Tali® Image-Based Cytometer での細胞周期染色、データ取得および解析: 基本プロトコル細胞周期解析を行う準備として、細胞を 70％エタノールに入れて一晩固定し、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色しま 6 6 す。実験毎に、少なくとも 500 µL の細胞（最終の細胞濃度：1x 10 – 5 x 10 cells/ml）が必要となります。(例えば染 7 7 色前の細胞濃度 1x 10 – 5 x 10 cells/ml からスタートしてみてください。)が必要となります。以下は、浮遊性または接着性細胞用のプロトコルです。接着性細胞の場合は、細胞をトリプシン処理後、トリプシン反応を中和するため十分量の完全培地で処理します。それからステップ１を開始します。浮遊性細胞の場合は手順１から開始します。必要な試薬: – 氷冷した 70%エタノール – D-PBS (Ca , Mg 不含) (Gibco 14190) – Triton X-100 – RNase A (Invitrogen 12091-039, 20mg/ml stock) – Propidium Iodide (PI) (Invitrogen P3566, 1 mg/ml stock) – PI 染色溶液: 2+ – 2+ 0.1% Triton X-100 + 0.2 mg/ml RNase A + 20 µg/ml PI in DPBS 10 mL の PI 染色溶液を作製するには: 成分分量 D-PBS 10 mL Triton X-100 10 µL RNase A 100 µL PI 200 µL 細胞の固定 1. コニカルチューブに細胞を移します 2. 細胞を洗浄します a. 500 x g で５分間遠心 b. 培地を除去し、D-PBS で再懸濁 c. 500 x g で５分間遠心。 3. 氷冷した 70%エタノールで固定します a. チューブを氷上へ移す。 6 6 b. 氷冷した 70%エタノールで 1x 10 – 5 x 10 cells/ml で細胞をゆっくり再懸濁。単細胞懸濁液とするため、70%エタノールを加える際は、軽くボルテックスをかけながら、最初は非常にゆっくりと加えて（滴下）いく。細胞は単細胞懸濁液の状態で固定されることが大変重要です。固定ステップの過程で、細胞が凝集してしまう傾向があります。70％エタノールを加える際は、軽くボルテックスをかけながら、最初の 1 mL を非常にゆっくりと滴下することが、細胞の凝集を防ぐことにつながります。 c. 細胞を -20⁰C で一晩静置。これらの細胞は、染色および解析まで -20⁰C で数週間保存可能 PI で染色 4. 細胞を洗浄します a. 4⁰C 、1000 x g で５分間細胞を遠心 b. エタノールを除去し、D-PBS で細胞を再懸濁エタノール固定した細胞はペレット状になりにくいことがあります。このステップにおいて、細胞ペレットを確認することはおそらく大変難しいでしょう。細胞ペレットを吸引してしまうリスクを減らすためにも、上清を吸引除去するのではなく、チューブを反転させて上清を除去するほうが簡単かもしれません。細胞密度がとても低い場合は、このステップにおいて D-PBS + 1% BSA で細胞を再懸濁してもよいです。BSA を加えることで、細胞のペレット化が促進されます。 c. 4⁰C、 500 x g で 10 分間細胞を遠心 5. PI で染色します 6 6 a. D-PBS を除去し、PI 染色溶液で 1x 10 – 5 x 10 cells/ml に再懸濁 (推奨する最終分量：500 µL、必要であればより少ない分量でも可能) b. 室温、暗所で 30 分間インキュベート Tali® Image-Based Cytometer でのデータ取得および解析 6. 「Cell Cycle」アッセイを使用します a. Cell Cycle アイコンをタッチし、ファイルに名前をつける 7. サンプルをローディングし、ランを実行します a. 25 µL の細胞サンプルを Tali® スライドにローディング b. スライドを挿入。サンプル毎に 20 フィールドをキャプチャすることを推奨。サンプルごとにより多くのフィールドをキャプチャすることで、ノイズの少ないより正確なデータが取得可能 c. フォーカスを合わせ、ランを実行する i 8. 結果と分析：解析はデータを取得しながら、またはサンプルすべてのデータ取得後に Data タブ下で行うことができます。以下の説明では Data タブの画面を表示していますが、各サンプルのデータを取得しながら行う場合も手順は同じです。 a. 未処理サンプル（一般的な細胞周期ヒストグラム）を用いて、細胞サイズでゲートを設定。この例では、小さな細胞（細胞片）と大きな細胞（凝集体）はゲート設定で解析から除外 b. 次に各細胞周期フェーズの閾値ゲートを設定。方法は以下の３通り： i. 3 つの閾値バーのうち１つをタッチ（ヒストグラム上のグレーの垂直バー）すると、選択された閾値バーはグレーから青に変わる。ヒストグラム下部の矢印をタッチし、閾値バーを移動 ii. 3 つの閾値バーのうち１つをタッチすると、選択された閾値バーはグレーから青に変わる。閾値バーを設定したい位置にドラッグ iii. 「RFU threshold」下の数字をタッチすると、キーパッドが表示される。手動で値を入力 c. 以下の例では、Jurkat 細胞を、G2 期での停止を誘発させるためにノコダゾール濃度を増加して処理しました。RFU 閾値の設定は未処理サンプルを用いて行い、薬剤処理サンプルに対しても同様の設定を維持しています。薬剤処理によってピークが変わることがあるため、RFU 閾値はサンプルごとに多少調節が必要な可能性があります。 9. データをエクスポートします a. 生データ(csv および fcs 形式)、個々の画像、PDF レポートは USB にエクスポート可能。本機能は Data タブ下にある。細胞周期の各期にある細胞の割合の正確な推定値を得るため、細胞周期モデリングソフトウェア(MultiCycle の ModFit など)を用いた解析を推奨（特に分裂停止状態または正常ではない細胞周期ヒストグラムの場合）