Real-time RT-LAMP 法を用いたインフルエンザウイルスの迅速的遺伝子診断法に関する研究日大生産工 (PD) ○根本浩史日大生産工 (院) 坂井俊哉日大生産工小森谷友絵, 神野英毅【緒言】 2009 年 4 月にメキシコおよびアメリカにて (Yamanashi/166/98) 不活化ウイルス粒子 (Zeptmetrix, USA)を使用した。臨床検体として確認されたブタ由来の新型インフルエンザウ 2008 年冬から 2009 年秋にインフルエンザ様症イルスによって、日本でも流行地域からの帰国状を示した患者から採取した鼻孔ぬぐい液を者を中心に全国各地で緊急検査が実施された用いた。ことは記憶に新しい。交通機関の発達した現代社会において、今後もこのような感染拡大を未 2. 然に防ぐため、感染者を早期に発見することが (NCBI)の Influenza virus resource より検索した重要であり、そのためには迅速かつ正確な診断インフルエンザ B 型の塩基配列をアライメン法が求められる。ト解析し、LAMP 法プライマー作製支援ソフト現在、POC におけるインフルエンザウイルスの診断法は、イムノクロマトなどの免疫診断 Primer Explorer ver.4 を用いて 4 本のプライマーおよび 2 本のループプライマー(LP)を作製法が迅速診断法として用いられている。免疫診した(Table 1)。また同様に A/H1N1、A/H3N2 断法はその感度性能から感染早期の患者におおよび新型インフルエンザ(Swine, H1N1)に特いて偽陰性を示す場合があるため、そのバックアップとして高感度な遺伝子学的測定法が重異的に反応するプライマーを設計した。要である。しかし、実験室測定法として標準的 Table 1 LAMP Primer for Influenza B virus な Real-time RT-PCR 法は設備や測定時間など Primer の制約があり、POC にて運用できる診断法に FluB-M-FIP は成り得ていない。そこで我々は、新規遺伝子増幅法である FluB-M-BIP Sequence (5'‐3') GCGTTCCTAGTTTTACTTGCATTGATGAAAGCTCAGCGCTACT TGCGAGAAACAAGCATCACATTCTGCATTTCTCGTCTCACT ATTTGAAATAGCAGAAGGCC TGTTCATAGCTGAGACCATC CCAGGATTCAGGTACATGACCATG ACACAGGGCTCATAGCAGAGCA Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) 法に着目した。LAMP 法は等温で遺伝子増幅が行え、迅速に遺伝子を検出できる 1)。また、操作が簡便で、6 領域を 4 本のプライマーで増幅することから特異的かつ高感度な測定を行うことができる。本研究では、今後も感染が拡大すると予測される新型インフルエンザウイルスを対象として、LAMP 法を原理とする高感度かつ迅速的な遺伝子学的測定法の構築を目的とした。【実験方法】 1. 使用したウイルス検討した標準サンプルとしてインフルエンザ A 型 (Singapore/63/04, H1N1 および Victoria/3/75, H3N2)、インフルエンザ B 型使用プライマー National Center for Biotechnology Information FluB-M-F3 FluB-M-B3 FluB-M-LF FluB-M-LB 3. Real-time RT-LAMP 反応性の検討標準サンプルより抽出した RNA を 102 倍∼ 105 倍に希釈し標準 RNA とした。それぞれの標準 RNA を鋳型とし、各プライマーを用いて RT-LAMP 法にて測定を行った。また、LP を追加し、反応の時間変化を検討した。測定は RNA Amplification Kit (栄研化学)および Loopamp リアルタイム濁度測定装置 RT-160C (栄研化学) を用い、63℃、波長 660 nm での 10 秒毎の濁度変化を測定した。 Study on Nucleic Acid Test for Rapid Detection of Influenza virus by Real-time RT-LAMP Hiroshi NEMOTO, Toshiya SAKAI, Tomoe KOMORIYA and Hideki KOHNO 4. 臨床検体測定以前報告した One-step な multiplex real-time Turbidity (dAbs) 0.15 RT-PCR により臨床検体のスクリーニングを行った 2) 。測定には RNA-direct realtime PCR (TOYOBO)および LightCyclerⅡリアルタイム測定装置 (Roche Diagnostics, USA)を用いた。 104 copy 103 copy 102 copy 101 copy 0.1 0.05 また、同じ検体を用い、Real-time RT-LAMP 法により各亜型に特異的に反応するプライマー 0 0 を用いて測定を行い比較した。【結果および考察】 1. Real-time RT-LAMP の反応性設計した Influenza B 検出用プライマーを用 10 20 30 40 50 60 Time (min) Fig. 1 Detection of Influenza B virus by Real-time RT-LAMP いて測定した結果、遺伝子増幅による特異的な Fluorescence (560 nm) 濁度上昇が確認でき、各希釈サンプルで濃度に応じた検出が行えた (Fig. 1)。また、LP を使用することで 20%程度反応起点の時間が短縮され、LAMP 反応の高効率化が確認できた。 2. 臨床検体の測定 Multiplex real-time RT-PCR により測定した結果、 560 nm の蛍光チャンネルで検体 A,B, C,D 検体D 検体A 検体E 検体F NC 検体C 検体B で増幅曲線の立ち上がりが確認できた(Fig. 2)。 Cycle これより 4 検体が A 型陽性であると確認できた。そこで新型インフルエンザに対するプライ Fig. 2 Detection and screening of Influenza viruses マーにより LAMP 測定を行った結果、検体 A にて特異的な濁度上昇を示し、増幅曲線の立ち by multiplex real-time RT-PCR Turbidity ( dAbs ) 上がりを確認できた(Fig. 3)。そのため検体 A は新型インフルエンザウイルスであると示唆 0.2 !"A !"B !"C !"D !"E !"F NC 0.15 された。両測定法の増幅曲線の立ち上がりを比較すると、Multiplex real-time RT-PCR 法では 28 cycle (約 50 分)で蛍光反応が確認できたのに対 0.1 0.05 し、Real-time RT-LAMP 法では約 20 分で濁度 0 上昇が確認できた。これより Real-time RT- 0 10 LAMP 法を用いることで、より迅速にインフルエンザウイルスが検出できることが示された。【結論】 20 30 40 50 60 Time (min) Fig. 3 Detection by Real-time RT-LAMP against novel Influenza virus 迅速的にインフルエンザの遺伝子学的測定を行うために、リアルタイム RT-LAMP 法を検【参考文献】討した。本法は逆転写反応から遺伝子増幅までを等温・ワンステップで行えて、新型インフル 1) ことから、POC 用途の遺伝子定量法として用いることができ、今後拡大が予測される新型インフルエンザにおける多角的な対策の一つになると期待できる。 Notomi et al, Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Research, 28, No.12, 2000, e63 エンザウイルスの測定では迅速的な反応性を示した。さらに本法は濁度変化にて測定可能な Tsugunori 2) 日本大学大学院生産工学研究科生命工学・リサーチ・センター平成 20 年度研究報告