1682 PCR法 を用 いた喀 痰 中 の結 核菌 群 お よび Mycobacterium属 菌 の迅 速検 出 塩野義製薬株式会社臨床検査部シオノギバイオメデ ィカル ラボ ラ トリーズ 楠 伸治 村 田 豊 南 出和喜 夫 内田 清久 岐阜大学 医学部微生物学講座 三 浦 宏 明 江 (平成4年9月2日 崎 孝 行 受付) (平成4年10月7日 受理) Key words: PCR, mycobacteria, tuberculosis 要 MPB70蛋 白 遺 伝 子 と16SrRNA遺 Mycobacterium属 で あ っ た.両 旨 伝 子 を 検 出 目 標 と し たPCRを 用 い て喀痰 中 の結 核菌 お よび 菌 を そ れ ぞ れ 検 出 す る方 法 を 開 発 した.Mycobacterium属 以 外 の30属57菌 種 を 被 検 菌 と し た 試 験 で16SrRNA遺 り,MPB70遺 Mycobacterium complex 菌27菌 種 とmycobacteria 伝 子 の 増 幅 はMyobacterium属 菌 に特 異 的 であ 伝 子 の 増 幅 はM.tuberculosis,M.bovis,M.africanum ,M.microtiの 結 核菌 群 に特異 的 試 験 の 結 果 を 組 み 合 わ せ る こ とに よ り,結 核 菌 群 と非 結 核 性 抗 酸 菌 を 鑑 別 す る こ とが で き た. 抗 酸 菌 症 が 疑 わ れ た 喀 痰311検 体 を 用 い て 従 来 法 と の比 較 を 行 った 結 果,塗 抹 また は 培 養 試 験 で 陽 性 の 17例 中,PCR法 で は 結 核 菌 群12例 お よ び非 結 核 菌 性 抗 酸 菌4例 が検 出 され た .1例 で は検 出 で き な か った.従 来 法 で 陰 性 で あ っ た294例 中 ,PCR法 検 出 され た.こ れ らの 結 果 に つ い て は,結 核 菌 群 特 異DNAプ で 結 核 菌 群13例,非 以 上 の 結 果,本PCR法 ぞ れ 直 接,高 結 核 性 抗 酸 菌8例 と もに 陰 性 で あ っ た 。な お 対 照 と し て で 結 核 菌 群 は 検 出 され な か っ た . は従 来 法 に較 べ 迅 速 で あ り,喀 痰 中 の 結 核 菌 お よ びMycobacterium属 感 度 に検 出 で き る こ とが わ か った.今 が ロ ー ブ に よ る検 出 結 果 お よ び 患 者 の 臨 床 的 背 景 の 調 査 結 果 と も矛 盾 し な か っ た.残 る273例 は 従 来 法,PCR法 用 い た 一 般 細 菌 検 査 用 喀 痰197検 体 か らは 本PCR法 に つ い て は 本PCR法 菌 をそれ 後 の 抗 酸 菌 症 の 早 期 診 断 に 有 用 性 が 高 い と考 え られ る. 序 文 に較 べ て感 度 が 低 く,検 体1mlあ た り104個程 度 の 結 核 症 の診 断 は 患 者 検 体 中 に 結 核 上 菌を証明す る 菌 数 が 存 在 し な い と検 出 で き な い と言 わ れ て い こ と に よ り確 定 す る.現 在 広 く実 施 され て い る る.一 方,培 養 検 査 は 感 度 的 に 優 れ て い る も の の, チ ー ル ネ ル ゼ ン法 等 の 塗 抹 検 査 は 検 体 中 の 抗 酸 性 抗 酸 菌 の 分 裂 速 度 は非 常 に 遅 く,通 常 肉眼 的 に 観 菌 の 存 在 を 迅 速 に確 認 で き る 優 れ た 手 段 で あ る 察 で き る集 落 を 形 成 す る まで に長 期 間 を 要 す る と が,検 い う欠 点 が あ る.近 年 開 発 さ れ たDNAプ 出 され た 菌 が 結 核 菌 で あ るか 否 か の判 断 は で き な い.し か も,小 川 培 地 等 を 用 い る培 養 検 査 別 刷 請 求先:(〒566)大 カル ラボ ラ ト リー ズ 相 同 性 に 基 づ く 同 定 法2)を利 用 す る と数 コ ロ ニ ー に相 当す る被 検 菌 量 で 試 験 を実 阪府 摂 津 市 三 島2-5-1 塩 野義 製 薬(株)シ や 染 色 体DNAの ロー ブ1) オ ノギ バ イ オ メデ ィ 施 す る こ とが で き,結 果 も数 時 間 以 内 に判 明 す る. 楠 そ の た め,分 離 培 養 に加 え増 菌 培 養 の期 間 も必 要 伸治 感染 症 学 雑誌 第66巻 第12号 PCR法 を用 い た結 核 菌 と抗 酸 菌 の迅 速 検 出 1683 と した従 来 の 生 化 学 的 な 同 定 法 に較 べ る と早 期 に 盗 後,ア 結核上 菌 の 鑑 別 同定 を 行 う こ とが 可 能 に な った.し ル ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 に よ っ て 除 蛋 白 を 行 っ た.エ か し,分 離 培 養 の期 間 自体 は短 縮 さ れ な い の で 診 タ ノ ー ル 沈 殿 に よ っ て 得 たDNAを100μ1の 断 ま で1∼2ヵ 水 に 溶 解 し,PCR用 月 以 上 を要 す るの が 実 状 で あ る. そ こで,PCR法 19kD,MPB64等 を用 い て 結 核 菌 の65kD,38kD, ル カ リ性SDSを 加 え て 溶 菌 し,フ 下TB-PCR) 反 応 液 組 成 は10mMTris(pH8.3),50mM を 目的 と して 増 幅 し,臨 床 材 料 中 に存 在 す る これ KCI,1.5mMMgCl2,0.01%gelatin,dNTPs各 らのDNAを 200μM,Cousinsら11)の 直 接 証 明す る こ とで 迅 速 に 結 核 症 の るTB.1Aお 診 断 を行 う試 み が数 多 く発 表 され て い る3)∼6). 本 邦 に お い て 現 在 で も最 も重 要 な感 染 症 で あ る 結 核 症 は,近 年 発 生 率 が 微 減 も し くは横 ば い 状 態 で あ る の に 対 し,M.avium complex症 に代表 さ ラ ー ゼ1.25U,テ ン プ レ ー トDNA1μ1に し た.PCRは94℃-62℃-72℃,各 1分 間 を34サ イ ク ル 行 っ た.反 を 示 して お り7),免 疫 不 全 患 者 の 増 加 とあ い ま っ さ れ る372bpの て 今 後 そ の 臨 床 的 重 要 性 は大 き くな る こ とが 予 想 色 に よ り検 出 し た. た.そ 出す る こ とを 目的 と し て検 討 を 行 っ の結 果,Mycoゐacterium属 き る16SrRNA遺 菌 を広 く検 出で 原 蛋 白9)をタ ー ゲ ッ トと したPCRを うこ とで 目的 を達 す る こ とが で きた.以 行 下,本 法 あ る 以 外 は,前 増 幅 さ れ る600bpの 4.特 Table1に ium属 材 料 と方 法 1.菌 株 株 お よび 臨 床 材 料 か ら分 離 され る菌 種 を 主 とした 以 外 の30属57菌 種 の基 準 株,標 バ ン ドを 検 出 した. 種28菌 テ ン プ レ ー ト と し てTB- よ びMYC-PCRを 以 外 の57菌 行 っ た.Mycobact〃 株 に つ い て は 培 養 菌 体1白 蒸 留 水 に 懸 濁 し100℃ で5分 す る こ と に よ っ てDNAを 間 煮沸 抽 出 し 遠 心 上 清 の5μ1 5.検 出感 度 (SBL 3222)の 2.臨 床 検 体 釈 し て テ ン プ レ ー ト と し,各PCRを 抗 酸 菌 症 が 疑 わ れ た 患 者 よ り採 取 され た 喀 痰 た,生 菌 数 既 知 のM.bovisBCG 精 製DNAを (SBL 3221)の 菌 浮 遊 液 を 段 階 的 に 希 釈 し て 喀 痰 に 混 合 し,本 痰197検 体 の 計508検 体 を用 い た. に よ る 試 験 を 行 っ た. 6.従 抽出 三 浦10)の方 法 に 準 じて 行 った.概 略 は 次 の とお 希 行 っ た.ま 311検 体 お よ び そ の 疑 い の な い一 般 細 菌 検 査 用 喀 3.本 法 金 を テ ン プ レ ー ト と し た. M.tuberculosis 準 株 ま た は 臨 床 分 離 株 を使 用 した. 項 と 同 様 の 条 件 で 実 施 し, 示 すMycoゐacterium属27菌 耳 量 を1mlの 種28菌 報 告 よ びprimer- 異性 PCRお (1)喀 痰 か ら の抗 酸 菌DNAの 幅 下MYC- 用 い た プ ラ イ マ ー がBoddinghausら8)の 比 較 した 結 果 に つ い て 報 告 す る. Myco6acterium属 菌 の 検 出(以 を も と に 作 製 し たprimer-246お 株 の 精 製DNA10ngを 示 すMycobacterium属27菌 応液 バ ン ドを エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド染 の 特 性 お よ び臨 床 検 体 を 用 い て 従 来 法 との 成 績 を Table1に 応 終 了 後,反 ガ ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 し,増 (3)Myco6acterium属 MYCで 伝 子 を タ ー ゲ ッ ト8)にしたPCR と,結 核 菌 群 を 特 異 的 に検 出 す る こ とが で き る MPB70抗 調 製 し, PCR) の 結 核 菌 お よ び結 核 菌 以 外 のMycobacterium属 菌 を 鑑 別,検 リ メ 全 量 は50μ1と れ る非 結 核 性 抗 酸 上 菌 症 は,発 生 率 が 依 然 微 増 傾 向 を 用 い臨 床 検 体 中 報 告 した プ ラ イ マ ー で あ よ びTB-1B各200pM,Taqポ の10μ1を2%ア され る.そ こで,我 々 はPCR法 蒸 留 テ ン プ レ ー ト と し た. (2)結 核 菌 群 の 検 出(以 の 抗 原 蛋 白 を コ ー ドす る遺 伝 子 ェノー 法 来法 均 質 化 した 抗 酸 菌 検 査 用 喀 痰 を 結 核 菌 検 査 指 針12)に 準 じ て チ ー ル ネ ン ゼ ル 染 色 お よ び4% りで あ る.喀 痰 溶 解 剤(ス プ タ ザ イ ム(R),極東 製 薬) NaOH処 に よ り 均 質 化 し た 喀 痰1mlの 養 し た.観 察 は 培 養4週 目 お よ び8週 目 に 行 っ た. 一 般 細 菌 検 査 用 喀 痰 に つ い て は従 来 法 に よ る試 験 lysozymeを 加 え,ガ 平 成4年12月20日 遠 心 沈渣 に ラ ス ビー ズ と共 に 激 し く振 理 後 小 川 培 地 に 接 種 し,37℃ で8週 間培 1684 楠 Table 1 Specificity 伸治 他 of the PCR methods, TB-PCR and MYC-PCR 感 染 症学 雑 誌 第66巻 第12号 PCR法 を用 いた結 核 菌 と抗酸 菌 の 迅速 検 出 a: Our culture b: Clinical c : DNA collection of Shionogi biomedical amplification was observed near 菌 陽性 たPCRプ 疾 と も に 塩 化 セ チ ル ピ リジ ニ ウ ム ー コ ハ ク 酸 処 理 た. 成 1.特 培 養 法 で 検 出 され た 抗 酸 菌 は ナ イ ア シ ン テ ス ト M:cobacterium属 ま た は マ イ ク ロ プ レ ー トハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ソ た(Table1).TB-PCRで 近 の 増 幅 バ ン ドは み ら れ な か っ はM.tuberculos空,Ml. bOvis,Ml.bOvおBCG,Ml.micnot4M.afriCanum ロ ー ブ法 平 成4年12月20日 績 菌 以 外 の 菌 種 に はMYC- 法2)に よ り 同 定 し た. の 塩 基 配 列 を 認 識 す る市 販 の 結 核 菌 群 同 定 用 プ ロ ー ブ,M.avium同 よ って 増 幅 され 異性 PCRで600bp付 16SrRNA内 定 用 プ ロ ー ブ(中 外 製 薬) ロ ダ ク ト30μ1を 加 熱 変 性 し て 使 用 し 地(極 東 製 薬)を 組 み 合 わ せ た 培 養 法13)も 併 せ て 実 施 し た. in TB-PCR. を 使 用 し た.検 体 はMYC-PCRに と な っ た 検 体 に つ い て は 抗 酸 菌 用 ・一般 検 査 用 喀 7.DNAプ by 372bp. ブ,Ml.iNtmcellulare同 本 法 のMYC-PCRでM:cobacterium属 laboratory. isolate は 実 施 し な か っ た. に よ る 雑 菌 処 理 と 小 川K(R)培 1685 定 用 プ ロー に372bpの バ ソ ドを し め し,Mycobacterium属 の 結 核 菌 群 に 特 異 的 で あ っ た.Mycobacterium属 菌 楠 1686 以 外 の1菌 種 に372bp付 伸治 他 近 の 増 幅 が み ら れ た が, で き 両 者 の 検 出 感 度 は ほ ぼ 同 等 で あ っ た.な ゲ ル 上 の 位 置 で 見 分 け る こ とが 可 能 で あ っ た. 2.検 喀 疾 に 混 合 し たMl.bovisBCGは102cfu/mlま 出感 度 Mr.tuberculosis精 お, で 検 出 す る こ と が で き た. 製DNAを テ ン プ レー ト と し た 検 討 の 結 果,MYC-PCR,TB-PCRと も反 応 チ ュ ー ブ あ た り0.1pgのDNAを Table 2 Comparison which of detection were suspected 疾 検 体 を 用 い た 本 法 と従 来 法 の 成 積 抗 酸 菌 症 が 疑-わ れ た311検 検 出す る こ とが 311 sputa, tional 3.喀 で 陽 性25例,陰 of mycobacteria 性286例 and tubercle mycobacteriosis, in methods existence of M . tuberculosis complex and/nor mycobacteria. b : It demonstrates c : Contamination existence of nontuberclous The full results a : "G" and figure of 17 positive represents b : The figure represents c : It could be detected Gaffky and nontuberculous mycobacteria. d : Only one showed a band of DNA amplification 3 bacilli by PCR and conven- a : It demonstrates Table 体 は 本 法 のTB-PCR で あ っ た.一 方,MYGPCR nearly 372bp by TB-PCR. specimens by conventional methods the scale , respectively. the number of colonies. by CPC-Ogawa K medium method only . 感 染 症学 雑 誌 第66巻 第12号 PCR法 陽 性37例,陰 性274例 で あ っ た.TBPCR陽 例 は 全 て,MYC-PCRで 陽 性 で あ っ た.従 本 法 の 成 績 の 相 関 をTable2に 1687 を用 い た結 核 菌 と抗酸 菌 の迅 速 検 出 性 の25 コ ロ ニ ー の 結 核 菌,1例(No.204)は4週 来法 と コ ロ ニ ーの 結 核 菌 の 生 育 が認 め られ 本 法 の 結 果 と 示 す.311検 一 致 した 体 中, .同 目 に40 じ く10例 中3例(No.41,53,177) 塗 抹 も し く は 培 養 試 験 で 抗 酸 菌 が 確 認 さ れ た17例 はMYGPCRの に つ い て,Table3に た た め 非 結 核 性 抗 酸 菌 の 存 在 が 疑 わ れ た.こ 詳 述 し た.塗 抹 陽 性 の7例 (No.44,84,91,106,206,209,304)は はTB-PCRでDNAの こ れ ら6例 菌 陽 性 と な り, 1例 が 検 出 さ れ,本 増 幅 が み ら れ た. 1例(No.138)はMYC-PCR,TB.PCRと 除 き 培 養 試 験 でMl.tuberculo- sisが 検 出 さ れ た.塗 抹 陽 性7例 (No.304)はMYC-PCRの 372bpの chelonaeと の 例 か らは 培 例 中294検 PCRで ロ ニ ー の 菌 が 認 め ら れ,M. は 本 法 で はTB-PCR陽 で あ り結 核 菌 群 が 存 在 す る と判 定 さ れ た.う 例(No.34,35,65,100,140)は8週 Table 4 The results た.こ ち5 which 平成4年12月20日 z 10% is positive ; NT represents 培 養 で1コ ち 本 法 の い ず れ か の の 成 績 をTable4に の13例 のMYC-PCRで "not tested" し 性 とな っ 増 幅 し た16SrRNA す べ て 結 核 菌 群 検 出 用 DNAプ ロ ー ブ と ハ イ ブ リ ッ ドを 形 成 し 結 核 菌 群 DNAの 増 幅 物 で あ る こ と が 確 か め ら れ た.294例 showed and the PCR method a: 体 あ っ た が,う 陽 性 と な っ た21例 遺 伝 子 由 来 のDNAは 性 目 に1∼10 of 21 cases 菌 自 検 出 さ れ た. め す.13例(No.24∼292)がTB-PCR陽 塗 抹 で は抗 酸 菌 が 確 認 され ず 培 養 試 験 で の み 陽 中6例 増 幅 が み ら れ ず 紛cobacterium属 従 来 法 で 抗 酸 菌 が 検 出 さ れ な か っ た 検 体 は311 同 定 さ れ た. 性 と な っ た10例 る も ロ ニ ー のM.tuberculosisが み 陽 性 でTB-PCRで 目 に15コ の3 法 の 結 果 が 確 認 さ れ た.残 体 が 存 在 し な い と考 え ら れ た が,8週 の う ち 残 る1例 増 幅 が み ら れ な か っ た.こ 養4週 DNAの か ら は 雑 菌 汚 染 に よ り判 定 不 能 と な っ た1例(No.209)を 陰性 であ っ 例 か ら は 培 養 法 でM.avium2例,Ml.cheloNae 本法 の MYC-PCRでMycobacterium属 うち6例 み 陽 性 でTB-PCRは contradiction between conventional 楠 1688 中8例(No.66∼307)はMYC-PCRの あ っ た た め,非 れ た.こ み陽性 で 結 核 性 抗 酸 菌 が 存 在 す る と判 断 さ れ ら の 増 幅DNAはMl.avium用 プ ロー ブ と ハ イ ブ リ ッ ドを 形 成 し た1例(No.296)を き い ず れ か のDNAプ ロ ー ブ と も反 応 せ ず,結 菌 群,M:aviumお よ びM.intmcelluhlre由 こ とを 再 確 認 した .し か し,Mycobacterium属 以 外 でBaoillus属 の1菌 種 に372bpに 近 い位置 に 核 消 化 後 の パ タ ー ン が 異 な る こ と か ら も,結 核 菌 来 で DNAの コ ン タ ミネ ー シ ョン等 が 原 因 で な く,結 核 菌 以 外 のDNAと 体 は 従 来 法,本 菌 増 幅 バ ン ドが み られ た.こ の例 は,制 限 酵 素Sacl 法 と も陰 性 で た.一 の反 応 で あ る こ とが 確 認 され 方,実 際 の 臨 床 検 体 中 に み られ る本 増 幅 バ ン ドに つ い て 調 べ て み る と,Mycobacterium属 あ っ た(Table1). 一 般 細 菌 検 査 用 の 喀 疾197検 で3例 本 プ ラ イマ ー が結 核 菌 の検 出 に も応 用 可 能 で あ る 除 は な い こ とが 確 認 で き た. 311検 体 中273検 伸治 他 体 につ いて は本法 がMYC-PCRでMycobacterium属 と な っ た が,TB.PCRは 核 菌 群 のDNAは 菌 陽性 い ず れ も 陰 性 で あ り,結 検 出 さ れ な か っ た.こ に つ い て は 小 川K培 れ ら3例 地 法 に よ る 培 養 で も抗 酸 菌 は 検 出 で き な か っ た. 自体 が検 出 され な か った274例 中,本 増 幅位 置 に近 い パ ン ドを 示 した 例 は1例(0.4%)に た.し か も,こ の1例 考 察 幅 バ ン ドの 位 置 が僅 か に異 な って いた た め,注 意 深 い観 察 で 鑑 別 は可 能 で あ っ た.311検 体 を 用 い た 染 の1例 塩基 配 列 は系 統 分類 学 上 過 ぎな か っ につ い て も前 述 の ご と く増 本 法 の 評 価 でTB-PCR陽 細 菌 の16SrRNAの 菌 性 の25例 か ら は 雑 菌 汚 を 除 い て,培 養 また はDNAプ ロー ブ に よ っ て結 核 菌 群 の 証 明 が で きた こ とを 考 え合 わ せ の 重 要 な 指 標 と され 多 くの菌 種 に つ い て デ ー タが る と,MPB70を 蓄 積 さ れ て い る.Mycobacteriaに 関 し て も 床検 体 中 か ら結 核 菌 群 の み を 特 異 的 に検 出 す る こ シー とが で き る と考 え られ る.な お,疑 わ し い増 幅 に Rogallら14)に よ っ て20菌 ク エ ン ス が 報 告 さ れ,属 種 の16SrRNAの 内 に広 く保 存 さ れ て い る タ ー ゲ ッ トに したTB-PCRは つ い て は,先 述 の1例 に もMycobacterium属 菌の 領 域 お よび 菌 種 特 異 的 な 領 域 の配 列 とそ の所 在 が 存 在 そ の もの が 認 め られ な か っ た よ うに,MYG 示 さ れ,プ PCRを ロ ー ブ を併 用 した 同定 に も利 用 され て い る.Boddinghausら8)の 報 告 し たprimer-246と 流 の ア ン チ セ ン ス 配 列 よ り作 製 し たprimer-MYCを 用 い て 行 っ た 著 者 ら のMYC. ynebacterium属 子 のDNAも 縁 菌 種 で あ るCor- 菌,Tsuhamurelhz属 属 菌,Nocardia属 菌,GordoNa よ っ て16SrRNA遺 増 幅 さ れ るの で,我 伝 々の 目的 で あ る 臨 床 検 体 中 の結 核 菌 と非 結 核 性 抗 酸 菌 を 鑑 別 して に よ っ てMycobacteriuN属 菌 の 存 在 す る検 体 を ス ク リー ニ ン グ し,次 い で そ れ ら の検 体 に つ い て 菌 体 外 産 生 蛋 白 で あ るMPB70は Radfordら9)に の みTB-PCRを よ っ て ク ロ ー ニ ン グ さ れ492塩 の 配 列 が 決 定 さ れ た.MPB70蛋 基 白 はMl.bovisに 特 異 的 に 産 生 さ れ る 蛋 白 で あ る た めELISA法 はMl.tuberculosisと 増 幅 す る プ ラ イ マ ー を 用 い たPCR法 伝 子 の372bpを が結 核 菌群 の 検 出 に 利 用 で き る こ と を 報 告 し た .我 示 すmycobacteria基 Ml.tuberculosis臨 床 分 離 株100株 行 い,結 核 菌 群 を 検 出 す る方 法 で あ る.MYC-PCR(+):TB-PCR(一)で あ れ ぽ, 非 結 核 性 抗 酸 菌 の存 在 を 示 す.MYC-PCR(+): で の 鑑 別 に 利 用 さ れ て い る15). し か し,Cousinsら11)はMPB70遺 Table1に 性 の検 体 検 出 す る こ とが 実 現 で き る.す な わ ち,MYC-PCR 菌 に は 本 増 幅 バ ン ドは み ら れ な か っ た. M.bovisの 試 験 成 績 で示 した とお り,TB-PCR陽 は 例 外 な くMYC-PCRに 示 す と お りMycobacterium 属 菌 に 高 い 特 異 性 を 示 し,近 抗酸菌 の確 認試 験 に用 い る等 で偽 陽性 を 除 く こ とが で き る. そ の600base下 PCRは,Tablelに 臨 TB-PCR(+)の 場 合 は 結 核 菌 群 の 存 在 を しめ す が,非 結 核 性 抗 酸 菌 が 混 在 した場 合 も 同様 の 結 果 に な る た め,非 結 核 性 抗 酸 菌 の存 在 を否 定 す る も の で は な い. 々は 本 法 と従 来 法 の相 関 性 に関 して は,従 来 法 で 塗 準 株 以 外 に も 抹 陽 性 の7検 体 につ い て は 本 法 で す べ て検 出 で き を 被 検 菌 と して た.培 養 で の み 陽 性 とな った10検 体 の うち9例 感 染症 学 雑 誌 第66巻 第12号 は PCR法 本 法 で 検 出 で き た が,1例 を用 い た結 核 菌 と抗 酸 菌 の迅 速 検 出 は陰 性 で あ った.Table 3に 示 す とお り,従 来 法 陽 性 検 体 の59%(10/17) 培 目の 観 察 に よ って は じめ て 菌 が 確 認 され た もの で あ る.し か も,多 くが ナ イ ア シ ン テ ス トに 必 要 と され る50コ ロ ニ ー5)以 下 の 菌 数 で あ った. これ らの 例 で はPCR法 断 さ れ る よ うな例 は197検 体 中 に は ま った くみ ら れ なか っ た.本 法 で 結 核 が 疑-われ た 患 者 に は例 外 は 培 養 法 で の み 陽 性 で あ りそ の80%(8/10)は 養8週 1689 の有 用性 が特 に際だ つ も な く結 核 症 との 関 連 が認 め られ る こ と と も考 え合 わ せ る と,PCR法 で 偽 陽 性 が み られ る とい う考 え 方 は 妥 当 で は な く,単 に 従 来 法 との感 度 の 違 い に よ る不 一 致 と考 え るべ きで あ る と結 論 した. 従 来 法 陰 性 の うち8例 は 本 法 で非 結 核 性 抗 酸 菌 の で あ った.従 来 法 陽 性 の検 体 に は 非 結 核 性 抗 酸 が 検 出 さ れ た.患 者 の 臨床 的 背 景 を調 査 し得 た4 菌 が24%(4/17)含 例 は,じ とMYC-PCRの まれ て い た が,本 法 のTB-PCR 結 果 か ら 当初 の 目的 通 り,検 体 よ ん肺 結 核1例,陳 旧性 肺 結 核2例,結 症 の 既 往 歴 な し1例 で あ った.し 核 か し,こ れ ら結 り直 接 これ ら非 結 核 性 抗 酸 菌 の 存 在 を示 す こ とが 核 症 との関 連 が 示 唆 され る例 を 含 め た8例 全 て の で き た.非 結 核 性 抗 酸 菌 はNaOH処 16SrRNA遺 理 に よ り死 伝 子 由 来 のMYC-PCR増 幅DNA 滅 し や す い こ と は 知 ら れ て い る が17),今 回M'. は い ず れ も結 核 菌 群 特 異 プ ロー ブ とハ イ ブ リ ッ ド cheloNaeが 検 出 で きた1例(No.177)も を 形 成 せ ず 結 核 菌 群 由 来 のDNAで 塩 化 セチ は な い こ とが ル ピ リジ ニ ウム コハ ク酸 処 理 一 小 川K(R)培 地 法 で 確 認 さ れ た.実 際 の 医療 現 場 で は結 核 菌 の証 明 が の み 検 出 が 可 能 で あ った. な され な い ま ま 抗 酸 菌 染 色 やX線 本 法 で 検 出 で き なか っ た1例(No.138)に つい と診 断 され,結 核 予 防 法 に基 づ い て 報 告,治 療 が 用 いた再試 行 わ れ る例 が ま ま あ り18),今 回 の よ うな検 査 結 果 の再現 性が原 因で と臨 床 診 断 の 違 い の原 因 の ひ とつ に な っ て い る と 離 され た 菌 体 そ の も の を 思 わ れ る.し か し,当 然 の こ とな が ら本 法 で 結 核 て は凍 結 保 存 の テ ン プ レー トDNAを 験 の結 果 も陰 性 で あ り,PCR法 は な い と考 え られ た.分 像 か ら結 核 症 被 検 菌 と した場 合TB-PCR,MYC-PCRと も陽 性 菌 が 検 出 さ れ ずMycobacterium属 菌 の み の とな り,従 来 法 の 同定 どお り結 核 菌 群 で あ る こ と DNAが が確 認 され た.成 績 で示 した とお り,本 法 が抗 酸 る こ とを 意 味 す る もの で は な い.日 本 結 核 病 学 会 検 出 され た こ とが非 結 核 性 抗 酸 菌 症 で あ 菌 お よ び結 核 菌 を 検 出 す る性 能 は従 来 法 と比 較 し の非 定 型 抗 酸 菌 症 の 診 断 基 準19)に記 載 され て い る の よ うな不 一 致 の 起 とお り,非 結 核 性 抗 酸 菌 症 の 診 断 に は原 因 菌 が 多 こ る原 因 と して,本 例 の よ うな微 量 排 菌 の場 合 両 量 頻 回 に検 出 され る こ とが 必 要 で あ る.こ の 点 は, 者 の 試 験 方 法 の違 い に よ り,希 な 確 率 で生 じ る現 結 核 菌 が1個 象 で あ る と考 え る の が 妥 当 で あ ろ う. とは 根 本 的 に 異 な っ て い る.今 回 の検 討 で も本 法 て 高 い と判 断 で き る の で,こ PCR法 と従 来 法 の 比 較 で は 常 に偽 陽 性 が 問 題 で も検 出 され れ ば 診 断 が確 定 す る の で 結 核 菌 群DNAが 検 出 さ れ た 患 者 に は調 査 し得 と な る.今 回 の検 討 で も従 来 法 で陰 性 の294例 中13 た 範 囲 で は例 外 な く結 核 症 と の関 連 が 認 め られ た 例 は本 法 のTB-PCRで の に対 し,抗 酸 菌 症 の疑 い の な い一 般 細 菌 検 査 用 結 核 菌 の存 在 が 示 さ れ た. こ の うち 患 者 の 臨 床 的 背 景 の 判 明 した6例 全 てが 喀 疾 か ら もMycobacterium属 菌 のDNAが 検出 結 核 症 と診 断 され て い る患 者 よ り採 取 され た 検 体 され た.非 結 核 性 抗 酸 菌 は環 境 中 に 広 く分 布 す る で あ り,結 核 症 との 関 連 が確 認 で きた. 事 は よ く知 られ て い るが,臨 床 検 体 中 に も病 因 と 著 者 ら は 従 来 法 とPCR法 PCR法 を 比 較 し た と き, で み られ る 陽 性 側 へ の か た よ りが 操 作 手 順 等 を 含 め たPCR法 自体 に 起 因 す る もの で あ れ は無 関 係 に 存 在 す る場 合 が あ る か らで あ る20). 本 法 は 患 者 が感 染 源 と な る可 能 性 の 高 い塗 抹 陽 性 の場 合 に,そ れ が 結 核 菌 か否 か を 迅 速 に判 断 で ぽ,ど の よ うな 検 体 に も同 程 度 の確 率 で 陽 性 反 応 きる の で 患 者 自身 に と っ て も医療 者 側 に と って も が起 こ る と考 えた.そ こで 抗 酸 菌 症 が 疑 わ れ て い 利 用 価 値 が 高 い.し か し,本 法 で 結 核 菌 ま た は 非 な い 一 般 細 菌 検 査 用 喀 疾 に つ い て も本 法 に よ る試 結 核 性 抗 酸 菌 が存 在 す る と判 定 され て も,培 養 法 験 を 行 っ て み た と ころ,前 述 の とお り,結 核 と判 で抗 酸 菌 を証 明 で き る の は半 数 以 下 で あ り,治 療 平成4年12月20日 1690 楠 伸治 他 上 の 判 断材 料 と して い ず れ を重 視 す べ き か は 現段 け る非 定 型 抗酸 菌 感 染症 の研 究 (国療 非 定 型抗 酸 階 で は 明言 す る こ とは で き な い.し か し,本 法 と 菌症 共 同 研 究班, 1987年 度 お よび1988年 Mycobacterium 従 来 法 間 の齪 齪 は いわ ゆ る偽 陽 性 とは 考 え られ な 道 に も み ら れ, 全 国 的 な も の と な っ た. 結 核, 66: い こ と,実 際 の 医 療 現場 で は 医 師 が 患 者 個 々人 の 病 歴 や 様 々 な 臨 床 所 見 か らみ て総 合 的 に診 断 し, 651-659, H. & 1990. で 陰 性 の 結 果 が得 られ た場 合,わ ず か の 例 外 を 除 9) Radford, き従 来 法 で も陰 性 で あ っ た 事 実 は,無 用 な 入 院 や 検 査 に よ る患 者 の 負 担 を軽 減 す る こ とに つ な が る 文 献 1) Drakes, T. 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Hiroaki MIURA & Takayuki EZAKI Department of Microbiology,Gifu University School of Medicine We developed two PCR methods, which amplify bovine tuberculous MPB70 gene and mycobacterial 16S rRNA gene, for detection of tubercle bacilli and mycobacteria in sputum , respectively.A mong 27 Mycobacterium species and 57 species of 30 genuses other than Mycobacterium, only M. tuberculosis (TB) complex, i.e., M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti showed DNA amplification by PCR for MPB70, and amplification of 16S rRNA gene were observed specific in Mycobacterium species. A combination of these PCR abilities were available to differentiate the TB complex and nontuberculous mycobacteria (NTM). We investigated the correlation between these methods and conventional methods with 311 sputa that were suspected mycobacteriosis. The PCR method could detect 12 cases of TB complex and 4 cases of NTM in 17 specimens, which were positive by conventional methods, but could not for one specimen. Among 294 specimens that were negative with conventional methods , the PCR method detected 13 and 8 cases of TB complex and NTM, respectively . These results were confirmed by commercial tuberculous specific DNA probe or investigation of the clinical background of the patients . On the other hand, 273 specimens showed negative result either PCR nor conventional methods. The PCR method did not detect tuberculous DNA in normal 197 sputa , which were not suspected mycobacteriosis. These results indicate that each one of these PCR methods is highly specific to TB complex or Mycobacteriumspecies. We concluded that these PCR methods are useful and advanced methods for rapid and direct detection of tubelculosis and mycobacteriosis. 平成4年12月20日
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