このページは浜松ホトニクス株式会社によるＰＲ記事です。 １分子蛍光イメージングに最適なカメラとは 伊東克秀 （浜松ホトニクス株式会社 システム事業部） １．はじめに 先日ある会議に参加した時に EM-CCD、sCMOS から ３．カメラによる１分子観察のおさらい （１）１分子の画像例 II+EB-CCD まで、さまざまなカメラでの１分子観察の発表が 蛍光サンプルは「EGFP」をガラススライドに固定したもの あった。１分子は観察できる総光子数に限りがあるため「単位 を使用した（図１） 。１分子はある一定の輝度で光りその後に退 時間の光子数」と「観察時間」とがトレードオフにある。観察 色する。１分子であり多分子でないことは退色の回数と輝度か 時間が短くても良ければ励起光強度を上げることで大抵のカメ ら判別した（図２） 。 ラで観察できることは容易に想像できる。しかし観察時間を長 TIRF 照明 くしたい場合に、１分子および背景光の光子数や退色時間など、 励起光：45.0 W/cm2 最適なカメラを選択するのに必要となる具体的データや知見が 対物：油浸 100x NA1.5 カメラ：ORCA-Flash4.0 無い。 露光時間：33ms 本稿では「１分子蛍光イメージングに最適なカメラとは？」 スケール：1μm という観点でカメラメーカーの技術者である筆者が実際に実験 を行いそこで得た知見を筆者の視線で書かせてもらうことにし 図１．EGFP の１分子の画像例（60x60 画素） た。 紙面、 期限の関係から詳細についてはかなり省かせて戴く。 これらの実験は大阪大学産業科学研究所永井研究室の全反射 画像取得開始後、約 0.5 秒 蛍光顕微鏡をお借りし、新井由之先生のご協力を戴いたのでこ 後から励起光を照射。 こで感謝の意を表したい。尚、この内容は 2013 年 8 月の「少 数性生物学のトレーニングコース」の実習内容の一部ともなっ ている。 ２．実験装置（画素サイズとレンズ倍率） 図２．１分子の退色例（励起光：45.0 W/cm2） 実験は科学計測用 CMOS カメラ Flash4.0、 EM-CCD カメラ ImagEM、II+Flash4.0 の 3 種類の代表的なカメラで行った。 （２）１分子の光子数と時間的変化 １分子観察の中でも最も良く行われる輝点のトラッキングにお １分子観察において異なる励起光強度に対するカメラへの入 いては、フィッティングを用いて光学限界以下の位置精度での 射光子数を測定した（表２） 。励起光強度 45.0 W/cm2 の時に１ 検出が行われることが多い。この実験においてもフィッティン 分子の光子数は約 330 フォトン/33ms となる。これらの光子が グを考慮して、あえて１分子が数画素に広がるように、そして 直径 4～5 画素の円状に分布するため、最も光子数の多い画素 各カメラの対物上での画素サイズが揃うようにリレーレンズを においても約 27 フォトン/33ms と暗い。この時の背景光は１ 選択した（表１） 。 画素あたり約 3 フォトン/33ms から時間的に徐々に減っていく。 表２．励起光強度と１分子の光子数 表１．カメラとレンズ倍率 （３）１分子の退色時間 個々の１分子により退色時間がそれぞれ違うこともおさらい しておく必要がある。数百個の分子に対する退色時間の平均、 すなわち平均退色時間を、異なる励起光強度に対して測定した （図３） 。励起光が強ければ平均退色時間は速くなる。 ＰＲ記事 精度、扱い易さ、コスト等の指標を含めて総合的に判断すべき である。 今回の実験から観察時間を長くするという指標のみに着目し た場合には II+Flash4.0 が良いことが判った。 観察時間を短くしたい例としては、超解像顕微鏡の PALM、 STORM がある。これらは強い励起光を使いフィッティングも 行うが、その場合は EXCESS ノイズの無い Flash4.0 が EM-CCD よりも良いと言われている（文献：リンク） 。また別 図３．励起光強度による平均退色時間の例 の例としては、１分子方式の DNA シーケンサがあるが、この 方式ではフィッティングを行わず１画素以内に１分子を結像さ ４．カメラによる S/N 測定実験 せるため、こちらも Flash4.0 が適していると考えられる。 １分子がどのくらい認識できるかという指標をS/N で定義し て各カメラの比較を行った（図４） 。S/N は数ピクセルに広がっ ６．新製品の紹介 た１分子の輝度分布の輝度積分値から、近傍の背景光部分の同 （１）科学計測用 CMOS カメラ ORCA-Flash4.0 V2 じ面積の輝度積分値を除き、背景光部分の標準偏差で割った値 科学計測用 CMOS カメラ ORCA-Flash4.0 において V2 モ とした。148.3 W/cm2 では退色がわずか数フレームであり１分 デルが発売された。 V2 モデルの特徴はスロースキャンモードの 子か多分子かの判別が困難なためデータから除外した。１分子 搭載による更なる低ノイズ（0.9 electrons）が実現されたこと トラッキングではその退色時間および画像の見え方から、45.0 である。扱い易さやコストも含めほとんどの蛍光イメージング W/cm2 前後での励起光での観察が行われていると予想される。 に最適なカメラと考えている。 ImagEM には 1 分子観察に適したフォトンイメージングモー （２）EM-CCD カメラ ImagEM X2 ドという機能もあるが今回は使用していない。 EM-CCD カメラ ImagEM シリーズにおいても X2 モデルが発 今回の結果から、II+Flash4.0 が他のカメラに比べ励起光が 売された。X2 の特徴は従来の 2 倍の 70 Hz の高フレームレー 弱い場合でも S/N の良いこと、すなわち観察時間をより長くで トと更なる CIC ノイズの低減にある。ORCA-Flash4.0 で感度 きることが判った。しかし、この結果はあくまでも観察時間を が足りない場合にはこちらがお勧めとなる。 長くできるという指標に対するものだけであり、カメラの選択 にはそれ以外に位置精度、扱い易さ、コストなどの指標も必要 になる。 ORCA-Flash4.0 V2 ImagEM X2 図５．新製品の紹介 （３）エジュケーションサイト 超解像顕微鏡やライトシート顕微鏡などのアプリケーション に関するテクニックや文献等をまとめたエジュケーションサイ 図４．各カメラにおける励起光強度と S/N ト（英語）を新たに開設したのでぜひご覧いただきたい。 ５．まとめ 「１分子蛍光イメージングに最適なカメラとは？」という質 問に対しては、 「何を測定したかによって変わる。 」という答え になる。さらに観察時間の長さ、フィティングを行うか、位置 浜松ホトニクス株式会社 システム営業推進部 TEL : 053-431-0150 E-Mail: [email protected]
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