LC-MS/MS を用いたフェニトロチオンの分析 ○竹峰秀祐 1,2 、四ノ宮美保 3 、近藤明 2 環境省 環境調査研修所， 大阪大学大学院 工学研究科，3 埼玉県立大学 Analysis of Fenitrothion by using LC-MS/MS. by 1,2 Shusuke TAKEMINE, 3Miho SHINOMIYA, 2Akira KONDO, (1 The National Environmental Research and Training Institute, 2Graduate School of Engineering, Osaka University, 3Saitama Prefectural University) 1 はじめに ゴルフ場で使用される農薬等による周辺環境の汚染 と動植物への被害の未然防止を図るため，平成 2 年度 に”ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止 に係る暫定指導指針”が制定され，ゴルフ場排出水中の 農薬の濃度に指針値が設定された。平成 22 年度に暫定 指導指針の改正に伴い，分析法についても大幅な見直 しが行われ，LC-MS/MS を用いた一成分析法が示され た 1)。 LC-MS/MS を用いた一成分析法の対象となっている フェニトロチオンは，以前の検討においてクロマトグ ラム上で明瞭なピークが検出されなかった 2)。本研究 では，フェニトロチオンについて詳細に分析条件を検 討し，LC-MS/MS を用いた分析上での留意点について 知見が得られたため報告する。 1. 方法 フェニトロチオン(Dr.Ehrenstorfer Gmbh, >98.5%)25 mg を 50 mL のアセトンで溶解し，更にメタノールで 50 倍に希釈したものを標準溶液とした。LC-MS/MS は， Xevo TQD システム（Waters ACQUITY UPLC H-class Xevo TQD）および 3200 Q TRAP システム(SHIMADZU LC-20AD – AB SCIEX 3200 Q TRAP )を用い，それぞれ のシステムでフェニトロチオンの分析条件を検討した。 2. 2.1 MS 条件の検討 インフュージョン測定を行い，分析に適したトラン ジシ ョン イ オン の検 討を 行 った 。 標 準 溶液 を 50% 10mM 酢酸アンモニウム水/メタノール溶液で希釈し， トランジションイオン検討用の溶液とした。 MS 条件を最適化するため，フローインジェクショ ン分析を行った。標準溶液を 50%水/メタノール溶液で 希釈し，MS 条件検討用の溶液とした。移動相は A 液 に 2 mM 酢酸アンモニウム水溶液，B 液にメタノール を用い，アイソクラティックで B:50%で送液した。 2.2 検量線の作成 2.1 で検討した MS 条件を用い，両システムで検量線 の確認を行った。標準溶液を 1.0，2.0，4.0，10，20, 40, 80 ng/mL となるよう 50%水/メタノール溶液で希釈し， 検量線用溶液とした。 移動相は A 液に 2 mM 酢酸アンモニウム水溶液，B 2 液にメタノールを用い，グラジエント分析を行った。 流量は 0.2 mL/min とし，グラジエント条件は，B:20→ 90% (0→13 min)，B:90%(13→23 min)，B:20 %(23.1→28 min)とした。LC カラムとして，XevoTQD システムは ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm)，3200 Q TRAP システムは L-column2 ODS(3 μm, 2.1×100 mm)を 使用した。試料の注入量は 5 μL とした。 2.3 移動相中の酢酸アンモニウムの濃度とフェニトロ チオンの感度 移動相中の酢酸アンモニウムの濃度がフェニトロチ オンの感度にどのような影響を与えるか確認するため， 酢酸アンモニウムの濃度を 0(無添加)，1, 2，3, 5，10 mM となるように調整し，それぞれの溶液を移動相の A 液 として用い，標準溶液を 50%水/メタノール溶液で 20 ng/mL となるよう希釈し分析を行った。その他の分析 条件は 2.2 と同様とした。 3. 結果と考察 3.1 MS 条件の検討結果 検討を行った結果，Xevo TQD システムでは 278.0 > 246.0，278.0 > 124.9，および 278.0 > 108.9 のトランジ ションイオンが確認され，3200 Q TRAP システムでは， 278.1 > 125.1，278.1 > 109.2，および 278.1 > 79.0 のト ランジションイオンが確認された。なお，標準溶液を 50%水/メタノール溶液で希釈しインフュージョン測定 を試みたところ，50% 10mM 酢酸アンモニウム水/メタ ノール溶液と比べると感度が大きく減少した。 確認されたトランジションイオンについて，両シス テムで MS 条件を最適化した結果を Table 1， 2 に示す。 Table 1 MS analysis conditions of Xevo TQD system Ionization : ESI(+) Capillary voltage : 3.5 kV Source temp. : 150℃ Desolvation temp. : 450℃ Cone gas flow : 50 L/Hr Desolvation gas flow : 1000 L/Hr Collision gas flow : 0.15 mL/min MRM Transition [m/z] Cone Volt. [v] Col.Energy [v] 278.0 > 246.0 38 16 278.0 > 124.9 38 24 278.0 > 108.9 38 20 Table 2 MS analysis conditions of 3200 Q TRAP system : ESI(+) Turbo gas temp. : 700 ℃ : 3500 V Curtain Gas : 35 psi Ion Source Gas 1 : 70 psi Ion Source Gas 2 : 70 psi Spray voltage 15000 Peak area Ionization 10000 Xevo TQD system 5000 3200 Q TRAP system 0 DP [v] EP [v] CE [v] CXP [v] 278.1 > 125.1 41 6.5 25 4 278.1 > 109.2 41 6.5 23 4 278.1 > 79.0 41 6.5 43 4 MRM Transition [m/z] ク溶出時間の酢酸アンモニウム水溶液とメタノールの 混合割合が感度に影響する可能性も考えられる。 3.2 検量線の作成結果 検量線用溶液の分析例を Fig.1 に示す。感度が高かっ た 278.0 > 124.9 (XevoTQD システム)、278.1 > 125.1 (3200 Q TRAP システム)を定量用イオンとして検量線 を作成した結果， 両システムとも R2 > 0.995 を示した。 今回の分析条件および濃度範囲では，フェニトロチ オンの定量性に大きな問題は無いと考えられる。 Fig.1 Mass chromatogram of Fenitrothion (20 ng/mL) analyzed by 3200 Q TRAP system. 3.3 移動相中の酢酸アンモニウムの濃度とフェニトロ チオンの感度の検討結果 検討結果について Fig.2 に示す。横軸が酢酸アンモニ ウムの濃度を示し，縦軸がピークの面積値を示す。な お，システム毎にピーク面積の計算方法が異なるため， Fig.2 からシステム間の感度の比較は不可能である。両 システムとも酢酸アンモニウムを添加した場合と添加 しなかった場合ではピーク面積に顕著な違いが現れて いることが分かる。また，酢酸アンモニウム濃度が 1, もしくは 2 mM で最もピーク面積が大きく，3 mM 以上 は濃度が上がるにつれて，ピーク面積が小さくなる傾 向にあった。 3.1 のトランジションイオンの検討や本項の結果か ら，移動相中の酢酸アンモニウムの濃度がフェニトロ チオンのイオン化効率に大きな影響を与えていること が推測される。また，グラジエント分析の場合，ピー 0 2 4 6 8 10 Ammonium acetate conc. [mM] Fig.2 Relationship between ammonium acetate concentration and peak areas of Fenitrothion. 4. その他のフェニトロチオンの分析上の留意点 暫定指導指針別添の LC-MS/MS を用いた一斉分析の 対象として示されているテルブカルブのノミナル質量 は，フェニトロチオンのノミナル質量と差が無い（モ ノアイソトピック質量は，テルブカルブ：277.204193 Da，フェニトロチオン：277.017365 Da）。暫定指導指 針別添では，テルブカルブの分析条件例として，イオ ン化法は ESI(+)，定量用イオンとして 278 > 222，確認 用イオンとして 278 > 166 が示されているが，278 > 109 のトランジションイオンも検出される。 XevoTQD システムの検量線を作成した分析条件で フェニトロチオンとテルブカルブの混合液(20 ng/mL) を分析した例を Fig. 3 に示す。図は，278.0 > 124.9 お よび 278.0 > 108.9 のマスクロマトグラムを示してい る。13 分付近に検出されているピークがフェニトロチ オンであり，278.0 > 108.9 のマスクロマトグラムで 15 分付近に検出されているピークがテルブカルブである。 278.0 > 108.9 のトランジションイオンは，今回の分析 条件ではフェニトロチオンとテルブカルブのピークが 確認された。 フェニトロチオンの定量用イオンとして 278 > 109 を選択する場合は，テルブカルブとのアサインミスに 十分に注意する必要がある。 [min] Fig.3 Mass chromatogram of Fenitrothion and Terbucarb mixture (each 20 ng/mL) analyzed by Xevo TQD system. 【参考文献】 1) 環境省，ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁 の防止に係る暫定指導指針，http://www.env.go.jp/water 2) 竹峰秀祐 他，LC-MS/MS を用いたゴルフ場農薬の 一斉分析法の検討，第 15 回日本水環境学会シンポジウ ム
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