新潟大学脳研究所 ｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣ 共同利用・共同研究報告書 神経特異的転写調節因子 REST 結合タンパク質 RILP の コンディショナルノックアウトマウスの作製 研究代表者 研究分担者 下條 崎村 1）関西医科大学医化学講座 正仁 1) 建司 2) 2）新潟大学脳研究所 研究要旨 ほとんどの神経系の遺伝子は転写抑制因子 REST (RE1-silencing transcription factor) により発現 調節されている。申請者は、REST の核移行とその機能に影響する因子を発見し REST-Interacting LIM domain Protein (RILP) と名づけた。REST の機能異常は神経疾患、がん発症と関係し、さら に、申請者らは RILP が、てんかんに関与している報告を行った。また、RILP がハンチントン病 遺伝子産物と複合体を形成しており、神経機能異常に関与している報告を行った。そこで本研究 では、RILP の機能を詳細に分析する目的で RILP のコンディショナルノックアウトマウスを作製 する。 A. 研究目的 ほとんどの神経系の遺伝子は転写調節因子 REST（RE1-silencing transcription factor）により発現 調節されている。REST は 9 個の ZD を含む転写因子であり、その機能には核内移行が重要であ る。申請者は REST の機能に関して詳細に研究を行った結果、REST の核移行には N 末端から 3-5 番目の ZD が重要であることを報告した。この部分に結合し REST の核移行を調節する因子を探 索した結果、新規タンパク質を発見し、RILP（REST-Interacting LIM domain Protein）と名付けた。 REST は多くの神経系疾患に関与している報告があることから、RILP は REST の機能を調節する 因子として神経疾患に関係している可能性が高い。最近、REST および RILP がハンチントン病遺 伝子産物 Huntingtin と結合し、さらに Dynactin p150Glued を含む複合体を形成していることを報告 した。さらに神経系では、特異的に発現している HAP1 が会合し、複合体の細胞内輸送が調節を 受けている。そこで、今年度研究機関では、RILP の機能を明らかにする目的で、RILP コンディ ショナルノックアウトマウスを作製し、神経系への影響を詳細に検討する。 B. 研究方法 これまの研究の結果、RILP の機能にはその LIM ドメインが重要であることを報告した。そこで、 この部分を除去することにより、RILP の機能をノックアウトしたマウスを作製する。まず、ター ゲティングベクターを作製し、エレクトロポレーションにより ES 細胞にベクターを導入する。 現在までに、RILP 遺伝子を含むマウス BAC クローンから、Flox 領域、5’または 3’領域の各フラ グメントを PCR にて増幅した。ベクター導入後、相同組換え体をサザンブロットによりスクリー ニングを行った。 C. 研究結果 ベクターを作製し、ES 細胞へエレクトロポレーションを行った。得られたコロニーから、サザン ブロットにより分析を行ったが、ポジティブコロニーは得られなかった。ベクター内のターゲッ ト遺伝子のアームの長さが短いことが考えられたので、ベクターの再構築を行った（下図参照）。 ES 細胞内へベクターを導入し、得られたコロニーのスクリーニングを行ったが、ポジティブクロ ーンは得られなかった。現在、再度 ES 細胞への導入を行い、結果を待っている。 D. 考察 目的遺伝子のアームをベクターに挿入した結果、その長さが短いことが原因だと考え、アームの 長さを長めにした別のベクターを作製した。配列に GC リッチな場所が多く、PCR での作製が困 難であった。このことも一因になっていると考える。 E. 結論 RILP 遺伝子の配列が ES 細胞に取り込みにくい構造になっている可能性が考えられる。現在、再 度 ES 細胞への導入を行い、結果を待っている。 F. 研究発表 なし G. 知的財産権の出願・登録状況 1. T 特許取得 2. 実用新案登録 3. その他 なし なし
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