成果概要 H25-新興-若手

(終了用) 平成 25 年度新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究事業『成果概要』
研究課題：パイエル板指向性分子を利用した経口ワクチンの開発課題番号：H23-新興-若手-024 予定期間 : H23 年度から H25 年度まで研究代表者：渡利彰浩所属研究機関：大阪大学所属部局：大学院薬学研究科職名：助教年次別研究費(交付決定額)： 1 年目 4,160,000 円 2 年目 4,030,000 円 3 年目 3,627,000 円計 11,817,000 円 Ⅰ．研究の意義 (1) 経口ワクチンは粘膜免疫と全身系の体液性・細胞性免疫の両方を賦活化する作用をもち、非侵
襲的に投与可能で、安全性も兼ね備えていることから理想的なワクチンであるにも関わらず、
開発が著しく立ち遅れている。
(2) 経口ワクチンに最適な消化酵素による分解回避特性を有する抗原送達法が存在しない。
(3) 有効な経口ワクチンを開発するためには、消化酵素による分解を回避しつつ腸管粘膜免疫組織
パイエル板へ効率よく抗原を送達する方法が求められている。
Ⅱ．研究の目的、期待される成果 (1) 腸管粘膜免疫組織パイエル板に claudin-4 (CL-4)が高発現していることに着目し、独自の CL-4
指向性分子を有効活用し、初めてのパイエル板指向性経口ワクチンの開発を目的とする。
(2) 本研究で開発を試みる経口ワクチンは、粘膜免疫のみならず全身系体液性・細胞性免疫をも賦
活化することから、粘膜面から感染し、生体に侵入するウイルスなどの感染症において高い予
防効果が期待できる。
(3) 経口によるワクチン接種は、非侵襲的な投与方法であり、粘膜・全身系免疫賦活化作用が可能
な経鼻ワクチンと比べても高い安全性が期待できる。
(4) 経口ワクチン開発の際に問題となる消化酵素による分解に対し、耐性をもった CL-4 指向性分
子を利用するため、効率よく抗原を腸管粘膜免疫組織へ送達できる。
Ⅲ．3 年間の研究成果・研究代表者（渡利彰浩） (1) 当グループが独自に開発した CL-4 binder である C-CPE を prototype として用い、高親和性
CL-4 アンタゴニスト創出のための新規 C-CPE 構造変異体ライブラリを構築した。
(2) CL-4 提示出芽バキュロウイルス等を用いた CL-4 binder スクリーニング系を利用することで、
C-CPE 構造変異体ライブラリから既存の C-CPE に比して CL-4 への結合性が高い CL-4 高結
合性 C-CPE 変異体の取得に成功した。
1 (終了用) (3) CL-4 高結合性 C-CPE 変異体とモデル抗原である卵白アルブミン（OVA）との融合タンパク
質を用いて、予備検討として経鼻投与による免疫賦活化作用を検証した結果、新規 CL-4
binder は既存の C-CPE よりも高い免疫賦活化作用およびワクチン効果を発揮させる抗原送達
能を示した。
(4) CL-4 高結合性 C-CPE 変異体を修飾したリポソームの中から CL-4 への結合性が高いリポソー
ムを選別した。また、モデル抗原 OVA を封入した C-CPE 変異体修飾リポソームを作製し、
本リポソームにおける CL-4 結合性を確認した。
・研究分担者(鈴木亮)
(1) 新規 C-CPE 構造変異体ライブラリの中から当グループが独自に確立した CL-4 binder スクリ
ーニング系を利用し、CL-4 高結合性ファージを複数取得した。
(2) CL-4 高結合性 C-CPE 変異体を修飾したリポソームを複数作製した。
(3) C-CPE 変異体を修飾したリポソームの調製方法の最適化を行い、エタノールインジェクショ
ン法、ハイドレーション法いずれの方法でも CL-4 発現細胞に効率よく結合するリポソームを
調製可能であることが明らかとなった。
(4) リポソームの長期保存安定性や抗原内封率向上を目的に、C-CPE 変異体を修飾したリポソー
ムの凍結乾燥製剤を開発した。凍結乾燥製剤開発におけるリポソーム調製法としては、ハイド
レーション法が良いことが明らかとなった。
(5) C-CPE 変異体を修飾したリポソームの経腸投与によりパイエル板に結合することを確認した。
Ⅳ．今後考えられる新たな課題 (1) モデル抗原を封入した C-CPE 修飾リポソームを利用した免疫による免疫賦活化能の評価。
(2) CL-4 高親和性 C-CPE をもとに、リポソーム修飾条件の最適化を試みることで、経口ワクチ
ンに資する CL-4 binder 修飾リポソームの作製を目指す。
(3) C-CPE 修飾リポソームの製剤化を見据えた安定性評価を行う。
(4) 臨床用の抗原を封入したリポソームを作製し、疾病抗原特異的免疫応答および感染予防効果を
評価する。 Ⅴ．行政施策への貢献の可能性 (1) 新型インフルエンザの流行でも分かるように、感染症は僅か数日間で世界中までに蔓延してし
まう状況にあるため、少子高齢社会の我が国において感染症予防法の確立に繋がる本研究は、
国民の安全保障に資すると共に健康維持・増進に貢献できる。
(2) ワクチンは免疫記憶によりわずか数回の投与で予防・治療効果が期待できることから、増加の
一途を辿るわが国の医療費削減に貢献できる。
(3) 本研究成果は、国民の健康維持・増進、完治に伴う医療費の削減、本邦製薬会社の育成、感染
症問題を抱える国々への国際貢献等、厚生労働行政に多大な貢献が期待される。
2 (終了用) Ⅵ．本研究の成果(発表論文・ガイドライン・マニュアル等) 研究代表者（渡利彰浩） (1) Li X., Saeki R., Watari A., Yagi K., Kondoh M., Tissue distribution and safety evaluation
of a claudin-targeting molecule, the C-terminal fragment of Clostridium perfringens
enterotoxin., Eur. J. Pharm. Sci. , In Press.
(2) Iida M., Suzuki H., Li X., Kakutani H., Nagase S., Doyama R., Watari A., Kondoh M. and
Yagi K., A toxicological evaluation of the C-terminal fragment of Clostridium perfringens
enterotoxin as a claudin-3/-4 binder. FASEB J., 27:895.5, 2013.
(3) Takahashi A., Kondoh M., Suzuki H., Watari A. and Yagi K., Pathological changes in
tight junctions and potential applications into therapies., Drug Discov. Today ,
17(13-14), 727-32, 2012.
(4) Suzuki H., Takahashi A., Matsushita K., Li X., Tsujino H., Watari A., Kondoh M.,
Aoyama H., Uno T. and Yagi K., Preparation of a broad-specific claudin binder by using
Clostridium perfringens enterotoxin., FASEB J., 26 851.8, 2012.
(5) Yagi K., Yamane S., Suzuki H., Watari A., Kondoh M. and Uchida H., Development of
novel claudin-4 binder and its application in mucosal vaccine., FASEB J. , 25, lb389,
2011.
(6) Takahashi A., Saito Y., Matsuhisa K., Kakamu Y., Kodaka M., Watari A., Kondoh M.
and Yagi K., Preparation of a dual claudin binder using a fragment of Clostridium
perfringens enterotoxin.. FASEB J. , 25, 623.3, 2011.
(7) Suzuki H., Kakutani H., Kondoh M., Watari A. and Yagi K., The safety of a mucosal
vaccine using the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin.,
Pharmazie , 65(10), 766-9, 2010.
(8) Suzuki H., Kondoh M., Kakutani H., Hamakubo T., Watari A., and Yagi, K.,
Development of a novel nasal vaccine using a claudin-4 binder. FASEB J ., 24, 773.4,
2010.
研究分担者（鈴木亮）
(1) Hamano N, Negishi Y, Omata D, Takahashi Y, Manandhar M, Suzuki R, Maruyama K,
Nomizu M, Aramaki Y.: Bubble liposomes and ultrasound enhance the antitumor effects of
AG73 liposomes encapsulating antitumor agents., Mol. Pharm. , 10: 774-779, 2013.
(2) Negishi Y, Hamano N, Tsunoda Y, Oda Y, Choijamts B, Endo-Takahashi Y, Omata D,
Suzuki R, Maruyama K, Nomizu M, Emoto M, Aramaki Y.: AG73-modified Bubble
liposomes for targeted ultrasound imaging of tumor neovasculature., Biomaterials , 34:
501-507, 2013.
(3) Omata D, Negishi Y, Yamamura S, Hagiwara S, Endo-Takahashi Y, Suzuki R,
Maruyama K, Nomizu M, Aramaki Y, Involvement of Ca²⁺ and ATP in enhanced gene
delivery by bubble liposomes and ultrasound exposure., Mol Pharm. 9: 1017-1023, 2012.
(4) Omata D, Negishi Y, Hagiwara S, Yamamura S, Endo-Takahashi Y, Suzuki R,
Maruyama K, Aramaki Y, Enhanced gene delivery using Bubble liposomes and ultrasound
for folate-PEG liposomes., J Drug Target. 20: 355-363, 2012.
(5) Un K, Kawakami S, Yoshida M, Higuchi Y, Suzuki R, Maruyama K, Yamashita F,
Hashida M, Efficient suppression of murine intracellular adhesion molecule-1 using
ultrasound-responsive and mannose-modified lipoplexes inhibits acute hepatic
inflammation., Hepatology. 56: 259-269, 2012.
(6) Oda Y, Suzuki R, Otake S, Nishiie N, Hirata K, Koshima R, Nomura T, Utoguchi N, Kudo N, Tachibana K, Maruyama K, Prophylactic immunization with Bubble liposomes
and ultrasound-treated dendritic cells provided a four-fold decrease in the frequency of
melanoma lung metastasis., J Control Release 160: 362-366, 2012.
3 (終了用) Ⅶ．Ⅲ(3 年間の研究成果)の概要図等研究成果（3年間）の概要図
パイエル板指向性分৕を利৷した経ઠワクチン開発のため、
① C-CPE構造変異体ライブラリからৈ親和性CL-4 binderを取得した。
② CL-4発現細胞へ特異的に結合性をંすC-CPE変異体修飾リポソームを作製した。
③ C-CPE変異体修飾リポソームのパイエル板への移ষ性を確認した。
①ৈ親和性CL-4 binderの取得
溶出
C-CPE変異体ライブラリ
(1) C-CPEをprototypeとして৷い、ৈ親和性CL-4
アンタゴニスト創出のための新規C-CPE構造変異体
ライブラリを構築した。
(2)CL-4提ં出芽バキュロウイルスを৷いたCL-4 binderスクリーニング系等を利৷することで、作製
したC-CPE構造変異体ライブラリから既存のC-CPE
にૻしてCL-4への結合性がৈいCL-4ৈ結合性
C-CPE変異体の取得に成功した。
Claudin提ંBV
感染・増幅
②ৈ親和性CL-4 binder修飾リポソームの作製
(1) CL-4ৈ結合性C-CPE変異体修飾リポソームを
複数作製し、CL-4への結合性に優れたリポソーム
を選択した。
(2) L細胞、L/CL-4細胞でのC-CPE修飾リポソーム
の結合性をFACSにより確認した結果、CL-4への
結合性が確認された。
(3) L/CL-1細胞、L/CL-4細胞でのC-CPE修飾
リポソームの結合性ૻ較から、CL-4特異的に結合
することが確認できた。
③ৈ親和性CL-4 binder修飾リポソームのパイエル板への移ষ性
C-CPE修飾リポソームのPPへの移ষ性を評価した。
その結果、Rhodamine標識したC-CPE修飾リポ
ソームの蛍光がPPで認められた。また、M細胞
を染౦した緑౦の蛍光とC-CPE修飾リポソームの
஧౦の蛍光が঳部重なっていることを確認した。
左図 Rhodamine標識C-CPE修飾リポソームを
ે੸指腸より投与し、2時間後PPを回収した。
緑౦：M細胞, ஧౦：リポソーム
4 (終了用) ●研究代表者の研究歴等・過去に所属した研究機関の履歴平成 19 年 3 月：大阪大学医学系研究科生体制御医学専攻博士課程修了（医学博士）
平成 19 年 4 月平成 21 年 8 月：大阪大学微生物病研究所発癌制御研究分野特任研究員
平成 21 年 9 月現在：大阪大学大学院薬学研究科助教
平成 23 年 12 月日本薬学会近畿支部奨励賞受賞
・主な共同研究者(又は指導を受けた研究者) 大阪大学微生物病研究所在職中は、岡田雅人教授の下、細胞のがん化メカニズムおよび原がん遺
伝子の進化的機能変化の解析を行った。大阪大学大学院薬学研究科に異動後、八木清仁教授の下、
C 型肝炎研究、近藤昌夫准教授および医薬基盤研堤康央プロジェクトリーダー（現阪大院薬教授、
医薬基盤研リーダー併任）の下、claudin binder および modulator 研究に着手した。当該申請課
題は、上述した先生に加え、丸山一雄博士（帝京大薬教授、メビオファーム株式会社取締役（リポ
ソーム製剤のベンチャー企業、現在アメリカでリポソーム製剤の臨床試験を実施中））、國澤純博士
（東京大学医科学研究所講師、粘膜免疫学の専門家）にご指導を仰ぎつつ、新規経口ワクチンの開
発を試みるものである。
・主な研究課題 (1) Claudin-4 を標的とした粘膜ワクチンの開発
(2) Claudin-4 を標的とした claudin modulator の開発
(3) Claudin-1 を標的とした C 型肝炎阻害薬の開発
(4) 肝臓に対するナノマテリアルの安全性評価
・これまでの研究実績 (1) Li X., Saeki R., Watari A., Yagi K., Kondoh M., Tissue distribution and safety evaluation
of a claudin-targeting molecule, the C-terminal fragment of Clostridium perfringens
enterotoxin., Eur. J. Pharm. Sci., In Press.
(2) Yamagishi Y., Watari A. (Corresponding author), Hayata Y., Li X., Kondoh M.,
Yoshioka Y., Tsutsumi Y., Yagi K., Acute and chronic nephrotoxicity of platinum
nanoparticles in mice., Nanoscale Res. Lett. , In Press.
(3) Iida M., Yoshida T., Watari A., Yagi K., Hamakubo T., Kondoh M., A baculoviral display
system to assay viral entry., Biol.Pharm. Bull., In Press.
(4) Li Y., Higashiyama S., Shimakage M., Kawahara K, Yutsudo M., Watari A.
(Corresponding author), Involvement of NANOG Upregulation in Malignant
Progression of Human Cells., DNA Cell Biol. , 2013, 32(3):104-10.
(5) Yamagishi Y., Watari A. (Corresponding author), Hayata Y., Li X., Kondoh M.,
Tsutsumi Y. and Yagi K., Hepatotoxicity of sub-nanosized platinum particles in mice., Die
Pharmazie, In press.
(6) Watari A. (Corresponding author), Nature of Cancer Explored from the Perspective of
the Functional Evolution of Proto-oncogenes., Yakugaku Zasshi , 132(10), 1165-70, 2012.
(7) Watari A., Yagi K. and Kondoh M., A simple reporter assay for screening claudin-4
modulators., Biochem Biophys Res Commun. , 426(4), 454-60, 2012.
5 (終了用) (8) Takahashi A., Kondoh M., Suzuki H., Watari A. and Yagi K., Pathological changes in tight
junctions and potential applications into therapies., Drug Discov. Today, 17(13-14),
727-32, 2012.
(9) Watari A., Li Y., Higashiyama S. and Yutsudo M., A Novel Proapoptotic Gene PANO
encodes a Post-translational Modulator of the Tumor Suppressor p14ARF., Exp. Cell.
Res. , 318(3), 187-95, 2012.
(10)
Li X., Kondoh M., Watari A., Hasezaki T., Isoda K., Tsutsumi Y. and Yagi K., Effect of
70-nm silica particles on the toxicity of acetaminophen, tetracycline, trazodone, and
5-aminosalicylic acid in mice., Die Pharmazie , 66(4), 282-6, 2011.
(11)
Suzuki H., Kakutani H., Kondoh M., Watari A. and Yagi K., The safety of a mucosal
vaccine using the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin., Die
Pharmazie, 65(10), 766-9, 2010.
(12)
Itoh A., Isoda K., Kondoh M., Kawase M., Watari A., Kobayashi M., Tamesada M.
and Yagi K., Hepatoprotective effect of syringic acid and vanillic acid on CCl4-induced liver
injury., Biol. Pharm. Bull. , 33(6), 983-7, 2010.
(13)
Watari A., Iwabe N., Masuda H. and Okada M., Functional transition of Pak
proto-oncogene during early evolution of metazoans., Oncogene , 29(26), 3815-26, 2010.
(14)
Saeki R., Kondoh M., Kakutani H., Matsuhisa K., Takahashi A., Suzuki H., Kakamu Y.,
Watari A. and Yagi K., A claudin-targeting molecule as an inhibitor of tumor metastasis.,
J. Pharmacol. Exp. Ther. , 334(2), 576-82, 2010.
(15)
Watari A., CapG., Encyclopedia of Cancer , Springer, 2007.
(16)
Ohba Y., Kanao Y., Morita N., Fujii E., Hohrai M., Takatsuji M., Miura D., Watari A.,
Yutsudo M., Zhao H., Yabuta N., Ito A., Kita Y. and Nojima H., Oleamide Derivatives
suppress the spontaneous metastasis by inhibiting connexin 26., Int. J. Cancer , 121,
47-54, 2007.
(17)
Watari A., Takaki K., Higashiyama S., Li Y., Satomi Y., Takao T., Tanemura A.,
Yamaguchi Y., Katayama I., Shimakage M., Miyashiro I., Takami K., Kodama K. and
Yutsudo M., Suppression of tumorigenicity, but not anchorage independence, of human
cancer cells by new candidate tumor suppressor gene CapG., Oncogene , 25(56), 7373-80,
2006.
(18)
Shimakage M., Inoue N., Ohshima K., Kawahara K., Oka T., Yasui K., Matsumoto K.,
Inoue H., Watari A., Higashiyama S. and Yutsudo M., Down-regulation of ASY/Nogo
transcription associated with progression of adult T-cell leukemia/lymphoma., Int. J.
Cancer , 119(7), 1648-1653, 2006.
(19)
渡利彰浩, 湯通堂満寿男, 不老不死への道（細胞編）化学と生物 , 42(5), 323-325, 2004.
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Qi B., Qi Y., Watari A., Yoshioka N., Inoue H., Minemoto Y., Yamashita K., Sasagawa
T. and Yutsudo M., Pro-apoptotic ASY/Nogo-B protein associates with ASYIP., J. Cell.
Physiol. ,196(2), 312-318, 2003.
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Watari A. and Yutsudo M., Multi-functional geneASY/Nogo/RTN-X/RTN4 : apoptosis,
tumor suppression, and inhibition of neuronal regeneration., Apoptosis , 8(1), 5-9, 2003.
6

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