平成25年度厚生労働科学研究費補助金 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究事業 [若手24-26] 抗HTLV-1ヒト免疫グロブリンによる HTLV-1の革新的感染予防モデルの開発 とその有効性の検討 水上 拓郎 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 第４室 室長 成人T細胞白血病(ATL) 定義 臨床疫学的特徴 ATL細胞 HTLV-1感染Tリンパ球が腫瘍化し、クローン性に増殖 した事によって発症する疾患 • 疫学：西南日本に多い • 発症：家族内発症 平均発症年齢60歳 • 感染：母乳感染・性感染・輸血 • 予後は極めて不良 リンパ節腫大 感染症 皮膚の発疹 骨融解 胃への浸潤 脳への浸潤 HTLV-1総合対策 [2011年度] 発症予防 治療 キャリア全員がATLにはならない（5%前後が発症）なので、ATL発症 高危険群を同定し、発症介入を行う (HTLV-1総合対策2011) ATL治療法の開発（IFN/AZT治療等), 同種造血幹細胞治療 新規治療法（CCR4抗体）,ワクチン 感染防止 輸血感染 性感染 献血者スクリーニング（抗体検査)の導入により完全阻止 水平感染の可能性が高いが、詳細は不明 (避妊具） 母子感染の防止 母乳から人工乳へ 全国一律妊婦抗体検査 (2010年11月より) 感染率は20% しかし断乳しても3%感染する！ 新しい革新的感染予防法の開発が必要！ 抗HTLV-1ヒト免疫グロブリン によるHTLV-1感染予防法の開発-1 (H24年度) 抗体陽性血漿より抗HTLV-1ヒト免疫グロブリンの製造 高力価HTLV-IG HTLV-IG 佐竹正博先生（西東京日本赤十字血液センター） 田所憲治先生（日本赤十字中央血液研究所） *ロット差があるので幾つかのロットを作成 高力価HTLV-IGを用いたIn vitro系を用いた感染防止実験 FACS解析 核酸増幅試験 60日 ＋ ATL細胞株 HTLVキャリア ATL細胞 ＋ ー 培養細胞 やhPBMC HTLV IG 高力価IG 通常IG 5%,10%,20% Western Blotting 培養細胞を用いたin vitro 感染モデルの作成 Mitomycin C処理 (50ug/ml) 37℃1hrs ATL細胞株 培養細胞 HUT102, MT2 SLB-1, TL-OM1 Jurkat Molt4 核酸増幅試験 感染抑制の抗体濃度依存性 (for 10days ) 各種パラメーター との相関関係 3.5 3 2 PVL% PVL% (+) 6.0 PVL% (−) 5.0 1.5 PVL% in test sample PVL% 2.5 1 0.5 0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 3.5 0.0 抗体陽性献血検体のin vitro感染抑制効果の検討 2.0 PVL% in Jurkat pep180 3.0 1.4 1.5 1.0 0.5 0.0 pep180 ELISA PVL% 2.5 2.0 4.0 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.00 2.00 PVL% in Jurkat 4.00 抗体によるSyncytiumの抑制 SLB-1 Jurkat Jurkat/SLB1/NC Jurkat /SLB1 Jurkat/SLB1/抗体陽性検体 (T65:1%) シンシチウム形成抑制効果における抗体濃度依存性(T23) PVL% in Jurkat 4.0 50 46.7 41.3 39.7 40 30.7 30 24.7 20 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 10 0 correlation coefficient: 0.77 3.5 PVL% in Jurkat シンシチウム個数/ 3視野 60 3.7 control 0.10% 0.30% 0.5 3.7 0.3 0.0 0.50% 1.00% 0.0 LAT-27 NC1 NC2 0.0 NC3 60.00 8.0 pep 180 ELISA 9.0 20.00 0.00 correlation coefficient: -0.27 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 10.00 Jurkat/S… NC1 NC2 NC3 T22 T54 T49 T91 T26 T13 T15 T21 T79 T86 T83 T84 T31 T52 T74 T73 T51 T90 T87 T23 T57 T99 T20 T53 T47 T33 T65 T46 T35 T50 LAT-27… Number of syncytia /well 10.0 70.00 30.00 60.0 pep180 抗体陽性献血検体のシンシチウム形成抑制効果 40.00 40.0 syncytium formation スクリーニング条件としては抗体濃度が0.3%が最適であると考えられた 50.00 20.0 2.0 1.0 0.0 0.0 20.0 40.0 snycytium formation 60.0 (P V (P V TR L L> 4) L< 4) C 0 T The number of Syncytium/ well 1 N (P VL >4 ) 2 Se ru m L (P VL <4 ) TR ****P<0.0001 ****P=0.006 Se ru m Se ru m Se ru m T 3 C N PVL PVL Syncytium ****P<0.0001 ****P<0.0001 60 ****P<0.0001 40 20 0 小括 1. HTLV-1感染細胞株を用いてHTLV-1感染系を構築した。 2. 日赤献血由来、HTLV-1抗体陽性血清でスクリーニングを行った。抗体陽性献 血者のPVL%が高く、env, gagの力価が高い抗体が感染抑制効果が高かった。中 にはPVL%が低いが感染抑制が認められる検体もあった。Pep180力価との相関 は認められなかった。 3. シンシチウム形成を抑制する系を立ち上げた。30種類のHTLV-1陽性血漿を用 いてスクリーニングを行った結果、PVL%が高く、env,gagの力価が高い抗体が シンシチウム形成抑制効果が高かった。中には、献血者のPVL%が低くても、 シンシチウム形成抑制能が強い検体が認めらた。Pep180力価との相関は認め られなかった。 4. 高力価グロブリン製剤作製の候補検体は、無症候性キャリアのうち、PVL%が 高い検体を候補とするのがよい。 5. その他に注目する群が存在した。 10 Large Scale生産の可能な保管血漿 Large Scale生産の可能な保管血漿 PVL% in donors PVL% in donors 2.0 0.0 2.0 0.0 200.0 0.0 100.0 200.0 Inhibitioin % of syncytium formation Env gp46 ELISA 1.5 1.5 gp46 ELISA Jurkat/MT2 感染抑制% シンシチウム抑制% vs 2.0 vs Env gp46 1.0 0.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 200.0 PVL inhibition% in Jurkat /MT2 100.0 1.5 vs pep180 ELISA 1.0 0.5 0.0 0.0 100.0 200.0 pep 180 ELISA6 ELISA LAT-27 NS control F13 F34 F18 F10 F3 F25 F38 F28 F40 F26 F9 F24 F19 F7 F11 F14 F33 F6 F21 F41 F5 F27 F20 F12 F32 F37 F35 F2 F36 F39 F4 F29 F15 F8 F22 Jurkat/SLB1 シンシチウム形成抑制% pep 180 ELISA 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 Jurkat/MT2 感染抑制% 1.5 40.0 gag ELISA 1.0 20.0 0.5 LA… NS… F13 F34 F18 F10 F3 F25 F38 F28 F40 F26 F9 F24 F19 F7 F11 F14 F33 F6 F21 F41 F5 F27 F20 F12 F32 F37 F35 F2 F36 F39 F4 F29 F15 F8 F22 PVLが高いものが有効性が高い結果が再現 100.0 200.0 Inhibitioin % of syncytium formation PVL inhibition% in Jurkat /MT2 60.0 pep180 ELISA (0.5) (0.5) 80.0 100.0 200.0 Inhibitioin % of syncytium formation シンシチウム抑制% vs Jurkat/MT2 感染抑制% 20.0 0.0 4.0 Jurkat/MT2 感染抑制% 2.0 40.0 120.0 6.0 PVL inhibition% in Jurkat /MT2 60.0 (20.0) 100.0 donor PVL% 8.0 0.0 80.0 0.0 inihibition % 4.0 pep 180 ELISA PVL inihibition % 100.0 6.0 0.0 0.0 10.0 20.0 (0.5) PVL inhibition% in Jurkat /MT2 cells シンシチウム抑制% vs 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 gag ELISA6 ELISA 120.0 献血者血液のPVL% シンシチウム抑制% vs 10.0 donor PVL% 8.0 F13 F34 F18 F10 F3 F25 F38 F28 F40 F26 F9 F24 F19 F7 F11 F14 F33 F6 F21 F41 F5 F27 F20 F12 F32 F37 F35 F2 F36 F39 F4 F29 F15 F8 F22 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 gp46 ELISA PVL% Jurkat/MT2 感染抑制vs 10.0 gag ELISA 0.0 100.0 200.0 Inhibitioin % of syncytium formation 血漿からのグロブリンの精製 Slllグロブリン分画 血漿 3 25 0 0 20 40 min 60 2 1 1 0 0 カラム：G3000SWXL 2本 流速： 0.5ml/min Buffer: 0.05% NaN3, 0.1M NaSO4, 1/7.5M Phosphate buffer (pH7.0) mAU 25 2 mAU 50 mAU 50 3 20 40 60 min 実験レベルとしては良質の免疫グロブリンの製造に成功した 抗HTLV-1ヒト免疫グロブリン によるHTLV-1感染予防法の開発-2 (H25年度) ヒト化マウスを用いた高力価HTLV-IGの有効性の検討 HTLV-1感染モデル FACS解析 ATL細胞株/ATL細胞 HTLV1キャリア細胞 ヒトCD34+細胞 ヒト化マウス ATL発症 核酸増幅試験 ヒトT細胞分化 NOD/SCID/JAK3 HTLV-1感染予防モデルの開発 ヒトCD34+細胞 ATL細胞株/ATL細胞 HTLV1キャリア細胞 ？？？？ Western Blotting ヒト化マウス NOD/SCID/JAK3 ヒトT細胞分化 HTLV IG HTLV-IG 接種容量・接種法 ヒトCD45細胞 HTLV-1感染モデル 2 101 1.55 2.65 101 102 hCD45 ヒト化マウス 10 4 102 CD3 CD4 1 month 2 103 42.1 100 104 100 0.156 101 102 CD3 103 104 0.0354 2 99.9 10 0.0236 101 4 102 CD3 0.325 104 2.6 2.92% 103 10 103 2 101 95.6 1.62 101 102 CD3 103 9.97 100 10 32.7% 1.12 101 4 102 CD3 10 103 104 0.857 8.3% 60.8 100 6.77 101 102 CD3 103 104 2 100 4 4.48 26.7 33.8% 103 101 101 10 7.36 103 CD8 2 95.9 100 104 22.5 103 CD4 2 0.058% 100 CD8 CD4 2 month 102 hCD45 0.0118 100 2.1 4 100 10 4 104 2.60% 100 3 month 103 0.675 100 ATL発症 10 0.0472 101 101 10 51.8 101 103 CD8a 99.5 103 10 0 101 100 ATL細胞株/ATL細胞 HTLV1キャリア細胞 10 0.12% 2 10 21.2 100 0.0118 57.8 101 100 104 101 10 2 ヒトT細胞 0.484 103 10 103 4 100 ヒト血液細胞分化 10 4 103 101 100 NOGマウス、NSGマウス、NSJマウス 10 0.969 CD19 mCD45 mCD45 10 26 103 100 Intra-Hepatic Transplantation Intra-Bone Marrow Transplantation Intravenous Transplantation 10 0.0552 103 1 month ヒト臍帯血由来CD34+細胞 95.8 ヒトB細胞 4 CD3 10 4 10 2 101 69.9 100 21.9 101 102 CD3 103 104 100 63 100 5.8 101 102 CD45 103 104 MT-2移植ヒト化NOGマウス 12 weeks after MT-2 inoculation Control MT-2 Liv Liv Spl Spl Spleen Liver 1.8 1.6 0.6 1.4 0.5 1.2 Weight (g) Weight (g) P<0.03 0.7 0.4 0.3 1 0.8 0.6 0.2 0.4 0.1 0.2 0 0 Control MT-2 (n=3) (n=4) Control MT-2 (n=3) (n=4) 12 weeks after MT-2 inoculation 抗HTLV-1免疫グロブリンの投与実験 Human CB CD34+ 1x105 TP (i.v) MT-2 (Mytomycin+) FACS解析 Q-PCR HTLV-1+PBMC FACS解析 Q-PCR HTLV-1 IgG or 抗gp46(LAT-27：1mg i.p) • • • • • • IgG精製度 IgG濃度 接種ルート 接種回数 接種時期 接種間隔 Lat-27の場合、24hrs, -5hrsの２回接 種で抑制可能。1日 後では効果なし。 HAM血清IgGは1日後 でも抑制効果あり。 HTLV-1 IgG or 抗gp46(LAT-27：1mg i.p) Human CB CD34+ 1x105 TP (i.v) 検討項目 1 lotにつき： 1mg/i.p とする と、2回投与で 2mg, N=6 (N=3 X2 exp)で12mg 必要。 本研究の意義と期待される成果・厚生行政への貢献 新規感染予防法 ヒト臨床へのTRS HTLV1感染について、HTLV-IGの感染阻止に関する有効性を示す ヒト化マウスを用いる事で、ヒト細胞の実際の生体内での感染 予防を確認でき、ヒトへの外挿が可能となる 新薬開発/国際貢献 HTLV-1抗体陽性血漿は日本でしか入手できないため、高品質の HTLV-IGは日本発で開発・製造可能。世界的には数千万人のキャ リアがおり、世界的な規模での利用が期待されている。 厚生行政 HTLVワクチン（H23年度 厚生労働科学研究費 長谷川秀樹主任 研究者）が成功すれば、HTLV-IG+Vaccineとの組み合わせでHBV の母子感染予防のような感染予防策が実施可能となり、新規感染 は抑制可能となる。 献血の有効利用 研究班 代表 水上 分担 浜口 大隈 山口 佐竹 田所 協力 野島 松本 貴重な献血血液の有効利用に繋がる 拓郎 功 和 一成 正博 憲治 清子 千恵子 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 西東京日本赤十字血液センター 日本赤十字中央血液研究所 国立感染症研究所 血液・安全性研究部 日本赤十字中央血液研究所 第４室室長 部長 第３室室長 客員研究員 研究員 抗HTLV-1ヒト免疫グロブリン によるHTLV-1感染予防法の開発-3 (H26年度) ヒト化マウスを用いた高力価HTLV-IGの有効性の検討 HTLV-1母乳感染モデルの確立 ？？？？ Intrahepatic TP ヒトCD34+細胞 FACS解析 核酸増幅検査 Western Blotting 新生児マウス ATL細胞株 ATL細胞 HTLV1キャリア細胞 NOD/SCID/JAK3 ミルク HTLV IG HTLV-IG HTLV-IG製剤開発へ向けた研究 • • • • • HTLV-IGの性状・用法・容量の設定 抗HTLV-1ヒト免疫グロブリンの認識抗原の同定 製造工程中のウイルス混入リスク解析（核酸増幅試験） 製造工程中のウイルスクリアランス 国家検定に準じた品質管理試験（安全性・物理化学試験）の実施
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