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RuBPase 活性測定
RuBPaseの抽出法
leaf disc 三枚（2.355 cm）を凍結保存する。
+ 16mg Polyvinylpyrrolidone (PVP)
液体窒素を加えて乳鉢でよくすりつぶす。
+ Leaf grinding mediumを1.0 ml
16000 × g、30秒
上清を合わせて回収する。 ※これをRuBPase各分とする。
RuBPaseの活性測定法
石英セルを三本用意する。（1本:initial測定、1本:total測定、1本:ｰRUBP測定）
そのうち4本には…
残り1本には…
1680 ml
assay medium (AM)
assay medium (AM)
1680 ml
coupling medium (CM)
70 ml
coupling medium (CM)
70 ml
2mM NADH
60 ml
2mM NADH
60 ml
24mM RuBP
50 ml
miliQ
90 ml
miliQ
40 ml
を加える。
を加える。
セルを分光光度計にセットする。セルホルダーは二五℃に。
initial
total
RuBPase抽出液を100ml加える。
（すりつぶし後一分以内に）
RuBPase抽出液200mlにpre
RuBPase抽出液を100ml加える。
incubation mediumを50ml加える。
on ice 20分
セルに100mlを加える。
340nmの吸収変化を一分半程度測定する。
※ 一サンプルの測定に必要な溶液は、AM 5040 ml、LGM 1600 ml、CM 210 ml、2mM
NADH 180 ml、24mM RuBP 100 ml。RuBPは高価（100 mg 四万円）なので注意。
RuBPase 活性測定
RuBPase活性測定用試薬の調整
Leaf grinding medium (LGM)
100 mM Hepes-KOH (pH 7.8)
5 mM DTT
10 mM MgCl2･6H2O
1 mM EDTA-2Na
0.5 M Hepes-KOH (pH 7.8)
1600 ml
50 mM DTT
800 ml
0.25 M MgCl2･6H2O 320 ml
50 mM EDTA-2Na 160 ml
miliQ
5120 ml
計 8000 ml
（7サンプル分＋a）
Coupling Enzyme (CM)
10 unit Creatine kinase (CK)
10 unit 3-PGK
25 unit GA3PDH （すべて70mlでの含量）
1000 u/ml CK
150 ml
1000 u/ml 3-PGK 150 ml
500 u/ml GA3PDH 750 ml
計
1050 ml
（4サンプル分＋a）
その他の注意事項
assay medium (AM)
100 mM Bicine-KOH (pH 8.2)
20 mM NaHCO3
5 mM MgCl2･6H2O
1 mM ATP･2Na
5 mM Creatin Phosphate
0.5 M Bicine-KOH (pH 8.2)
6000 ml
1 M NaHCO3
600 ml
0.25 M MgCl2･6H2O 600 ml
50 mM ATP･2Na
600 ml
50 mM Creatin Phosphate
3000 ml
miliQ
14400 ml
計 25200 ml
（4サンプル分＋a）
Pre-incubation medium
375 mM HEPES-KOH (pH 7.8)
5 mM MgCl2･6H2O
50mM NaHCO3
500 mM HEPES-KOH (pH 7.8)
150 ml
0.25 M MgCl2･6H2O 40 ml
1 M NaHCO3
10 ml
計 200 ml
（3サンプル分＋a）
一、酵素類は3-PGKをのぞき液体で販売されている。一定量(CK 350unit/mg、GA3PDH
80unit/mg)を取り、16000×g、10分遠心後、100mM Bicine-KOH (pH 8.2)で希釈して
用いる。
二、 RuBPは水に溶かすと分解しやすい。測定するたびに調合すること。
三、セルにRuBPase抽出液を加えたら、すぐに攪拌棒で混ぜる。
四、セルを分光器にセットしたら、吸光が安定するまで待つ。

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