糖鎖分析メソッド集逆相スケールへの変換法 Ver. 20140710 Written by S. Natsuka 方法の概要逆相 HPLC の溶出位置を標準化する方法。HPLC の溶出時間を比較することで同定を行う場合、実験間でのばらつきを少なくすればそれだけ正確な解析が可能になる。しかし、溶離液組成のわずかな違いやカラムの劣化など様々な要因により溶出時間は変動する。そこで基準物質を用いた標準化が行われる。逆相 HPLC では 8 種の標準 N-結合型糖鎖（逆相スタンダード）を用いて PA 糖鎖の標準化を行う。イソマルトオリゴ糖を用いて標準化する方法もあるが、逆相 HPLC では本方法の方が、かなり誤差は小さい。この方法を使った時に引用すべき論文１．逆相スケール法のオリジナル論文 Kanta Yanagida, Hideyuki Ogawa, Kaoru Omichi, Sumihiro Hase. Introduction of a new scale into reversed-phase high-performance liquid chromatography of pyridylamino sugar chains for structural assignment. J. Chromatogr. A, 800 (1998) 187-198. ２．標準糖鎖の調製法と新しい逆相 HPLC の溶出条件が書かれている論文 Shunji Natsuka, Mayumi Masuda, Wataru Sumiyoshi, Shin-ichi Nakakita. Improved method for drawing of a glycan map, and the first page of Glycan Atlas, which is a compilation of glycan maps for a whole organism. Plos One, 9 (7) e102219 (2014). 8 種の標準 PA 糖鎖の調製各単品は市販品（タカラバイオや和光純薬）もあるが、非常に高価なので我々は以下の方法で調製している。8 種の標識糖鎖混合物が比較的安価で市販されることが望まれる。  GlcNAc-PA と GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 市販の GlcNAc と N,N’-diacetylchitobiose（和光純薬）をピリジルアミノ化することにより調製する。  Fucα1-6GlcNAc-PA と GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-PA 市販の Fucα1-6GlcNAc と GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc（共に東京化成で合成）をピリジルアミノ化することにより調製する。  M3B と M3BF6（PA 化糖鎖の略号は糖鎖マップデータベースの項を参照） M3B はニホンウズラのオボムコイドからヒドラジン分解と PA 化により調製する。オボムコイドの調製法は当該プロトコルを参照。M3BF6 はスルメイカの表皮からヒドラジン分解と PA 化により調製する。参考文献は、 Shunji Natsuka, Miwa Ishida, Akira Ichikawa, Koji Ikura, Sumihiro Hase. Comparative biochemical study of N-linked glycans prepared from skin of a squid, Todarodes pacificus. J. Biochem., 140 (1) 87-93 (2006).  BIBS と BIBSF6 それぞれ市販のウシ γ-globulin（シグマ）からヒドラジン分解と PA 化により調製する。逆相 HPLC での分離分離条件は「HPLC 条件」を参照。逆相スタンダードの逆相 HPLC 標準線の作成と逆相スケール値の算出 1. 逆相スタンダードを逆相 HPLC で展開する。 2. Excel ワークシートを用いて、逆相スケール値を求める。備考：逆相スケール値を求めるための Excel ワークシートが HP からダウンロード可能である。参考：逆相スケール値への変換 1. 逆相スタンダード GN, GNF6, GN2, GN2F6, M3B, M3BF6, BIBS, BIBSF6 の溶出時間(E)をそれぞれ E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8 それぞれの逆相スケール値(R)を R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 とおく。 R8 P R値 R7 R6 P R5 R4 R3 R2 P P R1 E1E2E3 E4 E5 E6 E7 E8 溶出時間 R 値変換の模式図 2. 横軸に E、縦軸に R をとり、各点を直線で結ぶ。このとき、 0～E1～E2 区間の傾きを a E3～E4 区間の傾きを b E5～E6 区間の傾きを c E7～E8～区間の傾きを d とおき、 a∙(E2－E1) = b∙(E4－E3) = c∙(E6－E5) = d∙(E8－E7) = P が成立つとする。つまりコアフコースの部分溶出時間 P が 4 組の PA 糖鎖の間で等しいとおく。 3. さらに、 E2～E3 区間の傾きを 1/2(a+b) E4～E5 区間の傾きを 1/2(b+c) E6～E7 区間の傾きを 1/2(c+d) とする。つまり間の区間の傾きは前後の平均値とする。 4. また、E=0 の時 R=0 と定める。 5. E が 0～E2 の時：R = P∙E/(E2－E1) E2～E3 の時：R = R2 + (E－E2)∙1/2∙P{1/(E2－E1)+1/(E4－E3)} E3～E4 の時：R = R3 + P∙(E－E3)/(E4－E3) E4～E5 の時：R = R4 + (E－E4)∙1/2∙P{1/(E4－E3)+1/(E6－E5)} E5～E6 の時：R = R5 + P∙(E－E5)/(E6－E5) E6～E7 の時：R = R6 + (E－E6)∙1/2∙P{1/(E6－E5)+1/(E8－E7)} E7～の時：R = R7 + P∙(E－E7)/(E8－E7) 6. さらに、R8 = 80 とすると、 R1 = P∙E1/(E2－E1) R2－R1 = P R3－R2 = 1/2∙P∙(E3－E2){1/(E2－E1)+1/(E4－E3)} R4－R3 = P R5－R4 = 1/2∙P∙(E5－E4){1/( E4－E3)+1/(E6－E5)} R6－R5 = P R7－R6 = 1/2∙P∙(E7－E6){1/( E6－E5)+1/(E8－E7)} R8－R7 = P 以上の右辺の和が 80 となることから、P を求めることができ、5 の式に順次代入することにより、任意の溶出時間 E に対する R 値が求まる。