349530
Ε & CA 2340455
T &
A
2004. 03. 1 1 ， & US 6537773
I SA
2 1 0
1-6
Α1
(ザ . ィ ン ス テ ィテ ュ ー ト . フ ォ ー ' ジ エ ノ ミ ック . リ サ ー チ ）
様式 P C T
0 7 1 6 5 2
B 1 & EP 756006
A2 & CA 2178526
(第 2 ペ ー ジ の 続 き ） （2 0 0 9 年 7 月 ）
A
1-6
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
第 Π欄
P C T /
J P 2 0 1 0/
0 7 1 6 5 2
請 求 の範 囲 の 一 部 の調 査 が で き ない とき の意 見 （
第 1 ペ ー ジ の 2 の続 き）
法 第 8条 第 3項 （P C T 17 条 （
2) (a) ) の 規 定 に よ り、 こ の 国 際 調 査 報 告 は 次 の 理 由 に よ り請 求 の 範 囲 の 一 部 に つ い て 作
成 しな か っ た。
1
.
Γ"
請求項
は 、 こ の 国 際調 査 機 関 が調 査 をす る こ と を要 しな い 対 象 に係 る も の で あ る。
つ ま り、
2 .
匚：請 求 項
は 、有 意 義 な 国 際調 査 をす る こ とが で き る程 度 ま で所 定 の要 件 を満
ない 国 際 出願 の 部 分 に係 る もの で あ る。 つ ま り、
3 .
第
請求項
従 っ て記 載 され て い ない 。
欄
は 、従 属 請 求 の範 囲 で あ っ て P C T 規 則 6. 4 (a) の 第 2 文 及 び 第 3文 の 規 定 に
発 明 の 単 一 性 が欠 如 して い る とき の 意 見 （
第 1 ペ ー ジ の 3 の続 き)
次 に述 べ る よ うに こ の 国 際 出願 に二 以 上 の発 明 が あ る と こ の 国 際調 査 機 関 は認 め た。
特 別 ペ ー ジ参 照 。
1.
出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 をす ベ て 期 間 内 に納 付 した の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 す べ て の調 査 可 能 な請 求
項 につ い て作 成 した。
2 .
追 加 調 査 手 数 料 を要 求 す るま で も な く、 す べ て の調 査 可 能 な請 求 項 につ い て調 査 す る こ とが で き た の で 、追 加 調
查 手 数 料 の納 付 を求 め な か っ た。
3 .
出願 人 が必 要 な追加 調 査 手 数 料 を一 部 の み しか 期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 この 国 際調 査 報 告 は 、 手 数 料 の納
付 の あ っ た次 の 請 求 項 の み につ い て 作 成 した。
4 .
出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 を期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 請 求 の範 囲 の 最 初 に記 載
され て い る発 明 に係 る次 の 請 求 項 につ い て 作 成 した。
追 加 調 査 手 数 料 の 異 議 の 申立 て に 関す る注 意
□
追加 調 査 手 数 料 及 び 、該 当す る場 合 に は 、 異 議 申立 手 数 料 の納 付 と共 に 、 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ っ た。
追加 調 査 手 数 料 の納 付 と共 に 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ つ た が 、異 議 申立 手 数 料 が 納 付 命 令 書 に示 した期 間
内 に支 払 わ れ な か っ た。
追加 調 査 手 数 料 の納 付 は あ っ た が 、 異 議 申立 て は な か っ た。
様式 P C T
I SA
2 1 0
(第 1 ペ ー ジ の続 葉 （2 ) )
( 2 0 0 9 年 7 月）
国 際調 査 報 告
国 際 出願 番 号
P C T /
J P 2 0 1 0/
0 7 1 6 5 2
第 m 欄 の続 き
請 求 項 1 に係 る発 明 、請 求 項 6 に係 る発 明 は 、マ イ コ プ ラ ズ マ ' ニ ュ ー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ
ラ ズ マ ' ジ ェ ニ タ リ ウ ム の 検 出 とい う共 通 の 技 術 的 特 徴 を 有 して い る。 し力、しな が ら、当該 技
術 的 特 徴 は 、文 献 1 ( 国 際 公 開 第 0 1
5 7 1 9 9 号 ） の 開 示 内 容 に 照 ら して 、先 行 技 術 に 対
す る貢 献 を も た らす も の で は な い か ら、当該 技 術 的 特 徴 は 、特 別 な 技 術 的 特 徴 で あ る とは い え
な い 。 ま た 、これ らの 発 明 の 間 に は 、ほ か に 同 一 の 又 は 対 応 す る特 別 な 技 術 的 特 徴 は 存 在 しな
い 。 そ して 、 請 求 の 範 囲 に は 以 下 に 示 す 2 の発 明 （
群 ） が 含 ま れ る。
(発 明 1 ) 請 求 項 1
5 に係 る発 明
マ イ コ プ ラ ズ マ · ニ ュ ー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラ ズ マ · ジ ェ ユ タ リ ゥ ム の D n a K を 指 標 とす
る こ と を 特 徴 とす る 、マ イ コ プ ラ ズ マ · ニ ュ ー モ ニ エ 又 は マ イ コ プ ラ ズ マ · ジ ェ ユ タ リ ゥ ム の
検 出 方 法 お よび 該 方 法 に使 用 す る抗 体 、 キ ッ トの発 明 。
( 発 明 2 ) 請 求 項 6 — 7 に係 る発 明
マ イ コプ ラズ マ . ニ ュー モ ニ エ 又 は マ イ コプ ラズ マ . ジ ェ ニ タ リゥム に特 異 的 な プ ライ マ ー
又 は プ ロー ブ の 発 明 。
式P C T
I SA /
2 1 0
(特 別 ペ ー ジ） （2 0 0 9 年 7 月 ）

動的ペチェック過程による磁気リコネクションの新たな高速化機構

プラズマ X線管 - 岩手医科大学

NBI用大型負イオン源のビーム引出時におけるH-密度特性

NEXCO西日本からの分散利用のお願い;pdf

Microsoft Outlook

カタログPDF

BIOBASE Knowledge Libraryカタログ（708KB）

スライド 1

CINAHL Basic Searching

資料2 - 高齢者住宅財団