AM-715のin vitro変異原性試験

CHEMOT
938
HERAPY
AM-715のin
入
DEC.1981
vitro変
倉
異原性試験
勉・細見
次郎
杏林製薬株式会社中央研究所
抗菌剤AM-715のin
vitroでの微生物に対する変異原性と哺乳動物細胞の染色体に対する影響を調
べ,次の結果を得た。
1)
修復試験(rec-Assay):Bacillus
subtilisの組換え修復能欠損株(Rec-)と
AM-715の62.5,125,250μg/mlで
500,1000μg/mlで
2)
の発育阻止帯の差は約5mmで
の10mmに
正常株(Rec+)に
対する
あり,対照のnalidixic acidの
比べて小さかった。
復帰変異誘発試験(AMES
test):Salmonella
0.001∼0.1μg/プレートのAM-715で
typhimurium
TA系
列やE.cotiの
検定菌株を
処理しても復帰変異数の増加はみられなかった。また,ラ
ット
肝ミクロゾーム分画(S-9)を用いた代謝活性化法においても影響はみられなかった。
3)
チャイニーズ・ハムスター肺線維芽細胞(CHL細
して,AM-715の100μg/ml添
の抑制,同
胞)での細胞毒性試験:CHL細
加,24時間培養では抑制はなく,300μg/ml添
じく48時間培養で75%の
抑制がみられた。
増殖抑制のみられた300μg/ml添
加,48時間培養でも,顕微鏡観察における形態的な細胞の異常は
認められなかった。
4) CHL細
胞での染色体異常誘発試験:直接法,代
200μg/ml,48時
5)姉
謝活性化法のいずれにおいても,AM-715を
間接触させても染色体異常出現頻度の増加はみられなかった。
妹染色分体交換(SCE)誘
させてもSCEの
ト血液細胞に対し,AM-715を25μg/ml,24時
間接触
増加はみられなかった。チャイニーズ・ハムスター線維芽細胞(Don細
胞)でも同
様に,50μg/ml,24時
発試験:ヒ
間接触させてもSCEの
増加はみられなかった。
以上より,AM-715は
感受性菌であるB.subtilisのrec-Assayで
E.coliでの復帰変異を増加させることはなかった。さらにCHL細
度で増殖阻害を示したが,こ
また,ヒ
胞の増殖に対
加,24時間培養で25%
ト血液細胞のSCEを
のCHL細
弱陽性を示したが,S.typhimurium,
胞に対しては300μg/ml以上の濃
胞の形態あるいは染色体に異常をもたらすことはなかった。
増加させないことから,これら哺乳動物細胞において突然変異原性を
示すことはないものと考えられた。
緒
AM-715は
えられる。
一方 ,化学物質の発癌性のスクリーニング試験として
言
杏林製薬で開発中の抗菌剤であってnali。
dixicacid(NA)と
類似の構造を有し,グ
らびにグラム陰性菌に対して,in
ラム陽性菌な
vitroで高い抗菌活性
知られる修復試験(rec-Assay)6)や
復帰変異誘発試験
(AMEstest)7)で用いるB.subtilis,S.typhimurium,E.coli
は,い
ずれもAM-715に
対し高い感受性を示す菌であ
を有することが知られている1)。その作用は感受性菌の
り,しかも上記のごとく,その作用がDNAの
DNA生
合成を阻害するものであり2),NAと
対するものであることから,これらの感受性菌を用いた
DNAの
高次構造の形成に関与するDNAgyraseに
同様に
対す
るものであることも明らかになりつつある3)。さらにE
coli等に対する強い抗菌作用は,DNA生
合成に対する
阻害効果および菌体内への薬物の高い透過性によること
が明らかにされている2)。
他方,AM-715の
一般毒性試験では哺乳動物での安全
変異原性試験においては,AM-715の
生合成に
濃度によっては陽
性を示す可能性も考えられる。
そこで,今
回AM。715に
ついて,これら感受性菌を
用いたin vitroでの変異原性試験と哺乳動物細胞を用い
た細胞毒性試験,染色体異常誘発試験ならびに姉妹染色
分体交換(SCE)誘
発試験を行ない,in
vitroでの選択毒
性は高く4,5),このことから哺乳動物細胞に対する毒性
性および変異原性について検討したので,その結果を報
は低いものと推察された。この高い選択毒性は本薬物の
告する。
細胞内への透過性の差に起因しているのではないかと考
939
CHEMOTHERAPY
VOL.29 S-4
培養した。細胞の増殖試験については,新鮮な上記の培
I. 実験材料および方法
地を2ml入
1. 検体
れた培養試験管に4×104個
播種して培養を開始し、2日
AM-715は
塩酸塩を滅菌蒸留水に溶かし,NAは0.1N
40μlを加えた(AM-715の
2. 修復試験(rec-Assay)
KADAら6)に
添加後24時間日,48時
よって確立されたrec-Assayを
すなわち,B.subtitisの
るH17株(Rec+)と
2 broth(肉
行なった。
一種で組換え修復能が正常であ
それが欠損したM45株(Rec-)をB-
汁,ポ
リペプトン各1%,NaCl
それぞれ移植し,36℃
で17時
じめ用意したbroth寒
に
間振盪培養した。あらか
用い両株の培養液を塗布し,そ
目に種々の濃度の検体溶液
らに培養を続け,検体溶液
間図にtrypsinを
用いて細胞を
剥がし,細胞浮遊液とした。死細胞の判定には0.4%
erythrosine B溶液を等量加え,顕微鏡下で染色細胞数
を計測し,同時に非染色性の生細胞の数を計測した。
0.5%)中
天培地に,0.1mlメ
胞を
最終濃度:50,100,200,300
μg/ml)。よく混和した後,さ
水酸化ナトリウムに溶かして試験に用いた。
のCHL細
スピペットを
の頂点をおおうように検
細胞の形態観察試験では,8チ
ャンバー・スライドグ
ラス(ラブテック)の各穴に培地0.3mlを
0.6×104個のCHL細
入れ,こ
れに
胞を播種して培養した。2日
目に
種々の濃度の検体溶液10∼20μlを
加え(AM-715の
最
体溶液を浸み込ませた円型濾紙を置いた。検出感度を高
終濃度:50,100,200,300μg/ml),よ
めるために,4℃
らに培養した。検体溶液添加後24時間目および48時間目
で培養後,さ
らに37℃
で一夜培養し
く混和してからさ
た。濾紙端を起点として生育阻止帯の長さを測定し,両
に中性ホルマリンで固定し,GIEMSA染
菌株での阻止帯の長さを比較した。
鏡下で細胞の形態異常の有無を観察した。
3. 復帰変異誘発試験(AMES
test)
ラット肝ミクロゾーム分画(S-9)は
た。体重約120gのSD系
60mg/kg,4日
5. C肌
次のようにして得
雄ラットにphenobarbitalを
間腹腔内注射し,同
naphthoflavoneを80mg/kg腹
genateし,そ
量の0.15
M
KClを
用いてhomo-
MgClを
よび
加えたものをS-9mix(S-9を16.5%含
有)と
し
た。
AMEstestは
矢作8)の方法に準じて行なった。すなわ
TA系
列のテスト菌株(histidme
1538)とE.eoli
一夜培養した
WP2uvr
A-を
mlを加えて36℃
栄養broth(Difco)中
間振盪培養した(前
による代謝活性化法の場合は,リ
0.5mに
で
ン酸緩
よびあらかじめ培養した菌液0.1
で20分
培養)。S-9
ン酸緩衝液をS-9mix
histidineお
ルセミド(0.2μg/ml)で約2時間処理
細胞を剥がし,細胞浮遊液を遠心
した(1000rpm,5分)。
よび0.05mM
最小培地Eの
biotinを
寒天平板上に流し込み ,37℃
2日間培養した。出現したhistidine非
異体)の
コロニー数を計測した。
の細胞毒性試験
胞は,10%仔
培地に播種し,CO2(5%)イ
られた細胞浮遊液を清浄なスライドグラス上に
倍)で中期分裂像200個
色を施した。顕微鏡下(400
を観察し,染色体異常の出現頻
度を計測した。
5-2)代
謝活性化法
前述のS-9を用い,S-9を30%含
を加え,37℃
帰変
牛血清を含むイーグルMEM
ンキュベーター(37℃)で
液で
タノール・酢酸混液(3:1)を
用いて静かに固定した。ついで上記の混液で細胞を3回
度:50,100,200μg/ml)お
で
要求株(復
4. チャイニーズ・ハムスター肺線維芽細胞(CHL細
CHL細
沈査細胞を7.5mMKCl溶
間処理後,メ
有するS-9mixを
つ小試験管に入れ,
これに種々の濃度の検体溶液100μl(AM-715の
含むソフトァガーを加えてすばやく混和し,VOGELBONNERの
最終濃度:50,100,
後,0.25%trypsinで
調製した。そのS-9mixを0.5mlず
代えて同様に前培養した。
その後,0.05mM
加え(AM-715の
目に種々の濃度
く混和してからさらに培養した。検体溶
滴下し,風乾後GIEMSA染
。小試験管に検体希釈液0.1ml,リ
衝液(pH7.4)0.5m1お
シャレーに2×104個
た。すなわち,コ
洗い,得
要求性変異株,TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA
胞)で
200μg/ml),よ
37℃,15分
ち,まずS.typhimurium
入れた直径6cmの
胞を播種して培養した。3日
液添加後24時間目および48時間目に染色体標本を作製し
間遠心した上清をS-9
とした。S-9にNADPH,NADH,G-6-P,KClお
のCHL細
の検体溶液100μgを
ットを屠殺し,肝を摘出し
の9,000×g,10分
細胞での染色体異常誘発試験9)
5-1)直接法
培地5mlを
目に β-
腔内注射した。phenob-
arbitalの最終投与の翌日,ラ
て一定量を取り,3倍
時に3日
色を施し,顕微
よび6×105個
最終濃
のCHL細
胞
でゆるやかに振猛しながら培養した。培
養1時間後に,新鮮な培地にて細胞を2回洗浄し,検体
を含まない培地に浮遊させ,直
さらに37℃
径6cmの
シャレーにて
で17時間培養した。その後5-1)の
方法で
染色体標本を作製し,顕微鏡下で染色体異常の出現頻度
を計測した。
6. 姉妹染色分体交換(SCE)誘
発試験
ヒト血液細胞およびチャイニーズ・ハムスター線維芽
CHEMOTHERAPY
940
細胞(Don細
胞)を
6-1)ヒ
用いて,SCE誘
発試験を行なった。
Fig.
1
1981
rec- Assay of AM- 715 and nalidixic
acid
ト血液細胞での試験
10%仔
牛血滴を含むイーグルMEM培
度の検体溶液(AM-715の
地に各種の濃
最終濃度:25,125,25μg/ml)
と5-bromo-2'-deoxyulidine(BUdR,2μg/ml)を
小バイアル瓶に5mlず
よびphytohemagglutinin0.1
無菌的に加え,密
その後5-1)の
加え,
つ入れた。これに成人男子から
採血した静脈血0.1mlお
mlを
DEC.
栓して37℃
で72時問培養した。
方法で染色体標本を作製し,GOTOら10)の
方法に準じてSCEの
分別染色を施した。すなわち,染
色体標本をHoechst33258水
溶液(5μg/ml)に
分間浸した。軽く水洗した後,染
ライドグラス上にMcIlvaint緩
ーグラスをかけ
,BLBラ
室温で15
色体標本の付着したス
衝液を数滴落した。カバ
ンプ(東芝FL20E)を
約10cm
上方から30分間照射した。再び水洗してからGIEMSA染
色を施し,顕
微鏡下で血液細胞の全核数についてSCE
の出現頻度を計測した。
6-2)Don細
10%牛
M45-H17------
胞での試験
胎児血清を含むハムF12培
養試験管に3×104個
日目にthymidineを
のDon細
含まぬハムF12培
同時にBUdR(5μg/ml)お
え(AM-715の
地を3ml入
れた培
胞を播種して培養し,2
よび各種濃度の検体溶液を加
で
方法でSCEの
下でNo.1染
色体についてSCEの
方法で染色体標本を作
製し,6-1)の
は,500,1000μg/mlの
濃度でH17株
AM-715は
検定菌に対して致死効果が強く,62.5,125,
各濃度において生じた発育阻止帯の両株の
差はいずれも約5mmで
あった。
2. 復帰変異誘発試験(AMES test)
AM-715を0.5μg/プ
分別染色を施した。顕微鏡
出現頻度を計測した。
とM45株
あった。
250μg/mの
地に切り換えた。
最終濃度:5,10,25,50μg/ml),37℃
24時間培養した。その後5-1)の
NAで
の発育阻止帯の差が共に約10mmで
レート以上添加すると,各検定
菌はいずれも著しく発育が阻害され,試験出来なかった。
そこで0.001∼0.1μg/プレートの各濃度における各検定
II. 実験結果
菌の復帰変異数を測定した。測定結果はTable 1に示し
1. 修復試験(rec-Assay)
H17株(Rec+)お
AM-715お
よびNAの
た。S.typhimurium
よびM45株(Rec-)の
発育阻止帯と
濃度との関係をFig.1に
Table
1
Revertant
示した。
mutation
a) indicates
列のいずれの検定菌株におい
検定菌株においても,AM-715に
よると考えられる復帰変異数の増加は認められなかった。
of AM- 715
metabolic
TA系
ても,またEcoliの
in S. typhimurium
activation
by
S- 9 mix.
and E. coli
VOL.
29
また,S-9
5-4
CHEMO
THE
mixを添加する代謝活性化法においても,
RAPY
Fig. 2
復帰変異数の増加はみられなかった。
3,CHL細
941
Cytotoxicity
of AM-715
in Chinese
hamster cells (CHL cells)
胞での細胞毒性試験
培地中にAM-715を50,100,200お
よび300μg/mlの
各濃度になるように添加してCHL細
胞を24時間,48時
間培養した時の生存細胞数を溶媒対照でのそれと対比し
てFig. 2に示した。
AM-715の
濃度が高い場合,あるいは添加後の培養時
間が長くなると,生存細胞数が減少し,増殖抑制がみら
れた。すなわち,100μg/mlの24時
間培養では溶媒対照
と差がなかったが,同濃度で48時間培養すると,明らか
に生存細胞数が減少した。300μg/mlの48時
間培養では
75%の増殖抑制がみられた。
また,チャンバー・スライドグラスを用いて培養した
後のCHL細
胞の形態的な変化は,各濃度のいずれの培
養時間においても,ほとんどみられなかった。すなわち,
生存細胞数を顕著に減少させたAM-715の300μg/ml,
48時間培養においても,形態的な変化は認められなかっ
た。
4.CHL細
胞での染色体異常膀発試験
培地中にAM-715を50,100お
度になるよう添加してCHL細
よび200μg/mlの
胞を24時間,48時
各濃
間培養
した時の染色体を観察した(直接法)。結果はTable
2
また,S-9mixを
に示した。
AM-715の
意な差はなかった(Photo
各濃度のいずれの培養時間においても,染
色体異常の出現頻度は非常に低く,溶媒対照と比べて有
1)。
添加する代謝活性化法においても,
染色体異常の出現頻度の増加はみられなかった。
5.姉
妹染色分体交換(SCE)誘
培地中にAM-715を
あるいはDon細
発試験
一定濃度添加してヒト血液細胞
胞を培養した時のSCEの
測定結果を
Table 3に示した。
ヒト血液細胞では,AM-715の2.5,
いずれの濃度においても,溶
12.5, 25μg/mlの
媒対照に比べSCEの
出現
に差はみられなかった。
また,Don細
胞でも,AM-715の5,
のいずれの濃度においても,No.1染
10, 25, 50μg/ml
色体のSCE数
が溶
媒対照に比べて有意に増加することはなかった(Photo
2,3)。
III.考
AMES
察
ら7)が微生物の突然変異を利用し,化学物質の
変異原性を検索する方法を確立して以来,多
くの化合物
の変異原性が試験され,発癌物質として知られるものの
多くが変異原性物質であることが明らかにされた。そし
て化学物質の発癌性の短期スクリーニング試験としての
変異原性試験が重要視されるに至り,各種の試験法が開
発された。
Photo 1
そこで,AM-715の
変異原性を検索する試験の一環と
942
CHEMOTHERAPY
Table
2
1) Human
3
して,rec-Assay,AMES
metabolic
Sister chromatid
Chinese hamster
blood
by S- 9 mix . for
exchanges of AM- 715 in human
cells (Don cells)
1 hour
blood
cells and
2) Don cells
胞での細胞毒性,
染色体異常の誘発能,ヒ
ト血液細胞やDon細
SCEの
vitroで検討した。
AM-715は
activation
cells
test,CHL細
誘発能についてin
1981
Chromosomal
aberration
test of AM- 715 in
Chinese hamster cells (CHL cells)
* indicates
Table
DEC.
哺乳動物に対する毒性が低く,感
胞での
受性菌に
予想された。しかしこのことが変異原性と直接結びつく
ものではないと考えられる。
一方
,AMES
testでもAM-715に
を用いるためMIC値
感受性を示す検定菌
以下の極めて低い濃度での検討を
対して選択的に抗菌作用を示すという特徴を有する抗菌
行なった。その結果,いずれの検定菌株においても復帰
剤であり,そ
変異数の増加はみられなかった。
害で2),そ
の抗菌作用の作用機構はDNAの
の作用点はDNA
gyraseに
と考えられている3)。また,AM-715類
生合成阻
対するものである
似の構造を有し,
以上の結果から,感受性菌を用いた試験においてAM715の変異原性を検索することより,むしろ哺乳動物細
同様な作用機構により抗菌作用を示すNAはKADAら6)
胞における細胞毒性作用あるいは染色体に対する作用を
によりrec-Assayに
検討することに重点を置くべきであると考え,以後の試
おいて陽性であることが報告されて
いる。本実験でも,NAの500μg/mlお
よび1000μg/ml
においてはH17株(Rec+)とM45株(Rec-)と
10mmの
発育阻止帯の差が生じ,明
と認められたが,AM-715の62.5∼250μg/mlに
はむしろ両株の阻止帯の差は約5mmと
rec-Assayは,本
来被検物質のDNA障
索する試験である。NAやAM-715の
に対しDNAの
の間に約
らかに陽性である
おいて
小さかった。
害誘発能を検
ような感受性菌
生合成阻害作用を有するものにおいては,
感受性菌を用いたrec-Assayで
は陽性を示すことが充分
験を実施した。
その結果,AM-715は
てCHL細
微生物に対する抗菌作用に比べ
胞に対する毒性が低く,300μg/mlで48時
間
培養してもその増殖は抑制したが,細胞の形態的な異常
を起さなかった。CHL細
胞は染色体数が25本の安定し
た核型を示し,自然発生的な染色体異常の出現率が0.9%
と低い11)。この細胞を用い,AM-715を200μg/ml添
加
して培養したが,直接法においても代謝活性化法におい
ても染色体異常の出現を誘発する作用はみられなかった。
VOL.
Photo
29
CHEMOTHERAPY
8-4
Photo
2
また,ヒ
943
ト血液細胞やDon細
試験においてもAM-715の
試験におけるSCEの
胞を用いたSCE誘
発
activity
影響を検討した。SCE誘
発
Antimicr.
出現は染色体に対する障害の強さ
2)
照で6.1であり,LATT
胞当りのSCE数
これに対しAM-715の25μg/mlを24時
SCEの増加はみられず,また,Don細
間接触させても
胞でも50μg/ml
接触させても全く影響がなかった。
すなわち,AM-715は
感受性菌に対してのみ選択的に
ITO,
Mode
H.
SHUNGU,
E.
FISCH
of
L.
BLAND,
J.
R.
B.
HUBER:
absorbed
synthetic
compound
bacterial
infections.
The
4) 入倉
12th
相島
博,
AM-715の
5) 入倉
勉,
杉本
KADA,
T.;
K.
土屋
勉,
剛,
chemical
賀田
Italy,
July
杉本
勉,
棚瀬裕
マウスおよ
dye
7)
mutagens
detected.
AMES,
B.
proved
N.;
Natl.
F.
test
of
Acad.
Sci.
SADAIE:
procedures
phloxine,
Res.
LEE
&
system
mutagens
USA
土屋
剛:
E.
for
and
70:
for
1981
vitro
and
screening
a mutagenic
16:
W.
In
782•`786,
165•`174,
DURSTON:
the
detection
carcinogens.
red
1972
A
imand
Proc.
1973
環境中の発癌物質を微生物を使ってス
クリーニングする実験法について。蛋白質,
酵素20:
AM-
ラットにおける慢性
29 (S-4): 829∼848,
and
D.
博,
& Y.
Mutation
bacterial
29 (S-4): 766∼784,
相島
rec-assay
8) 矢作多貴江:
1) ITO,A.; K . HIRAI, M. INOUE,H. KoGA, S. Suzue,
T. IPIKURA& S. MITSUHASHI:
In vitro antibacterial
of
Con-
第1報,
第4報,
TUTIKAWA
host-mediated
献
orally-
treatment
International
毒性学的研究,
毒性学的研究,
classification
文
the
PELAK,
new
Florence,
毒性試験。Chemotherapy
長尾博士,国立衛生試験所
CELOZZI,
びラットにおける急性毒性ならびにラットにおける
6)
石館博士に深甚の謝意を表明します。
&
B.
a
for
Chemotherapy,
勉,
文:
ような作用はないものと考えられた。
博士,国立ガンセンター
a
Agents
1981
715の
検定菌,培養細胞を分与頂いた国立遺伝研究所
INOUE
AM-715,
E.
MK-0366,
1981
辞
of
KOUPAL,
亜急性毒性試験。Chemotherapy
謝
action
WEISSBERGER,
おいても変異原性を示すような結果は得られておらず,
は哺乳動物細胞において突然変異原性を示す
1980
M.
Antimicr.
殖試験,骨髄細胞での染色体試験などin vivoの試験に
AM-715に
analog.
103•`108,
IRIKURA,
analog.
H.;
J.
&
of
acid
17:
preparation
GADEBUSCH,
D.
nalidixic
S. SUZUE,T.
acid
in
new
Chemoth.
MITSUHASHI:
19-24,
また,動物を用いた優性致死試験,催奇形性試験,繁
a
&
nalidixic
gress
毒性が強く,哺乳動物細胞に対しては低毒性でしかも変
異原性を示唆するような作用を示すことはなかった。
A.
Chemoth.
3)
AM-715,
Agents
K.;
S.
new
が溶媒対
12)の報告とよく一致していた。
of
HIRAI,
&
の指標となるものであると考えられている。ヒト血液細
胞での本試験においては,細
3
1178∼1189,
1975
核酸,
CHEMOTHERAPY
944
9) 石館
基:
原と毒
性4:
10)
GOTO,
K.;
Factors
sister
359,
11)
染色体異常による変異原の検出法。変異
64∼73,
S.
chromatids.
in
vitro-
1978
MAEDA,
involved
Y.
KANO&
T.
differential
Giemsa-
Chromosoma
(Berl.)
SUGIYAMA:
staining
66:
12)
of
351•`
Res.
LATT,
of
with
compounds
ODASHIMA:
on
Chinese
Chromosome
tection
hamster
test
cell
in
S.
human
C.
M.& O.
A
tion
1978
ISHIDATE,
134
DEC.
1974
Proc.
screening
for
48:
337•`354,
A.:
Sister
chemical
fluorescence
Natl.
Acad.
Muta-
1977
chromatid
chromosome
by
carcinogens.
1981
exchanges,
damage
and
Sci.
and
induction
USA
by
71:
indices
repair.
mitomycin
3162•`4166,
De-
VOL.29
CHEMOTHERAPY
S-4
THE
MUTAGENICITY
945
OF
AM- 715 IN VITRO
TSUTOMUIR1KURAand Jmo HosoMI
Central Research Laboratories, Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.
The
Assay,
1.
was
mutagenicity
AMES
test
rec-
Assay:
weaker
2.
than
AMES
or presence
3.
4.
of AM5.
ificant
on
the
with
Sister
increase
Therefore
AM-
715
mI
of
cells
Chromosomal
715
nalidixic
it
of
SCE
was
AM-
715
no
Chinese
715
of which
exchange
suggested
not
was
tested
of cultured
in
vitro
mammalian
preferentially
to
demonstrable
in
various
short-term
assays,
i. e.,
rec-
cells.
inhibit
hamster
24
the
cells
hours,
growth
on
48
mutagenicity
(S- 9) derived
for
test
S- 9 for
was
drug,
test
the
growth
for
S.
of
DNA-
repair-
deficient
bacteria
acid.
exhibited
AM-
without
chromatid
antibacterial
aberration
aberration
or
in
a new
preparation
against
100 ƒÊg/
observed
ability
of
microsomal
Cytotoxicity
at
The
that
the
715,
chromosomal
test:
of
treatment
was
of AMand
hours
was
in
on
both
that
715
had
AM-
cells):
was
not
no
growth
at
treatment
at
mutagenicity
ml.
and
of
300 ƒÊg/
and
with
Chinese
AM-
in
from
ml
for
of the
those
hamster
715.
mammalian
the
Whereas,
aberrations
different
cells
treated
inhibition
300 ƒÊg/
chromosomal
significantly
blood
cells
The
by
typhimurium
E.
coil
in
the
absence
livers.
observed
The
human
observed
rat
inhibited
cells:
were
(SCE)
(CHL
but
CHL
from
cells.
of
cells
cells
was
not
no
morphological
48
hours.
cells
untreated
(Don
treated
observed
in
change
at
200 ƒÊg/
ml
cells.
cells):
The
signi-

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