ࢢࣜࣜࣥ࢝ࣉࢭࣝ 0.5mg ➨ 2 㒊㸦ࣔࢪ࣮ࣗࣝ 2㸧㸸CTD ࡢᴫせ㸦ࢧ࣐࣮ࣜ㸧 2.6 㠀⮫ᗋヨ㦂ࡢᴫせᩥཬࡧᴫせ⾲ 2.6.4 ⸆≀ືែヨ㦂ࡢᴫせᩥ ࢩ࣮࣭ࣕࢪࣕࣃࣥᰴᘧ♫ 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide CONFIDENTIAL 薬物動態試験の概要文 目次 1. まとめ ................................................................................................................................... 1 2. 分析法 ................................................................................................................................... 3 3. 吸収 ....................................................................................................................................... 4 3.1 アナグレリドの Caco-2 細胞膜透過性の検討（V00754-SPD422-IIIG） .......... 4 3.2 実験用ラット飼料からの 14C-BL-4162A（14C-アナグレリド）のバイオア ベイラビリティ（292-061） .................................................................................. 5 3.3 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び 代謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase A、B） ............................... 5 3.4 アカゲザルにおける BL-4162A（14C-アナグレリド）の薬物動態（292-063） ................................................................................................................................... 6 3.5 トキシコキネティクス（アナグレリド及び代謝物） ....................................... 7 3.5.1 懸濁液経口投与後のラットにおけるアナグレリドの血液中濃度の予 備試験（292-067） ........................................................................................... 7 3.5.2 懸濁液経口投与後のイヌにおけるアナグレリド血漿中濃度（292-059） ............................................................................................................................ 8 3.5.3 アナグレリド：CD ラット 4 週間経口（混餌）投与毒性試験における 曝露（R00074-SPD422-IIIA） ......................................................................... 8 3.5.4 アナグレリド：ビーグル犬 4 週間経口（カプセル）投与毒性試験に おける曝露（D00075-SPD422-IIIG） ............................................................. 9 3.5.5 アナグレリド：ウサギ 14 日間反復（強制経口）投与時の薬物動態試 験（L00076-SPD422-IIIA） ............................................................................. 9 3.5.6 アナグレリド：小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物 及び代謝物の曝露評価（M00251-SPD422-IIIG） ...................................... 10 3.5.7 アナグレリド：小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物 及び代謝物の曝露の追加評価（M4887M-SPD422） ................................. 10 3.5.8 KRN654：雄ラットに対する単回静脈内投与並びに単回及び反復経口 投与後の薬物動態（KRB0002）................................................................... 11 分布 ..................................................................................................................................... 13 4. 4.1 血漿タンパク結合及び組織分布 ......................................................................... 13 4.1.1 14 4.1.2 14 C-アナグレリド：アナグレリドの「非特異的」結合並びにラット、 ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合の予備的評 価（V00150-SPD422-IIIG） ........................................................................... 13 C-アナグレリド：ラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合（V00145-SPD422-IIIG） ............................................... 14 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide CONFIDENTIAL 4.1.3 RL603：RL603 の「非特異的」結合並びにラット、ウサギ、イヌ及び ヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合（V00146-SPD422-IIIG） .......... 14 4.1.4 アナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿タンパク結合率に関する検 討（V00851-SPD422-IIIG） ........................................................................... 14 4.1.5 ラットにおける 14C-BL-4162A （14C-アナグレリド）のマスバランス 及び組織分布試験（292-062） ..................................................................... 15 4.1.6 [10a-14C ]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄 及び代謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase D）...................... 15 胎盤通過試験 ......................................................................................................... 16 4.2 SPD422：ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与 した後の乳汁分泌及び胎盤通過（R4845M-SPD422、その他の試験番 号 8259362）.................................................................................................... 16 4.2.1 代謝－in vitro 及び in vivo－............................................................................................. 18 5. 5.1 アナグレリドの可能な代謝経路の推定（X00187-SPD422-IIIG） .................. 19 5.2 アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌ肝細胞を用いた in vitro 代謝の比 較（V00121-SPD422-IIIG） ................................................................................. 20 5.3 アナグレリド：発現ヒトチトクローム P450 による可能な代謝の検討 （V00183-SPD422-IIIG） ..................................................................................... 21 5.4 アナグレリド：ヒト消化管内細菌叢による代謝の検討 （V00172-SPD422-IIIG） ..................................................................................... 21 5.5 ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対するアナグレリド及びその薬理学的 活性代謝物 RL603 の作用の in vitro 探索試験（V00232-SPD422-IIIG） ....... 21 5.6 アナグレリド：ヒト肝及び腸ミクロソームを用いた 14C-アナグレリドの in vitro 代謝予備試験（V00261-SPD422-IIIG） ................................................. 22 5.7 アナグレリド：Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクションを用いた 14Cアナグレリドの in vitro 代謝予備試験（V00292-SPD422-IIIG） .................... 23 5.8 14 5.9 14 5.10 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるヒト血漿及び 尿中アナグレリドの代謝物の検討（X00281-SPD422-IIIG） .......................... 24 5.11 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるイヌ尿中アナ グレリドの代謝物の検討（D00313-SPD422-IIIG） .......................................... 24 5.12 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるラット尿中ア ナグレリドの代謝物の検討（R00312-SPD422-IIIG） ...................................... 25 5.13 [10a-14C]KRN654：単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び 代謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase D） .................................... 25 5.14 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価（V00855-SPD422） .... 30 5.15 KRN654 の代謝に関わる CYP 分子種同定試験（PK0702） ........................... 33 5.16 アナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝に関わるチトクローム P450 の誘導試験（V00852-SPD422-IIIG）.................................................................. 34 C-アナグレリド（BL-4162A）経口投与後の実験動物における尿中代謝 物プロファイル（292-060） ................................................................................ 23 C-アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌで得られた代謝物の性質に関 するクロマトグラフィー検討（X00196-SPD422-IIIG） .................................. 23 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide 5.17 CONFIDENTIAL ラット培養肝細胞を用いるアナグレリド及びその代謝物 BCH24426、 RL603 の肝 CYP450 酵素誘導能の評価（V01233M-SPD422）....................... 36 排泄 ..................................................................................................................................... 37 6. 6.1 アカゲザルにおける BL-4162A （アナグレリド）の薬物動態（292-063） ................................................................................................................................. 37 6.2 14 6.3 14 6.4 14 6.5 [10a-14C ]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び代 謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase C）............................................ 38 6.6 SPD422：ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与した 後の乳汁分泌及び胎盤通過（R4845M-SPD422）............................................. 40 C-BL-4162A（14C-アナグレリド）経口投与後の実験動物における尿中 代謝物プロファイル（292-060） ........................................................................ 37 C-アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌで得られた代謝物の性質のク ロマトグラフィー検討（X00196-SPD422-IIIG） .............................................. 38 C-アナグレリド単回経口投与後のアカゲザルにおける放射能の薬物動 態と排泄（P00228-SPD422-IIIG） ...................................................................... 38 7. 薬物動態学的相互作用 ..................................................................................................... 41 8. 他の薬物動態試験 ............................................................................................................. 41 9. 考察及び結論 ..................................................................................................................... 42 10. 9.1 吸収（トキシコキネティクス含む） ................................................................. 42 9.2 分布 ......................................................................................................................... 42 9.3 代謝 ......................................................................................................................... 42 9.4 排泄 ......................................................................................................................... 43 9.5 薬物相互作用 ......................................................................................................... 44 参考文献 ............................................................................................................................. 44 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide CONFIDENTIAL 図一覧 図 1：アナグレリドの構造 ........................................................................................................................19 図 2：動物及びヒトにおけるアナグレリドの推定代謝経路 .................................................................20 図 3：アナグレリドの代謝物 BCH24426 の構造 ....................................................................................24 図 4：動物及びヒトにおけるアナグレリドの代謝経路 .........................................................................43 表一覧 表 1：アナグレリドの吸収に関する試験一覧表 .......................................................................................4 表 2：被験化合物の Caco-2 細胞膜透過性の結果概要 .............................................................................5 表 3： 14 C-アナグレリドを単回経口（5 mg/kg[塩基相当量]）及び静脈内（0.1 mg/kg[塩基 相当量]）投与した絶食雄ラットにおける平均血漿中放射能濃度から得られた薬物 動態パラメータ ...............................................................................................................................6 表 4：トキシコキネティクス試験一覧表...................................................................................................7 表 5：混餌投与後のラットにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 ..................................................8 表 6：カプセル投与後のイヌにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 ..............................................9 表 7：反復強制経口投与後の雌ウサギにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 ............................10 表 8： 雄ラットにおけるアナグレリド及び代謝物 BCH24426、RL603 の薬物動態パラメー タ .....................................................................................................................................................12 表 9： アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の血漿タンパク結合及び組織分布試験一覧表 .........................................................................................................................................................13 表 10： 平衡透析法によるアナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿との非結合型分率 ..................15 表 11： 14C-アナグレリド （5 mg/kg[塩基相当量]）を絶食雄ラットに単回経口投与した後 の各臓器・組織における総放射能濃度......................................................................................16 表 12：アナグレリド代謝試験一覧表.......................................................................................................18 表 13： 14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラット血漿抽出 物中の放射性成分（TLC によって分離）の平均比率（及び濃度） .....................................27 表 14： 14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラット肝抽出物 中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 ............................................................28 表 15： 14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラット腎抽出物 中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 ............................................................29 表 16： 14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラットプール骨 髄中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 ........................................................30 表 17： アナグレリド（5 μM）及び BCH24426（5.3 μM）をヒト肝ミクロソームとインキュ ベーションした後のアナグレリド及び BCH24426 濃度..........................................................31 表 18： ヒト肝ミクロソーム（0.5 mg/mL）及び NADPH （1 mM）存在下にアナグレリド（4 nM、20 nM）、陽性対照化合物デキストロメトルファン及びベラパミルを 45 分間 インキュベーションした後の親化合物の残存率（%表示）...................................................31 表 19： ヒト腸管ミクロソーム（1 mg/mL）及び NADPH （1 mM）存在下にアナグレリド （2 μM） 及び陽性対照化合物ミダゾラム（2 µM）を 45 分間インキュベーション した後の親化合物の残存率（%表示） ......................................................................................31 表 20： ヒト CYP1A1 bactosome （100 pmol/mL）又は CYP1A2 bactosome（100 pmol/mL） 存在下にアナグレリド（2 μM）、BCH24426（2 μM）及びエトキシクマリン（2 µM） を 45 分間インキュベーションした後の親化合物の残存率（%表示）.................................32 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide CONFIDENTIAL 表 21： BCH24426 及び陽性対照化合物フラフィリン、α-ナフトフラボンによる CYP1A（エ トキシレゾルフィン O-脱アルキル化）の阻害.........................................................................33 表 22： ヒト肝ミクロソームにおける 20 nmol/L 及び 400 nmol/L のアナグレリドの in vitro 代謝に対する抗 CYP アイソフォーム特異的抗体の影響 ........................................................34 表 23： アナグレリド（100 ng/mL）、BCH24426 （100 ng/mL）及び RL603 （100 ng/mL） の新鮮分離したヒト肝細胞における CYP1A 誘導能 ...............................................................35 表 24： アナグレリド（100 ng/mL）、BCH24426 （100 ng/mL） 及び RL603 （100 ng/mL） の新鮮分離したヒト肝細胞における CYP3A4 誘導能 .............................................................35 表 25： オメプラゾールにより誘導された付着性凍結保存肝細胞の in vitro アナグレリド代 謝に対する影響 .............................................................................................................................36 表 26： アナグレリドの排泄試験一覧表..................................................................................................37 表 27： 14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後 48 時間の胆管カニュレ ーション処置絶食雄ラットにおける放射能の排泄率（Phase C） .........................................40 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelide CONFIDENTIAL 略語一覧 略語 定義 ADME Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion 吸収、分布、代謝、排泄 AUC Area under the plasma concentration versus time-curve from time zero to 24 hours post-dose 投与後 0 時間から 24 時間までの血漿中濃 度－時間曲線下面積 CL Clearance クリアランス Cmax Maximum Plasma Concentration 最高血漿中濃度 CYP Cytochrome P450 チトクローム P450 DMSO Dimethyl Sulfoxide ジメチルスルホキシド EROD 7-Ethoxyresorufin O-Deethylase 7-エトキシレゾルフィン O-脱エチル化 酵素 FDA Food and Drug Administration 米国食品医薬品局 GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実 施の基準 HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution ハンクス平衡塩類溶液 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)1-piperazineethanesulfonic acid 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン HPLC High Performance Liquid Chromatography 高速液体クロマトグラフィー IC50 Half Maximal Inhibitory Concentration 50%阻害濃度 LLOQ Lower Limit of Quantification 定量下限値 MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド リン酸 Rf Retention factor 保持係数 t1/2 Elimination Half-life 消失半減期 TLC Thin Layer Chromatography 薄層クロマトグラフィー Tmax Time to maximum plasma concentration 最高血漿中濃度到達時間 Vss Distribution Volume in Steady State 定常状態における分布容積 エタンスルホン酸 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 1. CONFIDENTIAL Page 1 of 44 まとめ アナグレリド塩酸塩（販売名：アグリリン®、Xagrid®；シャイアー･ファーマシューティカルズ･ グループ社）は、本態性血小板血症（ET）の治療薬としてシャイアー社が本邦での開発を進めて いる薬剤である。本書ではアナグレリド塩酸塩をアナグレリドと表記するが、本項で引用されて いる種々の試験報告書では、アナグレリドは BL-4162A、BMY26538-1、SPD422、KRN654、 SSP-001001A、Agrylin®、又は Xagrid®として記載されている。 種々の動物とヒトで一連の ADME 試験が実施された。放射性標識体を用いた初期の動物試験は GLP 規制下で実施されなかったが、トキシコキネティクス試験は GLP に準拠して実施されてい る。ADME の情報が限られる領域として、ラット、イヌ及びウサギの排泄マスバランスデータが あげられる。腸肝循環に関する詳細な試験は実施されていないが、ラットに静脈内投与した際に 糞中に排泄が認められたことや経口投与後の胆管カニュレーション処置ラットで胆汁排泄の証 拠が得られている。アナグレリドの経口投与による絶対的バイオアベイラビリティのデータは無 く、間接的な吸収量のデータのみが得られている。しかし、これらの潜在的なデータの不足は、 相当量の血漿曝露データで補足が可能である。ラット、イヌ及びウサギの正式な薬物動態データ は、レトロスペクティブな毒性試験及びトキシコキネティクス試験から得られた情報が利用可能 である。 生体試料中のアナグレリドとその主要代謝物である RL603 及び BCH24426 の液体クロマトグラ フィー・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を含む分析法が開発され、FDA 指針に従ってマウス、 ラット、ウサギ及びイヌの血漿中濃度分析法がバリデートされた。この分析法の定量下限値は 0.1 ～5 ng/mL（高濃度用では、20 又は 250 ng/mL）であった。 14 C-アナグレリドのカーボワックス（ポリエチレングリコール 300）溶液をラットに経口又は静脈 内投与（5 mg/kg[塩基相当量]）した場合の糞中放射能排泄率はそれぞれ約 50%、44%と類似する ため、糞中に排泄された物質は不十分な吸収によるものではなく胆汁排泄によるものであること が示唆される（292-062 試験）。したがって、アナグレリドの（少なくともカーボワックス溶液 中での）ラットにおける経口吸収は良好であると考えられる。このことは TC7 細胞（Caco-2 細胞 株のサブクローン）を用いた腸管側から基底膜側への透過性を評価した in vitro 試験にて、アナグ レリドの透過性がプロプラノロールやラニチジンより高いことと一致している （V00754-SPD422-IIIG 試験）。同様に、アカゲザルに 4 mg/kg（塩基相当量）をカプセルで経口 投与、又は 1 mg/kg（塩基相当量）を静脈内投与した場合の尿中の放射能排泄率は、それぞれ 54%、 73%であり、経口投与量の少なくとも 74%が吸収されたことを示す（292-063 試験）。 アナグレリド及びその代謝物である BCH24426 及び RL603 の相当量の血漿曝露がマウス、ラット 及びイヌで証明されている（M4887M-SPD422、R00812 -SPD422、R4842M -SPD422、R4843M -SPD422 及び***-601002 試験）。マウス、ラット及びイヌにおけるアナグレリドの全身曝露は 概して投与量との比例関係にあるか又は投与量との比例関係以上に増加する。反復投与時のアナ グレリドの全身曝露はラットでは高く、イヌでは同等か又は低い。BCH24426 及び RL603 の全身 曝露はラット及びイヌでは投与量との比例関係以下である。マウス、ラット及びイヌではアナグ レリドの曝露は BCH24426、RL603 より高く、BCH24426 の曝露は RL603 と同等かそれより高い。 ラットでは、アナグレリドの曝露は雌より雄が高い。アナグレリドの Tmax は概して BCH24426、 RL603 より早い。 アナグレリドの血漿タンパク結合率はそれぞれの動物種において、 ラット約 88%、 ウサギ約 75%、 イヌ約 82%、ヒト約 89%であった（V00145-SPD422 試験）。同様に代謝物である RL603 の血漿 タンパク結合率は、動物種によらずほぼ一定であり（86～91％、V00146-SPD422-IIIG 試験）、 BCH24426 のヒト血漿中の非結合分率は約 10%であった（V00851-SPD422-IIIG 試験）。14C-アナ グレリドを絶食ラットに経口投与した場合の主要組織中放射能濃度は 2 時間と 4 時間で高かった。 組織／血漿中濃度比は肝臓、腎臓のいずれも全時間で 1 を超えており、アナグレリド関連物質は 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 2 of 44 血漿よりもこれら組織に移行しやすいことが示された。しかし、骨髄では組織／血漿比は全時間 で 1 未満であった（KRB0001 試験）。14C-アナグレリドをラットに経口投与した場合、2 時間後 では肝臓、腎臓、副腎及び消化管中濃度が最も高く、次いで甲状腺及び肺中濃度が高かった。放 射能濃度が低かった組織は、眼、生殖腺、脳であった。放射能濃度は概ね全組織で血漿中濃度と 比例して減少したことから、アナグレリドとその代謝物のいずれも各組織には残留しないと考え ら れ た （ 292-062 試 験 ） 。 薬 物 関 連 物 質 は 胎 盤 バ リ ア を 通 過 す る こ と が 明 ら か と な っ た （R4845M-SPD422 試験）。 アナグレリドの代謝は、まずイミダゾリノン環におけるカルボニル基に対しα位の炭素への酸化 的攻撃から始まり BCH24426 が生成すると思われる（R00312-SPD422-IIIG、D00313-SPD422-IIIG 及び X00281-SPD422-IIIG 試験）。次いで、開環によってケトアルデヒドが生じるが、この開環体 は閉環体（BCH24426）と平衡状態にあり、閉環体の構造の方が潜在的に（熱力学的に）安定で ある。ただし、側鎖残基の消失（おそらくアミダーゼによる加水分解）によって主代謝物 RL603 が生じ、この平衡を開環体方向に引っ張ると考えられる。 ラ ッ ト と イ ヌ の 尿 中 に ヒ ト 代 謝 物 で あ る RL603 と BCH24426 が 存 在 す る こ と か ら （X00196-SPD422-IIIG 試験）、これらの動物種が代謝の観点からヒトのモデルとして適切である ことが支持される。マウスが in vivo 遺伝毒性試験においてアナグレリド及び上記 2 種のヒト代謝 物に曝露されることがレトロスペクティブなトキシコキネティクス試験によって明らかとなり、 この動物種の小核試験が妥当であることが示された（M4887M-SPD422 試験）。 種々のヒトチトクローム発現系を用いて代謝を検討した結果、CYP1A2 のみがアナグレリドを代 謝する傾向にあったが、その代謝速度は極めて遅かった（V00183-SPD422-IIIG 試験）。続いて、 ヒト肝ミクロソーム調製液と主要なチトクロームのモデル基質を用いた in vitro 試験において、 RL603 ではなくアナグレリドがモデル基質エトキシレゾルフィンに対する CYP1A2 活性を阻害す る傾向を示した（V00232-SPD422-IIIG 試験）。この阻害は、以前にアナグレリドの in vitro 代謝 の可能性を調べるために使用された濃度範囲で生じており、アナグレリドの in vitro 代謝の初期試 験において代謝が認められなかったことの原因と思われる。短時間（15 分）のプレインキュベー ション時間によってこの阻害は 18.8 μM（約 4.8 μg/mL）の濃度で約 66%に達した。 これらのヒト in vitro 試験と対照的に、Aroclor 124 で誘導したラット肝 S9（in vitro 遺伝毒性スク リーニングに使用）はアナグレリドの RL603 及び BCH24426 への広範な代謝を示し、in vitro 遺 伝毒性のスクリーニングに使用されたこの S9 インキュベーションによりアナグレリドの 2 つの ヒト代謝物に曝露されていることが再確認された（V00292-SPD422-IIIG 試験）。ヒト肝ミクロソー ム存在下で、アナグレリド（5 μM）は 45 分後には開始時点の 64.1%まで代謝された。ヒト腸ミ クロソーム存在下でのアナグレリドの代謝はほとんど認められなかった。CYP1A はアナグレリド の BCH24426 への生体内変換の主要なアイソフォームであると思われる。 ヒト CYP1A1 bactosome による代謝は極めて速かった。CYP1A2 もアナグレリドの代謝が可能であるが、この反応は遅かっ た。検討した他のチトクローム P450 bactosome はアナグレリドを BCH24426 に代謝する明らかな 証拠を示さなかった。BCH24426 をヒト CYP1A1 bactosome でインキュベーションすると更に化 合物の代謝が進んだ。CYP1A2 とインキュベーションすると BCH24426 濃度は 45 分で 54.8%に減 少した（V00855-SPD422 試験）。 14 C-アナグレリドを 50 mg/kg で強制経口投与した場合、尿中に排泄された放射能はラットでは投 与量の 26.5%、イヌでは投与量の 16.7%であり、その際の糞中排泄率はそれぞれ 79.6%と 84.0%で あった（X00196-SPD422-IIIG 試験）。より低用量を経口投与した場合（ラット：72～78 μg/kg、 イヌ：26～28 μg/kg）、尿中排泄率はラットでは 40％、イヌでは 25％と増加した（292-060 試験）。 ラットに 14C-アナグレリドを 5 mg/kg（塩基相当量）で静脈内投与すると、投与量の約 44％が糞 中に排泄され、胆汁排泄の可能性が示唆された（292-062 試験）。14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩 基相当量]）を胆管カニュレーション処置ラットに経口投与した場合、48 時間の検体採取期間中 に計 95.23%の放射性薬物関連物質が排泄された。胆汁中には 0～48 時間で平均、投与量の 20.39% 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 3 of 44 が排泄され、0～48 時間における尿中及び糞中排泄はそれぞれ 39.03%、34.72%であった（KRB0001 試験）。授乳ラットに 14C-アナグレリド（3 mg/kg[塩基相当量]）を単回経口投与した場合、薬物 関連物質が乳汁中に移行した。 血漿及び乳汁中の薬物関連物質濃度は 2 時間後にピークに達した。 乳汁中濃度／母ラット血漿中濃度比の最大値は 3.50 であった。薬物関連物質は最終サンプリング 時間である 24 時間にも乳汁中に分泌されていた。授乳ラットにおける血漿、乳汁からの薬物関 連物質の消失半減期はそれぞれ 4.61 時間、3.42 時間と類似していたが、全血は 12.5 時間とより 長時間であった（R4845M-SPD422 試験）。 アナグレリドは CYP1A2 に対する中等度の阻害活性を有するため、テオフィリンやイミプラミン 等の主にこの酵素で分解される他の同時投与薬物との相互作用を引き起こすことを考慮すべき であろう。しかし、アナグレリドの IC50 値と臨床の Cmax を比較した結果、相互作用の可能性は低 いことが明らかである。 アナグレリドは CYP1A2 に対する多少の阻害作用を有するだけでなく、それ自体、主にこの酵素 によって代謝される。したがって、この酵素のより強力な阻害剤（フルボキサミンやシプロフロ キサシンなど）や誘導剤（オメプラゾールなど）を同時投与した場合、アナグレリドのクリアラ ンスを変化させる可能性がある。しかし、患者は血小板数の減少が許容できるレベルまでアナグ レリドの用量が調整されるため、薬物動態における留意点は同時投与する薬剤であり、理論的に 懸念すべき薬剤は治療係数の狭い薬剤であろう。しかし、ボランティアに対する単回投与後のワ ルファリンやジゴキシンの薬物動態に対するアナグレリドの影響に関する臨床試験では、これら の症例における相互作用は見られていない。 2. 分析法 [4.2.2.1.1～4.2.2.1.10] 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を含むアナグレリドと主要代謝物 RL603 の生体試料中分析法（液-液抽出法）を開発し、FDA 指針に従ってラット、ウサギ及びイ ヌの血漿中濃度分析法をバリデートした。この分析法におけるアナグレリドと RL603 の定量下限 値（LLOQ）は、それぞれの動物種において、ラット 0.5 ng/mL、ウサギ 0.25 ng/mL、イヌ 0.1 ng/mL であった。この分析法は、マウス小核試験をサポートする試験以外のすべての測定に使用された。 この方法の考えられる難点は、内部標準物質（1,4-ジクロロ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,8-エタノフタ ラジン）の選択にあり、この物質はアナグレリド又は RL603 のいずれかの部分的な構造が類似し ているのみである。抽出効率や構造、物理化学的性質がより類似する分子を追跡できていない可 能性がある。 マウス小核試験をサポートする試験で使用された薬物の曝露をモニタリングする分析法は、抽出 操作を加えず、HPLC 解析前に血漿タンパクを沈殿する簡単な方法にすることによりこの問題を 解決した。構造的により類似した内部標準物質クアジノンも使用した。この分析法におけるアナ グレリドと RL603 の LLOQ は、250 ng/mL であった。 さらに、アナグレリドと 2 つの主要代謝物 RL603、BCH24426 について、血漿検体の固相抽出後 LC-MS/MS で検出する分析法を開発し、FDA 指針に準拠してラット及びイヌの血漿分析法をバリ デートした。この分析法でもクアジノンを内部標準物質として使用した。ラットの血漿（100 μL） に関して、アナグレリド、RL603 及び BCH24426 のすべての分析対象物質に対する本分析法の LLOQ は、5 ng/mL であった。検体量を一定の 50 μL とした場合、ラット血漿中の本分析法の LLOQ はアナグレリドと RL603 が 0.1 ng/mL、BCH24426 が 0.25 ng/mL であった。イヌの血漿では、検 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 4 of 44 体量を一定の 200 μL とした場合、アナグレリド、RL603 及び BCH24426 の LLOQ は 1 ng/mL で あった。 吸収 3. 表 1：アナグレリドの吸収に関する試験一覧表 動物種 用量 塩／ 塩基 試験概要 試験番号 （その他の 試験番号） In vitro Caco-2 膜透過性 V00754-SPD4 22-IIIG （7444） 強制経口 飼料中 14C-アナグレリド のアベイラビリティ 292-061 （4162-05） 経口／胃挿管 [10a-14C]アナグレリド単 回投与後の血漿プロ ファイル KRB0001 （PKC0514） 塩基 静脈内 [10a-14C]アナグレリド単 回投与後の血漿プロ ファイル 静脈内, 経口 （各種形態） 14 塩基 TC7 細胞 50 μM Long-Evans ラット 2.4 mg/kg 塩基 SD ラット 5.0 mg/kg 塩基 0.1 mg/kg 1 mg/kg 3～4 mg/kg アカゲザル 経路 U 混餌 C-アナグレリドの吸収 排泄 292-063 （4162-03） アナグレリド塩酸塩一水和物 （塩） 0.825 = 塩基 U = 投与量の表示が塩酸塩又は塩基のいずれかが報告書では不明。 3.1 アナグレリドの Caco-2 細胞膜透過性の検討（V00754-SPD422-IIIG） [4.2.2.2.1] A（腸管側）を pH6.5、B（基底膜側）を pH7.4 の条件で、37℃に設定した 24 穴プレートを振盪 し、細胞には TC7 細胞（Caco-2 細胞株のサブクローン）を用いて A-B 透過性を検討した。測定 は HPLC-UV/VIS 及び HPLC-MS/MS 又は何れかを用いて行った。最終濃度が DMSO1%、 HBSS-HEPES 5 mM になる様に、10mM の各被験化合物の DMSO 溶液から、pH6.5 の HBSS-MES を用いて 50 μM 濃度の溶液を調整して腸管側に添加し、pH7.4 の緩衝液を基底膜側に加えた。単 層膜の完全性は 14C-D-マンニトール透過性（<2.5 10-6 cm/s）の測定によって判定した。化合物 の腸管側から基底膜側への見かけの透過係数（Papp）及び被験化合物の回収率も算定した。各実 験において、試験系の適格性を評価するため、被験化合物、アナグレリドと同時にそれぞれの対 照化合物を試験した。アナグレリドの TC7 透過性の平均値は 65.1（ 10-6 cm/s）であり、平均回 収率は 54%であった（表 2）。この透過性の値はプロプラノロールやラニチジンより高く、アナ グレリドは透過性が高い化合物であることが実証された。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 5 of 44 表 2：被験化合物の Caco-2 細胞膜透過性の結果概要 化合物 被験濃度 平均 TC7 透過性 a -6 回収率 （μM） （10 cm/s） （%） アナグレリド 50 65.1 54 プロプラノロール 50 29.2 69 ラニチジン 50 0.8 77 50 0.3 166 ビンブラスチン a アッセイは 2 回実施した。 3.2 実験用ラット飼料からの 14C-BL-4162A（14C-アナグレリド）のバイオアベイ ラビリティ（292-061） [4.2.2.2.2] 14 C-アナグレリドをラットに混餌投与（n=5）及び懸濁液として強制経口投与（n=5）後、尿中放 射能を HPLC により測定し飼料からのバイオアベイラビリティを評価した。いずれの投与法も平 均投与量は約 2.4 mg/kg であった。投与された放射能の約 40%及び 35%がそれぞれ強制経口投与 及び混餌投与されたラットの 24 時間尿中に排泄された。両群ともその後 48 時間に更に 1%が排 泄された。両群の尿中総排泄量に有意差はなく（p>0.05）、薬物－飼料混合物からのアベイラビ リティ値は経口懸濁液からのアベイラビリティ値と同等であることが示された。 3.3 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び代謝 物プロファイリング試験（KRB0001、Phase A、B） [4.2.2.2.3] ラットに 14C-アナグレリドを経口又は静脈内投与後、血漿中放射能濃度を測定し、薬物動態パラ メータを評価した。 1. 経口投与 絶食した雄ラット（n=3）に 14C-アナグレリド懸濁液 （5 mg/kg[塩基相当量]）を単回経口投与し た場合、吸収の開始は速やかで、最初の血漿サンプリング時間（15 分）において定量可能な放射 能濃度が測定された。 その後、 血漿中放射能濃度は増加し、 投与後 4 時間で最高濃度に達した（Cmax: 1800 ng/mL[アナグレリド遊離塩基相当量]）。血漿中放射能濃度はその後低下し、消失相では約 23 時間の半減期（t1/2）で減少した。血漿中放射能濃度の t1/2 は静脈内投与（16 時間）に比べて経 口投与でやや長かった。放射能（薬物関連物質の総量を反映）の全身アベイラビリティ（F）は 2.1 と算定された（表 3）。 2. 静脈内投与 絶食した雄ラット（n=3）に 14C-アナグレリド （0.1 mg/kg[塩基相当量]）を単回静脈内投与した 場合、初回のサンプリング時間（5 分）で平均血漿中放射能濃度の最高値（97.3 ng/mL[アナグレ リド遊離塩基相当量]）が観察された。ゼロ時間の外挿血漿中濃度（C0）は 101 ng/mL（アナグレ リド遊離塩基相当量）と算定された。その後、血漿中放射能濃度は投与後 24 時間まで低下し、 消失相の半減期 t1/2 は約 16 時間であった（表 3）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 3： CONFIDENTIAL Page 6 of 44 14 C-アナグレリドを単回経口（5 mg/kg[塩基相当量]）及び静脈内（0.1 mg/kg[塩基相当量]）投与した絶食雄ラットにおける平均血漿中放射能 濃度から得られた薬物動態パラメータ a 平均用量 (mg/kg) Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUCt (ng･h/mL) AUC0-24 (ng･h/mL) AUC (ng･h/mL) λz b (h-1) t½ (h) Fc 静脈内 0.109 101d - 209 209 212 0.0427 16.2 - 経口 5.25 1800 4 21300 21300 21900 0.0298 23.3 2.1 投与経路 a 質量の単位はアナグレリド遊離塩基相当量 b 消失速度定数 c 全身アベイラビリティ d ゼロ時間の濃度 - = 該当せず 3.4 アカゲザルにおける BL-4162A（14C-アナグレリド）の薬物動態（292-063） [4.2.2.2.4] 雌アカゲザルに 14C-アナグレリドを静脈内投与もしくは、溶液、懸濁液又はカプセルの形態で経 口投与し（n=2／投与形態）、各種試料中放射能濃度を測定した。投与量は、静脈内投与の約 1 mg/kg から他の 3 種の投与形態の約 3～4 mg/kg の範囲であった。主要な消失経路は尿中排泄であり、192 時間の尿中排泄率は投与量の 54%（カプセル）から 73%（静脈内）であった。したがって、経口 投与量の少なくとも 74％が吸収されたことを示す。投与された放射能の尿糞中における平均総回 収率はすべての投与形態につき 92%であった。血漿中の放射能濃度はすべての投与形態、すべて の時間にわたり血液中濃度を上回り、かつ同様に推移した。血漿中及び血液中濃度のいずれも投 与後 2～8 時間でピーク濃度に達し、その後消失半減期 2 日で緩やかに減少した。血液の細胞フ ラクション中の放射能は、 ピーク時の血液中総放射能の 20%を占め、 その後は 10%以下であった。 未変化体は血漿中総放射能の少なくとも半分を占め、アナグレリドの血漿中ピーク濃度は経口投 与後 3 から 12 時間後に現れ、それは投与量の僅か 1 から 2%の濃度であった。アナグレリドの平 均血漿中消失半減期は、静脈内投与と経口投与のいずれも 2 日であった。これらのデータから、 アナグレリドは吸収後組織に広く分布し、比較的ゆっくりと排泄されることが示された。血漿中 濃度の AUC は経口投与と静脈内投与でいずれも近く、アナグレリドはすべての経口投与形態で 容易に吸収されることが明らかとなった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 3.5 CONFIDENTIAL Page 7 of 44 トキシコキネティクス（アナグレリド及び代謝物） 表 4：トキシコキネティクス試験一覧表 動物種 投与量 塩／ 経路 試験概要 試験番号 （mg/kg） 塩基 SD ラット 200、500、1000 U 強制経口 アナグレリド単回投与後の血漿 プロファイル 292-067 （88075） ビーグル犬 50、100、200、 400 U 強制経口 アナグレリド単回投与後の血漿 プロファイル 292-059 （89038） SD ラット 5、50、120、360 塩 経口（混餌） ビーグル犬 1、10、100、300 塩 経口（カプセ ル） ウサギ 1、10、20 塩 強制経口 CD-1 マウス 2000、5000 塩 強制経口 投与後 2 日及び 28 日のアナグ レリド及び RL603 の血漿プロ ファイル 投与後 1 日及び 28 日のアナグレ リ ド 及 び RL603 の 血 漿 プ ロ ファイル 投与後 1 日及び 14 日のアナグレ リ ド 及 び RL603 の 血 漿 プ ロ ファイル アナグレリド及び RL603 の単 回投与薬物動態試験 CD-1 マウス 5000 塩 強制経口 SD ラット 0.1 0.1、1、10 塩基 静脈内 強制経口 R00074-SPD4 22-IIIA （SRU023） D00075-SPD4 22-IIIG （SRU021） L00076-SPD4 22-IIIA （SRU022） M00251-SPD4 22-IIIG （ SRU067 、 YAH006） M4887M-SPD 422 （SPD0401） KRB0002 （PKC0716） （その他の試 験番号） ア ナ グ レ リ ド 、 RL603 及 び BCH24426 の単回投与薬物動態 試験 ア ナ グ レ リ ド 、 RL603 及 び BCH24426 の単回及び反復投与 薬物動態試験 アナグレリド塩酸塩一水和物（塩） 0.825 = 塩基 U = 投与量の表示が塩酸塩又は塩基のいずれかが報告書では不明 3.5.1 懸濁液経口投与後のラットにおけるアナグレリドの血液中濃度の予備試 験（292-067） [4.2.3.2.1] ラット経口投与毒性試験（用量設定試験）をサポートするために、ラットの血液中アナグレリド を分析する簡単で迅速な HPLC 分析法を開発した。この方法は 50 μL の血液を使用し、アナグレ リド 0.5～600 μg/mL 血液の範囲で直線性が認められた（r=0.999）。品質管理検体（1～30 μg/mL） の真度は 1.5%から－12.5%の範囲であった。 3 匹のラットに 1%カルボキシメチルセルロース中にアナグレリドを 20 mg/mL の濃度で懸濁した 液を 200 mg/kg の用量で投与した。その後、1 群 2 匹のラットに 50 又は 100 mg/mL 濃度の懸濁液 を用いて 500 又は 1000 mg/kg の用量で投与した。投与後種々の時間に血液を採取した。 200 mg/kg 投与後の血液中のアナグレリドはごく僅かであり、広範な代謝が行われたか又は投与 された薬物の極一部しか吸収されなかったかのどちらかを示している。より高用量での血液中濃 度は 200 mg/kg 投与群の血液中濃度に比べ低かった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 8 of 44 200 mg/kg 懸濁液投与後 5 から 7 時間に最高血液中濃度 5～6 μg/mL に達した。500 mg/kg 投与群 では 7 時間後に最高血液中濃度 2～3 μg/mL を示したが、1000 mg/kg 投与群では 7 時間及び 24 時 間後にそれぞれピーク濃度 2 及び 5 μg/mL が得られた。 懸濁液経口投与後のイヌにおけるアナグレリド血漿中濃度（292-059） 3.5.2 [4.2.2.2.5] 雄ビーグル犬にアナグレリドを 50、100、200 又は 400 mg/kg の用量で単回経口投与した（n=2／ 投与量）。投与後 24 時間まで血液を採取し、血漿中アナグレリド濃度を HPLC で分析した。最 高血漿中濃度（Cmax）は、50 mg/kg 投与量の約 0.2～0.3 μg/mL から 400 mg/kg 投与の約 5～7 μg/mL の範囲であった。低用量側の 3 つの投与量では Cmax は直線的に増加する傾向にあったが、400 mg/kg 投与では低用量から予測された値の約 2 倍であった。同様に、400 mg/kg 投与の場合、0～ 10 時間の血漿中濃度時間曲線下面積（AUC）は低用量側から予測される値の約 2.5 から 5 倍大き かった。おそらくサンプルサイズが小さいため、全体的にデータはかなり変動した。アナグレリ ドの前に溶出された代謝物と思われるピークは投与後 0.5 時間で検出されており、その濃度は 10 時間又は 24 時間では検出限界以下に低下した。アナグレリドに対するこの代謝物の Cmax 及び AUC の比率は用量の増加と共に低下した。これらの結果は 200 mg/kg を超える用量での代謝の飽 和を示唆しているが、全体のデータの変動が大きく断定はできなかった。 3.5.3 アナグレリド：CD ラット 4 週間経口（混餌）投与毒性試験における曝露 （R00074-SPD422-IIIA） [4.2.3.2.3] ラット 4 週間混餌投与毒性試験において、バリデートされた LC-MS/MS 法を用いて、投与後 2 日 及び投与後 4 週に血漿中アナグレリドとその代謝物である RL603 濃度を測定した。以下の表 5 に AUC を表示した。 表 5：混餌投与後のラットにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 化合物 アナグレリド 日 2 28 RL603 2 28 各投与量での AUC（ng･h/mL）a 性 5 mg/kg/日 50 mg/kg/日 120 mg/kg/日 360 mg/kg/日 雄 250 6352 21203 50082 雌 242 3553 21477 43403 雄 583 34165 87654 119319 雌 634 11670 44655 90018 雄 210 6388 32155 29604 雌 190 2528 15553 28241 雄 327 19172 43854 56922 雌 394 9732 29608 45736 a 1 週目における実際の投与量は、摂餌量が少なかったため 4 週目の投与量に比べ低かった。この影響により、投与後 2 日 から 28 日の期間における曝露量が見かけ上増加した。 アナグレリド及び代謝物 RL603 の血漿中濃度は 24 時間にわたりほとんど維持され、平均 Cmax/Cmin 比はそれぞれ 3.7 及び 2.9 であった。このように血漿中濃度が維持されるのは長時間の経口摂取 と溶解律速による吸収の抑制のいずれか又は両者の結果によるものと思われる。アナグレリドと 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 9 of 44 RL603 に対する曝露は用量増加に比例する以上に増加し、排泄過程に飽和が存在する可能性が示 唆された。雌の曝露は雄に比べ低かった。長期投与により低用量（5 及び 50 mg/kg/日）では蓄積 が生じたが、高用量では生じなかった。この要因としては高脂溶性薬物の長時間の経口摂取の影 響が考えられる。 3.5.4 アナグレリド：ビーグル犬 4 週間経口（カプセル）投与毒性試験における 曝露（D00075-SPD422-IIIG） [4.2.3.2.8] イヌ 4 週間経口投与毒性試験において、バリデートされた LC-MS/MS 法を用いて、投与後 1 日及 び 28 日に血漿中アナグレリド濃度と RL603 濃度を測定した。 測定された濃度のばらつきにより、 用量相関性、性別の影響及び反復投与の影響の判断は困難であった。概して、曝露は用量と共に 増加し、雌で若干高い傾向にあり、反復投与の終了時点でも高かった。本試験から、イヌがヒト の主要な代謝物 RL603 に広範に曝露されることが示された。以下の表 6 に AUC を表示した。 血漿中アナグレリド濃度のばらつきは、特に高用量における不完全な吸収、及びそれに伴う吸収 のばらつきによるものであった可能性が考えられる。これを裏付けるように、Tmax 値は高用量で 遅延し（最大 18 時間まで）、溶解速度律速の吸収を示唆している。アナグレリドの水に対する 溶解度は約 1.5 μg/mL と小さい。カプセル投与は溶解速度律速の吸収をさらに悪化させた可能性 がある。このばらつきを説明するその他の要因として初回通過代謝の可能性が考えられる。生体 内変換を検討した結果、ごく少量の未変化体が排泄されたのみで、広範な代謝とそれ故に全身吸 収前のクリアランスの可能性が示唆された。 表 6：カプセル投与後のイヌにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 化合物 日 アナグレリド 1 28 RL603 1 28 性 雄 各用量の AUC0-24（ng･h/mL） 1 mg/kg/日 10 mg/kg/日 38 1777 100 mg/kg/日 625 a 300 mg/kg/日 19856 20116 a 雌 35 5130 雄 150 604 1916 28909 雌 119 4066 10959 22696 雄 142 8084 2238 9278 雌 210 2261 9460 8452 雄 297 1851 10968 17451 雌 502 3414 12721 20122 21610 a 1 匹のイヌの値（AUC0-18）を平均値の計算から除外した。 3.5.5 アナグレリド：ウサギ 14 日間反復（強制経口）投与時の薬物動態試験 （L00076-SPD422-IIIA） [4.2.2.2.6] ウサギ生殖発生毒性試験をサポートするためのレトロスペクティブなトキシコキネティクス試 験として、1 群 6 匹の雌 New Zealand White ウサギに 1、10 及び 20 mg/kg/日のアナグレリドを 14 日間反復経口投与した。投与後 1 日と 14 日の種々の時間の血液を経時的に採取した。アナグレ 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 10 of 44 リド 20 mg/kg/日投与群の内 2 匹は試験期間中に死亡又は切迫屠殺した。10 又は 20 mg/kg/日投与 群において投与第 1 週目に、また、20 mg/kg/日投与群では第 2 週目にも摂餌量が低下した。血小 板数に影響はなかった。 バリデートされた LC-MS/MS 法を用いて投与後 1 日と 14 日に血漿中のアナグレリド濃度と RL603 濃度を測定した。アナグレリドの Tmax 値は概して 1～1.5 時間の範囲にあり、速やかに吸収され、 t1/2 は約 2.6 時間であり速やかに消失した。ウサギはヒトの主要な代謝物である RL603 に顕著な濃 度で曝露され、半減期はアナグレリドと同程度又は若干長かった。アナグレリドと RL603 の曝露 量は用量増加に比例する以上に増加した。ウサギではラットやイヌに比べ用量当たりの血漿中 RL603 濃度が概してかなり高かった。反復投与によるアナグレリドの顕著な蓄積はなかった。一 方、RL603 は中等度に蓄積する傾向が認められたが、これは観察された約 3 時間の半減期とは一 致しなかった。以下の表 7 に AUC を表示した。 表 7：反復強制経口投与後の雌ウサギにおけるアナグレリド及び RL603 の曝露 化合物 アナグレリド RL603 3.5.6 日 各用量の AUC0-24（ng･h/mL） 1 mg/kg/日 10 mg/kg/日 20 mg/kg/日 1 120 2487 9385 14 143 3038 5400 1 679 8989 28241 14 804 17562 36006 アナグレリド：小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物及び 代謝物の曝露評価（M00251-SPD422-IIIG） [4.2.2.2.7] 複数の群の CD-1 マウスに 4 時間にわたり 3 回の同一分割用量で 2000 又は 5000 mg/kg のアナグ レリドを強制経口投与した。この用法は小核試験における投与法に従ったものである。24 時間ま での 11 時点でそれぞれ雌雄各 3 匹のマウスから血液を採取し、血漿中のアナグレリドと RL603 濃度を LC-MS/MS 法により測定した。 アナグレリドの AUC24 は 2000 mg/kg で雄 45.0 又は雌 41.1 μg･h/mL、5000 mg/kg で雄 71.4 又は雌 63.7 μg･h/mL であった。Cmax は約 3 から 5 μg/mL の範囲であり、Tmax は大きく変動した（1 から 18 時間の範囲）。RL603 はほとんどの動物で定量下限値（0.25 μg/mL）未満であったが、投与後 5 から 24 時間の間の検体の幾つかは定量可能であった。バリデートされていない方法により、ヒ ト代謝物 BCH24426 も検出されたが、正確な濃度は測定できなかった。 3.5.7 アナグレリド：小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物及び 代謝物の曝露の追加評価（M4887M-SPD422） [4.2.2.2.8] 1 群の CD-1 マウスに 4 時間にわたり 3 回の同一分割用量で 5000 mg/kg のアナグレリドを強制経 口投与した。24 時間までの 6 時点でそれぞれ雌雄各 3 匹のマウスから血液を採取し、血漿中のア ナグレリド、RL603 及び BCH24426 濃度を LC-MS/MS 法により分析した。 アナグレリドを強制投与後、すべての時点で、アナグレリドと 2 つの代謝物 BCH24426 及び RL60 の曝露が確認された。アナグレリドの最高血漿中濃度（Cmax）は投与後 1 時間（雄）及び 2 時間 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 11 of 44 後（雌）に検出され、一方、BCH24426 及び RL603 の Cmax は投与後 18 時間（雄）及び 24 時間（雌） に検出された。正確な消失速度定数が得られなかったため t1/2 は算定できなかった。雄及び雌に おける AUC24 はそれぞれアナグレリド：62.7、39.7 μg･h/mL、RL603：3.66、2.97 μg･h/mL、 BCH24426：18.1、10.9 μg･h/mL であった。 結論として、アナグレリドを 5000 mg/kg/日の用量で強制経口投与（同一分割用量をマウスに 2 時 間間隔で 3 回投与）すると、マウスはアナグレリドとその代謝物 BCH24426 及び RL603 に曝露さ れた。 3.5.8 KRN654：雄ラットに対する単回静脈内投与並びに単回及び反復経口投与 後の薬物動態（KRB0002） [4.2.2.2.9] 本試験は、単回静脈内投与並びに単回及び反復経口投与後の雄ラットにおけるアナグレリドとそ の代謝物（活性代謝物 BCH24426、主要代謝物 RL603）の薬物動態を評価するため実施した。 アナグレリド塩酸塩一水和物を 0.1 mg/kg（塩基相当量）の用量で単回静脈内投与した。また、0.1、 1 及び 10 mg/kg（塩基相当量）を単回経口投与した。さらに、1 mg/kg/日（塩基相当量）の用量で 7 日間反復経口投与した。 投与後 24 時間または 48 時間に渡って各ラットから血液を採取し、血漿中のアナグレリドと代謝 物 BCH24426 及び RL603 の濃度をバリデートされた LC-MS/MS 法によって測定した。血漿中濃 度－時間プロファイルから得られた薬物動態パラメータを以下の表 8 にまとめた。 アナグレリドは大きな分布容積を有する薬物であり、経口投与後、相当な初回通過効果を受ける。 単回経口投与後、ラットにおけるアナグレリドとその代謝物 BCH24426 及び RL603 に対する全身 曝露の速度と量は 0.1 から 1 mg/kg の用量範囲では直線的であると思われた。しかし、0.1 から 10 mg/kg の用量範囲では、全身曝露は用量依存的（ただし非直線的）の薬物動態によって特徴づけ られると思われる。1 mg/kg を超えて増量すると、直線関係から予測される以上に高い全身曝露 が得られた。これは、アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の排泄過程に飽和が存在する可能性 が考えられるが、高用量におけるアナグレリドのバイオアベイラビリティの増加による可能性も 考えられる。 7 日間反復経口投与後、アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の蓄積は認められなかった。反復 投与後のアナグレリドと BCH24426 の薬物動態プロファイルは単回投与後と同様であった。7 日 間反復投与後の RL603 の AUC と Cmax は単回投与後より低値であった。 アナグレリドから BCH24426 への変換は極めて迅速であったが、変換量は多くはなかった。RL603 への変換は遅く、変換量も少なかった。代謝物の生成は用量依存的であると思われた。最高用量 での変換は遅く、変換量も少なかった。 アナグレリド 0.1 mg/kg を単回経口投与した後のアナグレリドのバイオアベイラビリティは低 かった（8%）。このデータは広範な初回通過効果と一致し、この過程は高用量では飽和する可能 性があると思われる。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 8： CONFIDENTIAL Page 12 of 44 雄ラットにおけるアナグレリド及び代謝物 BCH24426、RL603 の薬物動態 パラメータ 静脈内 アナグレリド薬物動態 パラメータ 0.1 mg/kg 単回経口 反復経口 0.1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg 1 mg/kg/日 1.26 15.8 1110 15.6 - 1 1.5 4 1 AUCt (ng･h/mL) 56.0 3.99 57.4 6940 47.9 AUC (ng･h/mL) 56.4 4.54 61.8 6650 1.7 Cmax (ng/mL) 132 Tmax (h) a t1/2 (h) 0.9 2.8 1.7 1.6 CL (L/h/kg) 1.81 21.6b 16.4b 1.54b - 1.54 92.2 c c c - - 8.0 Vss (L/kg) F (%) a: C0 ; b: CL/F; c: BCH24426 薬物動態パ ラメータ 41.8 - 3.55 - - Vz/F 静脈内 単回経口 反復経口 0.1 mg/kg 0.1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg 1 mg/kg/日 Cmax (ng/mL) 3.42 1.08 9.52 230 11.0 Tmax (h) 0.25 1 1.5 1.5 1 AUCt (ng･h/mL) 4.05 2.82 33.0 1490 28.3 AUC (ng･h/mL) 4.61 3.70 35.1 - - t1/2 (h) 0.7 1.7 2.5 - - RL603 薬物動態パラ メータ 静脈内 単回経口 反復経口 0.1 mg/kg 0.1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg 1 mg/kg/日 0.304 0.861 6.37 118 3.43 0.5 1 2 7 0.75 AUCt (ng･h/mL) 0.718 2.91 28.9 853 15.8 AUC (ng･h/mL) 1.07 3.18 33.3 - - t1/2 (h) 1.8 1.8 2.6 - - Cmax (ng/mL) Tmax (h) 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL 4. 分布 4.1 血漿タンパク結合及び組織分布 表 9： Page 13 of 44 アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の血漿タンパク結合及び組織分布 試験一覧表 動物種 濃度／用量及び 経路 試験概要 試験番号 （その他の試験番号） ラット、ウサギ、イヌ 及びヒト 10 ng/mL in vitro 14 C-アナグレリドの in vitro 血漿タンパク結合予 備試験 V00150-SPD422-IIIG （SRU041） ラット、ウサギ、イヌ 及びヒト 動物: 10～5000 ng/mL 14 C-アナグレリドの in vitro 血漿タンパク結合 V00145-SPD422-IIIG （SRU039） ラット、ウサギ、イヌ 及びヒト 20 ng/mL in vitro RL603 の in vitro 血漿タ ンパク結合 V00146-SPD422-IIIG （SRU040） ヒト アナグレリド:1、10 及び 50 ng/mL BCH24426: 5、50 及び 100 ng/mL in vitro アナグレリドと BCH24426 の in vitro 血漿 タンパク結合 V00851-SPD422-IIIG （CYP0085_R5） ＳＤラット 5 mg/kg、強制経口 14 C-アナグレリドの組織 分布 292-062（4162-04） ＳＤラット 14 組織内濃度 KRB0001（PKC0514） ヒト: 5～1000 ng/mL in vitro C-アナグレリド 5 mg/kg （塩基相当量） （血漿、肝臓、腎臓及び 骨髄） アナグレリド塩酸塩一水和物（塩） 0.825 = 塩基 4.1.1 14 C-アナグレリド：アナグレリドの「非特異的」結合並びにラット、ウサ ギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合の予備的評価 （V00150-SPD422-IIIG） [4.2.2.3.1] ラット、ウサギ、イヌ及びヒトの血漿に 14C-アナグレリドを 10 ng/mL（[塩基相当量]、実際の濃 度は 8.5～9.0 ng/mL[塩基相当量]）で添加し、等張のリン酸緩衝液（pH7.4）中、37℃で約 16 時 間透析することによって血漿タンパク結合を測定した。14C-アナグレリドの平均血漿タンパク結 合率はラットとヒトで類似し、それぞれ 88.0%及び 87.8%であった。ウサギとイヌの平均血漿タ ンパク結合率は若干低く、それぞれ 77.4%及び 81.0%であった。本試験より、2 mL 容量のセルを 用いる平衡透析法により、最小濃度 10 ng/mL（塩基相当量）においても結合率を測定するのに十 分な感度を有することが示された。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 4.1.2 CONFIDENTIAL Page 14 of 44 14 C-アナグレリド：ラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿 タンパク結合（V00145-SPD422-IIIG） [4.2.2.3.2] 平衡透析法が 14C-アナグレリドの血漿タンパク結合率の測定に適切な方法であることが判明した ため、この方法により各種動物（ラット、ウサギ、イヌ、10～5000 ng/mL[塩基相当量]）及びヒ ト（5～1000 ng/mL[塩基相当量]）において血漿タンパク結合率を測定した。平均血漿タンパク結 合率は、ヒト（約 89%）とラット（約 88%）で最も高く、イヌではやや低く（約 82%）、ウサギ で最も低かった（約 75%）。いずれの種においても、これらの濃度範囲で濃度依存的な結合率の 変化は認められなかった。 4.1.3 RL603：RL603 の「非特異的」結合並びにラット、ウサギ、イヌ及びヒト における in vitro 血漿タンパク結合（V00146-SPD422-IIIG） [4.2.2.3.3] ヒトの主要な代謝物である RL603 の血漿タンパク結合率をバリデートした LC-MS/MS 法を用い て測定した。ラット、ウサギ、イヌ及びヒトの血漿に濃度 20 ng/mL（[塩基相当量]、実際の濃度 は 18.44～24.10 ng/mL[塩基相当量]）で添加し、等張のリン酸緩衝液（pH7.4）中、37℃で約 16 時間透析することによって RL603 の血漿タンパク結合を検討した。RL603 の平均血漿タンパク結 合率はイヌとヒトで同等であり、それぞれ 90.5%及び 89.9%であった。ウサギとラットの血漿タ ンパク結合率は若干低く、平均結合率はそれぞれ 86.1%及び 88.7%であった。 4.1.4 アナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿タンパク結合率に関する検討 （V00851-SPD422-IIIG） [4.2.2.3.4] アナグレリド及びその活性代謝物である BCH24426 のヒト血漿タンパク結合率を、平衡透析法を 用いて検討した。3 種の濃度のアナグレリド（1、10、50 ng/mL）と BCH24426（5、50、100 ng/mL） を用い、血漿タンパク結合が濃度依存的であるかどうか確認した。透析後、検体を LC-MS/MS 法 によって定量した。血漿タンパク結合率は、アナグレリドと BCH24426 は同等であり、両薬物と も約 10%が非結合型であった。試験した濃度範囲では、ヒト血漿タンパク結合率に濃度依存的な 変化は認められなかった（表 10）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 10： CONFIDENTIAL Page 15 of 44 平衡透析法によるアナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿との非結合型 分率 化合物 濃度（ng/mL） 平均値 標準偏差 % 回収率 アナグレリド 1 0.112 0.013 97 10 0.098 0.014 115 50 0.145 0.040 100 5 0.087 0.008 108 50 0.119 0.054 116 100 0.101 0.009 101 BCH24426 4.1.5 ラットにおける 14C-BL-4162A （14C-アナグレリド）のマスバランス及び 組織分布試験（292-062） [4.2.2.3.5] 5 匹の雄ラットに 14C-アナグレリドを 5 mg/kg の用量で単回経口投与した。72 時間にわたりすべ ての尿糞排泄物を採取し、放射能を測定した。投与後約 23 時間に、1 匹のラットが急性の肺うっ 血により死亡した。投与後 72 時間に、残りの内 3 匹のラットから臓器と組織を採取し、さらに 同用量を投与した他の群のラット（n=3／採取時点）から投与後 2、21 及び 50 時間に臓器と組織 を採取した。同様に、尾静脈内に 1 mg/kg の 14C-アナグレリドを投与したが、投与した量のうち かなりの部分がラットの尾に残存していたため、この群の結果は報告されていない。経口投与群 では、尿・糞中に回収された放射能の 95%以上が 48 時間以内に排泄された。72 時間までに尿及 び糞中に排泄された放射能の合計はそれぞれ投与量の 37%及び 50%であった。静脈内投与後 72 時間までの糞中に投与放射能量の約 44％が排泄され、胆汁排泄の可能性が示唆された。投与後 2 時間に投与量の 63%が臓器・組織に存在し、残りは消化管内に存在した。2 時間後では肝臓、腎 臓、副腎及び消化管中濃度が最も高く、次いで甲状腺及び肺中濃度が高かった。放射能濃度が低 かった組織は、眼、生殖腺、脳であった。50 時間後、トータルで 3%の放射能が臓器・組織及び 消化管内に存在した。全ての臓器・組織中の放射能濃度は、概して血漿中濃度と同様な推移で減 少した。異常な組織局在は観察されず、概して組織中濃度は投与後約 21 時間以内には 2 時間の レベルの 10%未満に低下した。これらの結果から、アナグレリドは吸収後、臓器・組織に分布し、 胆汁中（後述）及び尿中に排泄され、アナグレリドとその代謝物のいずれも臓器や組織に残留し ないことが明らかとなった。 4.1.6 [10a-14C ]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び代 謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase D） [4.2.2.2.3] 14 C-アナグレリドの懸濁液を 5 mg/kg（塩基相当量）の用量で絶食雄ラットに単回経口投与後、血 漿、肝臓、腎臓及び骨髄の放射能分布を検討した（n=3）。投与後 2、4、24 及び 48 時間に末梢 血採取後 3 匹を屠殺（頸椎脱臼）し、各臓器・組織を採取し放射能を測定した。14C-アナグレリ ドの経口投与後、24 時間までは腎臓中濃度が最も高かったが、投与後 48 時間では肝臓中濃度が 最も高かった。概して組織中濃度は投与後 4 時間が最も高く、その後低下したが、投与後 48 時 間でも全ての検体で放射能が検出可能であった。組織／血漿比は全時間にわたり肝臓と腎臓で 1 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 16 of 44 を超えていたが、骨髄は 1 未満であった。肝臓、腎臓の最高総放射能量はそれぞれ投与量の約 5% 及び 3%であった（表 11）。 表 11： 14 C-アナグレリド （5 mg/kg[塩基相当量]）を絶食雄ラットに単回経口 投与した後の各臓器・組織における総放射能濃度 平均濃度（μg/g[アナグレリド遊離塩基相当量]） 組織 2 時間 4 時間 24 時間 48 時間 1.43 1.72 0.065 0.022 肝臓（投与量に対する%） 6.35 (4.452) 6.52 (4.790) 0.426 (0.5014) 0.285 (0.3429) 腎臓（投与量に対する%） 14.8 (2.840) 17.2 (3.144) 0.538 (0.1040) 0.214 (0.0456) 0.726 1.15 0.053 0.013 2 時間 4 時間 24 時間 48 時間 肝臓 4.5 3.8 6.6 13 腎臓 11 10 8.3 10 0.51 0.67 0.82 0.59 血漿 プールした骨髄 血漿に対する濃度比 プールした骨髄 （ ）= 組織中総放射能量。結果は投与量に対する割合（%）で表示。 4.2 胎盤通過試験 4.2.1 SPD422：ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与した 後の乳汁分泌及び胎盤通過（R4845M-SPD422、その他の試験番号 8259362） [4.2.2.3.6] 本試験は、[14C]-SSP-001001A（14C-アナグレリド、塩酸塩一水和物として 3 mg/kg）単回経口投与 後の妊娠母動物（投与時点で妊娠 17 日目）及び in-situ 胎児の組織中放射能濃度を測定するため に実施した。 6 匹の妊娠雌ラットに 14C-アナグレリド（3 mg/kg[塩酸塩一水和物]）を単回強制経口投与した。 投与後 0.5、1、2、4、8 及び 24 時間に各 1 匹の妊娠動物をイソフルラン深麻酔下に寒冷ショック によって屠殺した。終末麻酔下に 5 mL までの血液をヘパリンリチウム採血管に採取し、一定量 の血液を分析用に取り、残りの検体は血漿調製用に遠心分離（1500 g、4℃、10 分）後、残存す る血液細胞を廃棄した。各血液及び血漿検体中の放射能濃度を測定した。 妊娠アルビノラット（投与時点で妊娠 17 日目）に 14C-アナグレリドを単回経口投与した場合、放 射性薬物関連物質は吸収され、広く分布した。母ラット及び胎児ラットのほとんどの組織は、各 サンプリング時間において定量可能な放射能濃度に曝露されていた。組織中放射能濃度は、投与 後 1 から 4 時間の間にピークに達した。放射能濃度は、試験期間中徐々に低下したが、最終サン プリング時間の 24 時間でもほとんどの組織で定量可能であった。母ラットの組織中放射能濃度 は、比較可能なサンプリング時間において、概して母ラットの血漿中濃度より低かった。母ラッ トの組織／血漿中濃度比は、0.1 から 10 の間であった。放射能に高濃度に曝露された組織 （AUCall>10000 ng･h/g）は、副腎髄質、胆管、血液、腎皮質及び腎髄質、肝臓、肺、小腸粘膜、 膀胱壁、膀胱内容物、子宮等であった。曝露量が小さかった組織（AUCall<1000 ng･h/g）は、脳、 眼の水晶体及び脊髄であった。算出が可能であった消失半減期は循環血液の 11.2 時間（定量的全 身オートラジオグラフィー：QWBA データによって決定）より小さく、10 時間未満であった。 検討した胎児組織のすべてが何れかのサンプリング時間で放射性薬物関連物質に曝露されてい た。胎児組織／母動物血漿比は 0.8 以下であった。胎児組織における分布パターンは母動物組織 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 17 of 44 と同様であった。 組織中放射能濃度は概して 2 時間と 4 時間のサンプリング時間にピークに達し、 その後経時的に減少した。サンプリングの最終である 24 時間には、胎児組織は最大 82.3 ng/g（ア ナグレリド遊離塩基相当量）を含有した。胎児組織の薬物関連物質に対する曝露量（AUC）は 5000 ng･h/g 未満であった。胎盤の曝露は 5280 ng･h/g であった。胎児組織からの放射能の消失半減期 は、算定可能な場合、4.82 から 8.72 時間の範囲であった。 結論として、薬物関連物質の妊娠動物組織への広範な分布があり、母動物と胎児組織のピーク濃 度は概して投与後 1 時間と 4 時間の間に観察された。母動物と胎児組織のほとんどは、各サンプ リング時点において相当する母動物血液中濃度より低かった。試験期間中に薬物関連物質に対す る最も高い曝露を示した組織として、副腎髄質、胆管、血液、腎皮質と腎髄質、肝臓、肺、小腸 粘膜、膀胱壁と内容物及び子宮が含まれた。薬物関連物質が胎盤バリアを通過することが明らか となった。ほとんどのサンプリング時間で胎児組織中の放射能濃度が測定可能であった。算定可 能な場合、母動物と胎児組織からの放射能の消失半減期は 10 時間未満であった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 5. CONFIDENTIAL Page 18 of 44 代謝－in vitro 及び in vivo－ 表 12：アナグレリド代謝試験一覧表 動物種／系統／検体 濃度／投与量 経路 試験概要 試験番号（その 他の試験番号） 理論考察 該当なし 該当なし 構造のレビューによる推定代 謝物 X00187-SPD422-III G ヒト肝細胞 2～20 μM In vitro 14 C-アナグレリドの代謝 V00121-SPD422-III G（SRU038） 発現ヒトチトクローム P450 6 μM In vitro チトクローム P450 による 14 C-アナグレリドの代謝 V00183-SPD422-III G（SRU051） ヒト消化管内細菌叢 6 μM In vitro 14 V00172-SPD422-III G（SRU045） ヒト肝ミクロソーム 0.04～20 μM In vitro アナグレリド及び／又は RL603 によるチトクローム P450 阻害 V00232-SPD422-III G（201254） ヒト肝ミクロソーム 5 μM In vitro 14 V00261-SPD422-III G（SPD/08） Aroclor 1254 誘導ラッ ト肝 S9 フラクション 1、2 μM In vitro 14 V00292-SPD422-III G（SPD/11） ヒト肝ミクロソーム 4 nM、20 nM、2 µM、5 µM In vitro in vitro アナグレリド代謝に 影響する要因の評価 V00855-SPD422 （CYP0085_R7） ヒト肝ミクロソーム 20 及び 400 nmol/L In vitro アナグレリド代謝に関連する ヒトチトクローム P450 の同 定 PK0702 Long-Evans ラット 72～78 μg/kg（塩基相当量） 経口（溶液） 14 アカゲザル 48 μg/kg（塩基相当量） 292-060 （817-BL-4162-06） ビーグル犬 26～28 μg/kg（塩基相当量） ヒト 15 μg/kg（塩基相当量） SD ラット 50 mg/kg U 50 mg/kg U 経口（懸濁液） アナグレリドの代謝物 ビーグル犬 ヒト 1 mg（塩基相当量） 経口（カプセ ル） ヒト血漿及び尿 2 mg 経口カプセル C-アナグレリドの代謝 C-アナグレリドの代謝 C-アナグレリドの代謝 C-アナグレリド尿中代謝物 プロファイル 経口（懸濁液、 カプセル） アナグレリドの代謝物 X00196-SPD422-III G（SPD/05） X00281-SPD422-III G（YAH/004h） （続く） 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 19 of 44 表 12：アナグレリド代謝試験一覧表 動物種／系統／検体 濃度／投与量 経路 試験概要 試験番号（その 他の試験番号） イヌ尿 50 mg/kg U 経口 アナグレリドの代謝物 D00313-SPD422-III G（YAH/004/d） ラット尿 50 mg/kg U 強制経口 アナグレリドの代謝物 R00312-SPD422-III G（YAH/004/r） SD ラット血漿、肝臓、 腎臓、骨髄 5 mg/kg（塩基相当量） 経口（胃挿管） 14 1 mg/kg（塩基相当量） 静脈内 KRB0001 （PKC0514） ヒト肝細胞 100 ng/mL In vitro アナグレリドの CYPs 誘導能 V00852-SPD422-III G（CYP0085_R6） ラット肝細胞 1.5～15：0.5～5： In vitro アナグレリド、BCH24426、 RL603 の CYPs 誘導能 V01233M-SPD422 （SPD/13） 0.25～2.5μg/mLa、 ヒト肝細胞 C-アナグレリドの代謝物 0.1～10：0.2～20： 0.05～5μg/mLa アナグレリド塩酸塩一水和物（塩） 0.825 = 塩基 a アナグレリド：BCH24426：RL603 の混合物中濃度 U = 報告が塩酸塩又は塩基のどちらの意味で投与量が表現されているのか不明 5.1 アナグレリドの可能な代謝経路の推定（X00187-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.1] 構造の観点から 3 つの主要な代謝経路の可能性が考えられる。 図 1：アナグレリドの構造 a) イミダゾリノンの加水分解開裂 b) 窒素に隣接するいずれかのメチレン基の酸化 c) 芳香環の水酸化 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 20 of 44 構造的に関連した化合物の代謝を参照し、アナグレリドの代謝経路を推定した。 図 2：動物及びヒトにおけるアナグレリドの推定代謝経路 化合物(1)と(3)は加水分解的 開環によって生成すると考 えられるが、これが主要な経 路であるという構造関連化 合物からの証拠はない。 アナグレリド 5.2 すべての代謝物、特に化合物 (2)、(3)、(6)、(7)はグルクロ ン酸抱合や硫酸抱合などの 抱合体を形成する可能性も ある。 アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌ肝細胞を用いた in vitro 代謝の比較 （V00121-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.2] 14 C-アナグレリド（2、6、20μM）をヒト肝細胞存在下 37℃でインキュベーション（0、0.5、1、3 時間）し、アナグレリドの代謝を HPLC で測定した。 14C-アナグレリドは、凍結保存ヒト肝細胞 存在下でいくつかの放射性フラクションに見かけ上ごくゆっくりと変換され、3 時間のインキュ ベーション時間内に変換されたものは 22%未満であった。試験した 14C-アナグレリドの最小濃度 では、さらに広範な放射性フラクションの形成が観察され、低濃度側の 2 濃度のみ、これらの反 応が時間経過と共に進行した。この緩徐な変換速度は使用したインキュベーション条件下での細 胞代謝活性の欠損によるものではなかった。14C-アナグレリドの代わりに 50 μM の[14C]7-エトキ シクマリンを陽性対照としてインキュベーションした結果、14C-アナグレリドと同条件において 最大 27%の基質代謝が認められた。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 21 of 44 ヒト肝細胞とのインキュベーション終了時点で親化合物である 14C-アナグレリドとは別に 4 つの 放射性フラクション（MF-1 から MF-4 と命名）が観察された。これらの内の 2 つ（保持時間約 12.5 分の MF-1 と保持時間約 14 分の MF-2）は一貫して微量な生成物であった。MF-3（保持時間 約 16 分）は 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン（RL603）と同様の保持時間であった。 MF-3 は対照としたインキュベーションでも観察されたが、量は微量であった。MF-3 と MF-4 は、 凍結保存ヒト肝細胞と 2 μM 及び 6 μM の 14C-アナグレリドとのインキュベーションで時間経過と 共に生成した主要な成分であったが、20 μM の 14C-アナグレリド濃度では観察されなかった。 ヒト肝細胞を用いた試験にて代謝速度が遅かったことから、計画した凍結保存ラット及びイヌ肝 細胞とのインキュベーションは実施せず、試験は中止した。 5.3 アナグレリド：発現ヒトチトクローム P450 による可能な代謝の検討 （V00183-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.3] バキュロウイルス感染昆虫細胞（Supersomes）から調製したミクロソームを用いて発現ヒトチト クローム P450 （CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4）による 14C-アナグレリドの生体内変換の可 能性を in vitro で検討した。14C-アナグレリドを 6 μM の濃度でインキュベーションした場合、 CYP1A2 でのみ明確な代謝が認められた。ここでもなお、代謝は極めて遅く、2 時間の生体内変 換率は最高約 16.6%であった。 CYP1A2 Supersomes とのインキュベーション終了時点で MF-1～MF-4 と命名した 4 つの成分が観 察された。この内 MF-1 と MF-2 は比較的少量の生成物（添加した総放射能の 1%以下）であった が、MF-3 と MF-4 は見かけ上より主要な成分（添加した総放射能の 2%以上）であった。既知の 主要なヒト代謝物である RL603 と同様の保持時間を有する MF-3 は、対照としたインキュベー ションでも観察されたが、割合的には CYP1A2 Supersomes インキュベーション検体と比較してよ り少量であった。 14 C-アナグレリドの生体内変換を検討したこの in vitro 試験において発現チトクローム P450 の内 CYP1A2 が最も重要な寄与をすることが明らかとなった。 5.4 アナグレリド：ヒト消化管内細菌叢による代謝の検討（V00172-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.4] ヒト糞調製物（菌体懸濁液）を用いてヒト消化管内細菌叢による 14C-アナグレリドの生体内変換 の可能性を in vitro で検討した。 嫌気条件で最大 24 時間まで 6 μM の 14C-アナグレリドとインキュ ベーションし、ラジオ HPLC によりインキュベーション生成物を検討した。その結果、生体内変 換を示す確かな証拠は得られなかった。薬物の 10%未満が消失していたが、菌体懸濁液を含まな い対照インキュベーションとの間に有意差はなかった。 5.5 ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対するアナグレリド及びその薬理学的活性 代謝物 RL603 の作用の in vitro 探索試験（V00232-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.5] 本試験は治療薬の代謝を介在するヒト肝ミクロソーム P450 の主要な分子種に対するアナグレリ ド及びその代謝物 RL603 の阻害能力を調べることを目的とした。 プローブ基質と共にインキュベーションした結果、アナグレリド 0.0377～1.79 μM の濃度範囲で の最大阻害作用は、エトキシレゾルフィンの O-脱エチル化を介在する CYP1A2 を 1.79 μM（Cmax 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 22 of 44 の 41.7 倍相当）のアナグレリド濃度で約 15%阻害したことであった。さらに 18.8 μM 濃度のアナ グレリドで実施した結果、 約 40%の CYP1A2 活性阻害が得られた。 基質添加前に 1.79 μM 及び 18.8 μM 濃度のアナグレリドとプレインキュベーションした結果、阻害レベルはそれぞれ約 40%及び 66%に増加した。プレインキュベーション後のこの阻害能力の増加は、作用機序に基づく（ある いは代謝物介在性の） CYP1A2 の阻害と一致する。 この阻害レベルがもし in vivo で発現されれば、 クリアランスが CYP1A2 による代謝に大きく依存する薬物を同時投与した際、この薬物の曝露を 変化させる可能性がある。 20 μM 濃度の RL603 は CYP1A2 活性を約 49%低下させた。プレインキュベーションによりこの阻 害作用は減少する傾向にあったことから、RL603 は更に阻害活性を持たない生成物に代謝される ことが示唆された。 アナグレリド及び RL603 のいずれも、試験した他のチトクローム P450 アイソザイムに対する阻 害作用は示さなかった。 5.6 アナグレリド：ヒト肝及び腸ミクロソームを用いた 14C-アナグレリドの in vitro 代謝予備試験（V00261-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.6] 14 C-アナグレリド（5 μM）をプールしたヒト肝ミクロソーム存在下で 60 分インキュベーションし、 アナグレリドの代謝物を HPLC で測定した。その結果、ヒト肝ミクロソームによる 14C-アナグレ リドの代謝速度が低いことが示された（60 分のインキュベーションで約 6%が代謝）。 親化合物の 14C-アナグレリド以外に 2 つの微量な放射性成分（それぞれ溶出した総放射能の約 3%）が検出され、仮に R-1、R-2 と命名した。 R-1 は対照インキュベーションでも検出されたが量的には僅かであり、ミクロソームとその補因 子の共存下ではより多くの R-1 が生成した。R-2 はミクロソームタンパクとその補因子の共存下 でのみ生成した。これらのデータは、R-1 は非代謝過程により微量に生成するが、R-1 と R-2 が 14 C-アナグレリドのヒト肝ミクロソーム代謝機序により生成していることを示している。 R-2 は溶出された総放射能の 3.1%にあたる微量な成分であるが、この試験で使用された HPLC 系 で R-2 と BCH24426（in vivo にて同定されたヒト代謝物）の両化合物を分析すると同様の保持時 間（約 21 分）を有することが明らかとなっている。 プールしたヒト肝ミクロソームにより、陽性対照の 14C-テストステロンは、主要なヒト肝由来代 謝物である 6β-ヒドロキシテストステロンに代謝された（60 分のインキュベーションで 10%生成）。 本試験における 14C-テストステロンの全体の代謝量は比較的低いが、このデータは本試験で使用 したインキュベーション条件が代謝反応を再現する能力を有していることを示している。それゆ え、この試験において、プールしたヒト肝ミクロソームにより 14C-アナグレリドが広範には代謝 されないことは事実である。 アナグレリドは in vitro において、プールしたヒト肝ミクロソームにより顕著な程度では代謝され ないと結論された。また、ヒト肝ミクロソームを用いた試験にて代謝速度が遅かったことから、 計画したヒト腸ミクロソームとのインキュベーションは実施せず、試験は中止した。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 5.7 CONFIDENTIAL Page 23 of 44 アナグレリド：Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクションを用いた 14C-ア ナグレリドの in vitro 代謝予備試験（V00292-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.7] 14 C-アナグレリド（1 及び 2 μM）を Aroclor 1254 で誘導したラット肝 S9 フラクション存在下で 60 分インキュベーションし、アナグレリドの代謝物を HPLC で測定した。その結果、14C-アナグ レリドは数多くの放射性代謝物フラクションに広範に代謝された。1 μM と 2 μM の 14C-アナグレ リド濃度のいずれも S9 を含まない対照検体と比較して、60 分のインキュベーションで 80%を越 えるアナグレリドが代謝された。 非放射性の代謝物標準化合物との同時クロマトグラフィーにより、2 つの放射性代謝物フラク ションを 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン（RL603）及び 6,7-ジクロロ-3-ヒドロキ シ-1,5-ジヒドロ-イミダゾ[2,1-b]キナゾリン-2-オン（BCH24426）と暫定的に同定した。これらは いずれもアナグレリドの推定代謝物である。次に LC-MS/MS によるサンプル分析により（**** *******************社）、Aroclor 1254 誘導 S9 検体中に RL603 及び BCH24426 が存在すること を確認した。これらの検体中に水酸化代謝物も検出された。 アナグレリドは Aroclor 1254 誘導ラット S9 フラクションによって RL603 と BCH24426 を含む多 くの代謝物に広範に代謝されることが明らかにされた。それゆえ、Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクションを使用した in vitro 遺伝毒性試験では親化合物アナグレリドとそのラット肝由来代 謝物の両方の影響の結果を反映している。 5.8 14 C-アナグレリド（BL-4162A）経口投与後の実験動物における尿中代謝物プ ロファイル（292-060） [4.2.2.4.8] 14 C-アナグレリドを 6 匹のラット（72～78 μg/kg）、2 匹のアカゲザル（48 μg/kg）、2 匹のイヌ（26、 28 μg/kg）及び一人のヒト（15 μg/kg）に経口投与し、尿中代謝物を HPLC により分析した。アカ ゲザルは排泄経路、排泄速度及び排泄量の点でヒトに最も類似しており、72 時間尿中排泄率は、 アカゲザルで投与量の約 60%、ヒト被験者で約 70%であった。ラット及びイヌの 24 時間尿中排 泄率は、それぞれ 40%及び 25%であった。アナグレリドはすべての動物種にわたって広範に代謝 され、尿中に排泄された放射能の 98%以上は代謝物であった。動物における尿中代謝物プロファ イルはヒトと質的には類似したが、量的には異なっていた。ヒトの主要な 3 つの代謝物は、投与 量の 14%、12%及び 24%を占めた。これらの各代謝物は他の 3 種の動物の尿中に存在したが、通 常はヒトより少量であった。 5.9 14 C-アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌで得られた代謝物の性質に関する クロマトグラフィー検討（X00196-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.9] ラット及びイヌに 14C-アナグレリドを 50 mg/kg 経口投与後、72 時間までの尿または糞中の代謝物 を HPLC で測定し、ラットとイヌの排泄物中に存在する 放射性成分をヒト被験者のもの （13,970-107A 試験にて採取）と比較した。ヒトの尿中には 4 つの顕著なピークがあり、その内 2 つは既知代謝物 RL603 と BCH24426 と一致した。他の 2 つは、使用した HPLC システムではより 極性のある物質であった。未変化の 14C-アナグレリドは検出されなかった。 ラットとイヌのラジオクロマトグラムはより複雑であった。ラットでは未変化の 14C-アナグレリ ドと BCH24426 がいずれも微量成分として検出され、RL603 と同一位置に溶出される単一の主要 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 24 of 44 な放射性成分が検出された。イヌでは未変化の 14C-アナグレリドは検出されず、RL603 及び BCH24426 と同一の位置に溶出される 2 つの主要な成分が検出された。他の多くの成分は同定で きなかった。 ラットとイヌの糞中では、アナグレリド標準品と同一位置に溶出される放射性物質が検出され、 これは未吸収の薬物を反映していると考えられた。 14 C-アナグレリドは、ヒト、イヌ及びラットで広範に代謝され、BCH24426 と RL603 は 3 つの動 物種すべてで生成されると結論された。 5.10 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるヒト血漿及び尿中 アナグレリドの代謝物の検討（X00281-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.10] アナグレリド 2 mg を単回投与した 6 人の日本人男性被験者と 2 人のプラセボ投与被験者からの検体 （血漿及び尿）に種々の抽出操作を加え、種々のクロマトグラフィー条件と質量分析条件で解析した。 血漿と尿を分析した結果、2 つの主要な代謝物（RL603、BCH24426）及び RL603 のグルクロン酸 抱合体が同定された。BCH24426 の構造を提示した（図 3）。 その他、目立った代謝物は同定されず、特に第 2.6.4.5.1 項に提示した構造(1)、(3)、(4)、(6)、(7) についての証拠は得られなかった。 図 3：アナグレリドの代謝物 BCH24426 の構造 5.11 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるイヌ尿中アナグレ リドの代謝物の検討（D00313-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.11] イヌ尿抽出物中代謝物を LC-MS/MS により検討した。m/z 216 のピークを有するイヌ尿抽出物の グラジエント HPLC のトレースをスキャンしたところ、RL603 の予想保持時間（15.0 分）に 1 つ のピークを認めた。m/z 256 のトレースをスキャンしたところ、アナグレリドの予想保持時間（20.8 分）に 1 つの小さなピークを認めたが、感度が低く同定はできなかった。 m/z 272 の抽出イオンクロマトグラム（XIC）は保持時間 16 分から 21 分の間に 5 つのピークを示 し、2 つの塩素原子の存在の証拠となるツインのマスピークを認めたことから、これらのピーク は薬物由来のものであることが示唆された。RL603 と比較した場合、m/z 272 の未知化合物のピー ク面積は RL603 の 3%、14%、42%、84%及び 38%であり、それぞれの溶出時間は 16.2 分、18.3 分、18.5 分、18.9 分及び 19.5 分であった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 25 of 44 18.3 分と 18.5 分に溶出する代謝物のプロダクトイオンスキャンは、合成された BCH24426 を含む反 応混合物からのスキャンと一致した。18.5 分のイヌ尿中におけるこの代謝物（BCH24426）の存在は 合成された BCH24426 を含む反応混合物とイヌ尿検体との同時クロマトグラフィーにより確認した。 BCH24426 は 18.5 分の保持時間の代謝物と同じ位置に溶出された。18.3 分のピークで観察されたフラ グメンテーションのパターンの類似性から、この化合物は BCH24426 と密接に関連する化合物であり、 BCH24426 はこれまで提示されてきたようにいくつかの平衡型で存在し得ることから、これらの平衡 型の一つである可能性を示唆している。 保持時間 18.9 分と 20.1 分の化合物は、ジクロロジヒドロキナゾリン骨格が水酸基により置換さ れた構造と一致する m/z 244 と m/z 215 の目立ったフラグメントイオンを有し、これらは 16.2 分 のピークでも観察された。 5.12 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析検出法によるラット尿中アナグ レリドの代謝物の検討（R00312-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.12] 14 C-アナグレリドを約 50 mg/kg の用量でラットに単回経口投与後、3 匹の雄ラットから 0～48 時 間尿を採取した。尿中排泄物の約 94.7%を含むプールした尿検体を固相抽出により処理した。抽 出効率は約 54%であった。 m/z 216 のピークを有するラット尿抽出物のグラジエント HPLC のトレースをスキャンしたとこ ろ、RL603 の予想保持時間（15.0 分）に 1 つのピークを認めた。m/z 256 のトレースのスキャンに よりアナグレリドの予想保持時間（20.8 分）に 1 つの小さなピークを認めたが、感度が低く、同 定はできなかった。 m/z 272 の抽出イオンクロマトグラム（XIC）において数多くのピークが認められた。しかし、保 持時間 16 分から 22 分の間にこれらのピークの内 5 つのみが 2 つの塩素原子の存在の証拠となる ツインのマスピークを示し、薬物関連物質の可能性を示唆した。RL603 と比較した場合、m/z 272 の未知化合物の相対的ピーク面積は RL603 の 4%、1%、8%、11%及び 1%であり、それぞれの溶 出時間は 16.2、18.5、18.9、19.5 及び 21.2 分であった。 約 18.5 分に溶出するラット代謝物のプロダクトイオンスキャンは合成された BCH24426 を含む反 応混合物からのスキャンと一致した。 保持時間が約 16.2 分、18.9 分及び 20.1 分の化合物は、すべて m/z 215 の重要な断片を含み、これ らの化合物がジクロロジヒドロキナゾリン骨格の水酸基置換体とよく一致することが示された。 5.13 [10a-14C]KRN654：単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄及び代 謝物プロファイリング試験（KRB0001、Phase D） [4.2.2.2.3] 1. 代謝物プロファイル 14 C-アナグレリドを絶食雄ラット（n=3）に単回経口（5 mg/kg[塩基相当量]）又は単回静脈内（0.1 mg/kg[塩基相当量]）投与後、血漿、肝臓、腎臓及び骨髄の代謝物プロファイルを薄層クロマト グラフィー（TLC）により検討した（ただし、静脈内投与は 2 及び 4 時間の血漿のみ採取）。保 持係数（Rf）に基づき分離された成分に確認番号（M1～M9）を割り振った。14C-アナグレリド経 口投与後の血漿、肝臓、腎臓及び骨髄の代謝物プロファイルから、主要成分として親化合物アナ グレリド（M5）とその 3-ヒドロキシ代謝物 BCH24426（M7）の存在が示された。アナグレリド より極性の低い代謝物（M2、M3［おそらく参照化合物 RL603］、M4）及びより極性の高い代謝 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 26 of 44 物（M6、M8、M9）も観察されたが、これらの同定はいまだ未知のままである。投与後 24 時間 と 48 時間の血漿検体には、極めて極性の高い代謝物（M9）の存在を認めた。 2. 血漿 経口投与（5 mg/kg[塩基相当量]）後 2 時間と 4 時間の血漿検体にて、主要な放射能が 4 つの明確 なバンド（M2、M5、M7、M8）として溶出された。各バンドの保持係数は、それぞれ約 0.09、 0.39、0.51 及び 0.60 であった。2 時間後のこれらの成分は検体中総放射能の平均 22.6%、29.9%、 14.9%及び 10.9%を占めていた。これらの成分の内、M5 は同時クロマトグラフィーによりアナグ レリドに一致し、M7 は BCH24426 に一致したが、M2 と M8 は他の参照化合物と一致せず、化学 同定は未知のままである。他の検出された代謝物 M6（使用したクロマトグラフィー条件下では M5 と M7 と部分的にのみ分離）は検体中総放射能の平均 8.1%を示した。他のすべての成分は概 して検体中総放射能の 3%未満であった（表 13）。 14 C-アナグレリド（0.1mg/kg[塩基相当量]）を絶食雄ラットに単回静脈内投与後 2 時間と 4 時間に 採取したプール血漿を分析し、2 つの投与経路のクロマトグラフィープロファイルを比較した。 静脈内投与では検体量がごく限られていたため、得られたプロファイルの全曝露イメージが弱く、 代謝物の相対%（及び濃度）は報告されていない。しかし、全代謝パターンは分析した各時点に おいて経口投与後と静脈内投与後で質的に類似し、検体中に M3、M5、M7 及び M8 が明白に存 在する証拠が得られた。量的な差は明らかであり、例えば、静脈内経路で投与された動物の検体 では M2 と M5 の比率はずっと低かった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 13： CONFIDENTIAL 14 C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラッ ト血漿抽出物中の放射性成分（TLC によって分離）の平均比率（及び濃 度） 放射性成分の平均比率；％ 代謝物 Rf 近似値 a M1 0.00 1.2 (0.017) M2 0.09 M3 0.16 M4 M5 Page 27 of 44 b 2 時間 4 時間 （濃度） 24 時間 48 時間 1.5 (0.026) 7.2 (0.005) 7.7 (0.002) 22.6 (0.327) 27.9 (0.477) ND ND 2.3 (0.032) 2.1 (0.036) ND ND 0.22 2.1 (0.028) 1.9 (0.032) 2.2 (0.002) ND 0.39 29.9 (0.440) 23.5 (0.422) ND ND M6 0.46 8.1 (0.114) 10.0 (0.168) ND ND M7c 0.51 14.9 (0.209) 13.6 (0.230) 4.0 (0.003) ND M8 0.60 10.9 (0.151) 10.4 (0.174) ND ND 0.79 M9 2.7 (0.037) 1.9 (0.033) 62.3 (0.040) 55.0 (0.012) その他 d 5.3 (0.077) 7.3 (0.124) 24.2 (0.016) 37.2 (0.008) 平均抽出率 （%） 97.5 ± 0.6 97.0 ± 0.8 65.3 ± 0.8 49.4 ± 5.8 結果は検体中総放射能に対する割合（％）及び（μg/g[アナグレリド遊離塩基相当量]）として表示 報告された濃度は抽出率で補正していない a 血漿（及び腎臓）の Rf 値は肝臓と骨髄で観察された値よりやや低い b 同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと一致 c 同時クロマトグラフィーにより BCH24426 と一致 d 特定の成分に該当せず ND = 放射能検出されず 3. 肝臓 投与後 2 時間の検体を TLC により分析した結果、主要な放射能が 2 つの明確なバンド（M5 と M7：保持係数それぞれ約 0.45 及び 0.57）として溶出された。この 2 つの成分は検体中総放射能 の平均 31.6%と 24.7%を占めていた。血漿と同様に、これらの成分は同時クロマトグラフィーに よりアナグレリド（M5）と BCH24426（M7）と一致した。肝検体には、各相当する時間の血漿 検体と比較して、多くの極性の低い代謝物（M1［原点］、M2、M3）が存在した。これらの各成 分は検体中放射能の 7 から 9%を占めた。他の検出された代謝物 M8（Rf 0.66）と M6（Rf 0.52） は検体中放射能の 6.4%と 3.9%を占め、他のすべての成分は概して 3%未満であった。投与後 4 時 間の検体に関しては、M5（アナグレリド）の平均比率は 3 匹の内 2 匹の動物で低下したが、3 番 目の動物では僅かに増加し、全体の平均比率（検体中放射能の 26.2%）は投与後 2 時間に比べ僅 かに低下したのみである。より極性の高い代謝物 M7（BCH24426）は基本的に変化せず、検体中 総放射能の平均 25.7%を維持した。他の検出された成分の比率も本質的に変化せず、維持された。 投与後 24 時間及び 48 時間での顕著な代謝物は M7 と M8（M6 は動物 27M のみ）であった。こ れらの検体中で原点に存在する放射能も顕著な比率で維持されていた（表 14）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 14： CONFIDENTIAL Page 28 of 44 14 C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラッ ト肝抽出物中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 肝代謝物 Rf 近似値 a M1 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する％） 2 時間 4 時間 24 時間 48 時間 0.00 7.5 8.4 16.4 21.2 M2 0.16 6.8 8.0 ND ND M3 0.25 8.7 10.0 4.6 ND M4 0.32 2.1 2.8 ND ND 0.45 31.6 26.2 ND ND M5 b M6 0.52 3.9 4.4 9.5 3.6 M7c 0.57 24.7 25.7 19.7 17.4 M8 0.66 6.4 6.6 22.3 22.8 0.88 0.7 0.7 1.9 ND 7.6 7.1 25.7 35.1 86.7 ± 1.9 84.0 ± 5.6 30.1 ± 0.5 19.3 ± 1.0 M9 その他 d 平均抽出率 （%） a 血漿（及び腎臓）の Rf 値は肝臓と骨髄で観察された値よりやや低い b 同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと一致 c 同時クロマトグラフィーにより BCH24426 と一致 d 特定の成分に該当せず ND = 放射能検出されず 4. 腎臓 投与後 2 時間の検体を TLC 分析した結果、主要な放射能が 4 つの明確なバンドとして溶出された （M3、M5、M7 及び M8；それぞれの保持係数は約 0.17、0.38、0.49 及び 0.57）。これらの成分 は検体中放射能の平均 16.8%、12.2%、40.6%及び 12.3%を占めていた。血漿と肝臓と同様に、同 時クロマトグラフィーにより M5 と M7 がそれぞれアナグレリド、BCH24426 と一致した。M8 は 他の入手可能な参照化合物とは同一位置に溶出されなかったので、この成分の化学的同定は不明 のままである。M3 は参照化合物 RL603 と関係する可能性があるが、TLC の同時クロマトグラ フィーでは結論を出せなかった。他の代謝物の内、M6 は検体中放射能の平均 4.7%を占め、原点 に残存する放射能は検体中放射能の 3.9%を占めた。他の唯一目視可能な代謝物（M4）は検体中 放射能の 3%未満であった。本質的に同様な結果が投与後 4 時間でも観察されたが、代謝物 M7 （BCH24426）の比率は 3 匹の動物すべてでやや低下し、M6 の比率は投与後 2 時間に比べ増加し ていた。 投与後 24 時間の TLC プロファイルでは、代謝物はより少ないことを示したが、M7（BCH24426） と M8 は腎臓ではいまだ主要な代謝物であった（それぞれ検体中総放射能の平均 29.4%及び 15.9%）。代謝物 M9（Rf 0.79; 検体中総放射能の平均 9.2%）も検出され、クロマトグラムの比較 から投与後 24 時間の血漿抽出物中に観察された成分と一致した。 原点に存在する放射能に加え、 代謝物 M6 と M3（おそらく RL603）もこの時点では 3 匹すべての検体で顕著であった。投与後 48 時間ではラジオクロマトグラムのイメージは弱く、M7（BCH24426）と M8 はいまだ検出可能 であったが、M6 と M9 は 1 匹の動物（27M）でのみ検出可能であった。腎臓においても、この時 点で顕著な放射能比率が原点に認められた（表 15）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 29 of 44 14 表 15： C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラッ ト腎抽出物中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 腎代謝物 Rf 近似値 a M1 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する％） 2 時間 4 時間 24 時間 48 時間 0.00 3.9 5.0 10.5 15.8 M2 - ND ND ND ND M3 0.17 16.8 14.8 4.7 ND M4 0.25 2.2 2.8 ND ND 0.38 12.2 13.1 ND ND M5 b M6 0.43 4.7 7.9 9.2 1.5 M7c 0.49 40.6 37.7 29.4 26.3 M8 0.57 12.3 11.1 15.9 13.0 - ND ND 9.2 2.1 7.3 7.5 21.1 41.4 94.4 ± 0.5 94.8 ± 0.1 79.4 ± 1.0 72.3 ± 0.5 M9 その他 d 平均抽出率 （%） a 血漿（及び腎臓）の Rf 値は肝臓と骨髄で観察された値よりやや低い b 同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと一致 c 同時クロマトグラフィーにより BCH24426 と一致 d 特定の成分に該当せず ND = 放射能検出されず 5. 骨髄 投与後 2 時間のプールした検体を TLC 分析した結果、主要な放射能は 3 つの明確なバンド（M5、 M6 及び M7；保持係数は約 0.44、0.50 及び 0.56）として溶出された。これらの成分は検体中総放 射能の 50.5%、22.0%及び 17.2%）を占めていた。血漿、肝臓、腎臓のマトリックスと同様に、 M5 は同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと、M7 は BCH24426 と一致した。使用したク ロマトグラフィー条件で、M5 と M7 と部分的にのみ分離した M6 は、供給された参照化合物とは 同一位置には溶出されず、化学的同定は不明のままである。M3（おそらく RL603）も分析した検 体中に検出された。本質的に同様な結果が投与後 4 時間にも認められたが、投与後 24 時間には M5（アナグレリド）と M3 は検出されず、M6 と M7 はこの時点で検出された唯一の主要な代謝 物であった（それぞれ検体中総放射能の 69.6%及び 13.4%）。投与後 48 時間には放射能レベルが 低く、代謝物の適切な検出は不可能であった（表 16）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 16： CONFIDENTIAL Page 30 of 44 14 C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後の絶食雄ラッ トプール骨髄中の TLC によって分離された放射性成分の平均比率 プールした骨髄中の Rf 近似値 a 代謝物 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する％） 2 時間 4 時間 24 時間 48 時間 e M1 0.00 1.4 1.8 3.2 ND M2 - ND ND ND ND M3 0.21 4.2 4.4 ND ND M4 - ND ND ND ND 0.44 50.5 50.9 ND ND M6 0.50 22.0 23.8 69.6 ND M7c 0.56 17.2 14.0 13.4 ND M8 - ND ND ND ND - ND ND ND ND 4.7 5.1 13.8 - 93.7 91.7 76.2 60.7 M5 b M9 その他 d 平均抽出率 （%） a 血漿（及び腎臓）のRf値は骨髄で観察された値よりやや低い b 同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと一致 c 同時クロマトグラフィーによりBCH24426と一致 d 特定の成分に該当せず e 成分検出されず ND = 放射能検出されず 5.14 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価（V00855-SPD422） [4.2.2.4.13] アナグレリドと BCH24426 の in vitro 代謝を調べるため 4 つの試験を実施した。 1. ヒト肝ミクロソーム存在下のアナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝 反応を開始するための NADPH（最終濃度 1 mM）添加前にプールしたヒト肝ミクロソーム（最終 タンパク濃度 0.5 mg/mL）を、37℃で 15 分間プレインキュベーションした。各化合物の対照イン キュベーションとして NADPH の代わりに 0.1 M リン酸緩衝液をウェルに加えた。 各化合物を 0、 5、15、30 及び 45 分間インキュベーションした（各時点当たり 3 連でインキュベーション）。対 照（-NADPH）のインキュベーション時間は 45 分のみとした。各時点で一定量（50 μL）の培養 液を採取し、反応停止のためにアセトニトリル（100 μL）を加えた。アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の濃度は LC-MS/MS 法を用いて測定した。2 つの陽性対照化合物デキストロメトル ファン及びベラパミルを試験系に加えた（最終基質濃度 3 μM、各時点当たり 3 連でインキュベー ション）。これらの対照インキュベーションでは親化合物のみをモニターし、濃度ではなくピー ク面積を親化合物消失の算定に使用した。対照化合物の検体は標準的な LC-MS/MS 法で測定した。 その結果、アナグレリド（5 μM）と BCH24426（5.3 μM）はヒト肝ミクロソーム存在下、45 分後 にはそれぞれゼロ時点の 64.1%及び 74.6%にまで代謝され（表 17）、一方、4 nM と 20 nM 濃度の アナグレリドは 45 分後それぞれ 80.9%及び 71.0%にまで代謝された（表 18）。陽性対照のデキス トロメトルファン（3 μM）とベラパミル（3 μM）はそれぞれゼロ時点の 65.6%及び 27.0%まで代 謝された。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 17： CONFIDENTIAL Page 31 of 44 アナグレリド（5 μM）及び BCH24426（5.3 μM）をヒト肝ミクロソーム とインキュベーションした後のアナグレリド及び BCH24426 濃度 化合物 親化合物残存率 （%） インキュベーション時間 対照 0 分 45 分 （-NADPH） アナグレリド（5 μM） 100 64.1 90.8 BCH24426（5.3 μM） 100 74.6 84.8 表 18： ヒト肝ミクロソーム（0.5 mg/mL）及び NADPH （1 mM）存在下にアナ グレリド（4 nM、20 nM）、陽性対照化合物デキストロメトルファン及 びベラパミルを 45 分間インキュベーションした後の親化合物の残存率 （%表示） 親化合物残存率（%） 化合物 インキュベーション時間 -NADPH 0 分 45 分 デキストロメトルファン （3 µM） 100 65.6 95.1 ベラパミル （3 µM） 100 27.0 93.5 アナグレリド （4 nM） 100 80.9 88.4 アナグレリド （20 nM） 100 71.0 71.7 2. ヒト腸管ミクロソーム存在下のアナグレリドの in vitro 代謝 本試験は、初回通過代謝の可能な機序としてアナグレリドの代謝に腸管が主要な役割を果たすか どうかを調べるために実施した。ヒト腸管ミクロソーム存在下、アナグレリドが代謝された証拠 はほとんどなく、45 分のインキュベーション後、開始量の 86.4%が残存していることが明らかと なった。それゆえ、本試験の知見からは、ヒトにおいてアナグレリド代謝に腸管が主要な役割を 果たす可能性は低いと考えられた（表 19）。 表 19： ヒト腸管ミクロソーム（1 mg/mL）及び NADPH （1 mM）存在下にア ナグレリド（2 μM） 及び陽性対照化合物ミダゾラム（2 µM）を 45 分 間インキュベーションした後の親化合物の残存率（%表示） 化合物 インキュベーション時間 -NADPH 0 分 45 分 アナグレリド 100 86.4 79.3 ミダゾラム 100 2.10 101 3. アナグレリド及び BCH24426 の代謝への CYP1A1、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19 及 び CYP3A4 関与の検証 本試験は、アナグレリドから BCH24426 への代謝、及び BCH24426 から RL603 への代謝に関与す る主要なチトクローム P450 アイソフォームを再評価するために実施された。CYP1A はアナグレ リドから BCH24426 への生体内変換に関与する主要なアイソフォームであると思われた。アナグ 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 32 of 44 レリド（2 µM）は in vitro にて CYP1A1 bactosome 存在下で極めて急速に代謝され、5 分後のアナ グレリドの残存率は 9.18%のみであり、45 分後は 1%未満であった。BCH24426（2 µM）を CYP1A1 bactosome とインキュベートした結果、 更に代謝が進み、対照 bactosome と比べ 5 分後の BCH24426 の残存率は 42.2%であり、45 分後は 8.11%であった。CYP1A2 もアナグレリドを代謝する能力を 有していた（45 分後の残存率 16.8%）。45 分間のインキュベーション中に BCH24426 の生成が確 認された。対照 bactosome のインキュベーションでは代謝は認められなかった（表 20）。他のチ トクローム P450 bactosome（それぞれ CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4 bactosome）で検 討した結果、いずれもアナグレリドから BCH24426 への代謝を示す明確な証拠は認められなかっ た。 表 20： ヒト CYP1A1 bactosome （100 pmol/mL）又は CYP1A2 bactosome（100 pmol/mL）存在下にアナグレリド（2 μM）、BCH24426（2 μM）及びエ トキシクマリン（2 µM）を 45 分間インキュベーションした後の親化合 物の残存率（%表示） 親化合物残存率（%） 化合物 ID 0 分 5分 15 分 30 分 45 分 エトキシクマリン （対照 bactosome） 100 103 117 104 109 エトキシクマリン（CYP1A1 bactosome） 100 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1a アナグレリド （対照 bactosome） 100 99.9 101 93.4 96.6 アナグレリド （CYP1A1 bactosome） 100 9.18 5.73 2.25 0.672 BCH24426 （対照 bactosome） 100 103 100 81.9 80.7 BCH24426 （CYP1A1 bactosome） 100 42.2 25.5 15.0 8.11 102 101 エトキシクマリン （対照 bactosome） 100 97.1 97.0 エトキシクマリン（CYP1A2 bactosome） 100 1.64 < 0.1 < 0.1 < 0.1 アナグレリド （対照 bactosome） 100 86.9 100 90.1 87.6 アナグレリド（CYP1A2 bactosome） 100 69.4 38.8 21.1 16.8 BCH24426 （対照 bactosome） 100 106 103 92.7 91.8 BCH24426 （CYP1A2 bactosome） 100 73.4 68.5 56.2 54.8 a a n =2 a n=1 繰り返し測定の内 1 回で内標準物質が低いことによる。 4. CYP1A2 基質であるエトキシレゾルフィンの代謝に対する BCH24426 の阻害能力の検討 本試験は、代謝にもとづく阻害が起こるかどうかを確認するため、代謝系と被験化合物をプレイ ンキュベーションの有り無しで実施した。BCH24426 はプレインキュベーションの有り無しにか かわらず CYP1A を阻害し、 推定 IC50 値はそれぞれ 29.6 ± 2.15 µM 及び 26.8 ± 2.33 µM であった （表 21）。これらの濃度は約 7300～8100 ng/mL に相当し、若年／成人患者における BCH24426 の正規 化した臨床曝露量（Cmax、8.7 ng/mL）より極めて高い濃度であった（SPD422-202 試験）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 21： CONFIDENTIAL Page 33 of 44 BCH24426 及び陽性対照化合物フラフィリン、α-ナフトフラボンによる CYP1A（エトキシレゾルフィン O-脱アルキル化）の阻害 化合物 IC50 標準偏差 （µM） （µM） フラフィリン（プレインキュベーション有り） 1.79 0.342 フラフィリン（プレインキュベーション無し） 28.2 5.21 α-ナフトフラボン （プレインキュベーション有り） 0.0127 0.000379 α-ナフトフラボン （プレインキュベーション無し） 0.0148 0.00228 BCH24426 （プレインキュベーション有り） 29.6 2.15 BCH24426 （プレインキュベーション無し） 26.8 2.33 n=3 5.15 KRN654 の代謝に関わる CYP 分子種同定試験（PK0702） [4.2.2.4.14] 本試験は、アナグレリドを代謝する CYP アイソフォームを調べるため、ヒト肝ミクロソーム酵素 活性によるアナグレリドの in vitro 代謝を評価した。LC-MS/MS を用いてアナグレリドの分解を調 べ、 代謝活性と残存活性を測定した。ヒト肝ミクロソーム（0.6 mg/mL）中で CYP 阻害剤（SKF525A） 及び抗 CYP アイソフォーム特異的抗体の存在下、又は非存在下でアナグレリド（濃度 20 nmoL/L 又は 400 nmol/L）を 37℃、120 分インキュベーションした。SKF525A（CYP 阻害剤）は濃度依存 的にアナグレリド代謝活性及び残存活性を低下させた。CYP1A2 について抗 CYP アイソフォーム 特異的抗体は 20 nmol/L 濃度のアナグレリドの代謝活性を著しく低下させ、残存活性は 11.0%で あった。対照的に、各 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 に対する抗 CYP アイソフォーム 特異的抗体はいずれのパラメータに対しても影響せず、残存活性は 98.9～100.8%に維持された。 アナグレリド濃度 400 nmol/L では、阻害は抗 CYP1A2 抗体でのみ起こり、残存活性は 6.3%であっ た（表 22）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 22： CONFIDENTIAL Page 34 of 44 ヒト肝ミクロソームにおける 20 nmol/L 及び 400 nmol/L のアナグレリ ドの in vitro 代謝に対する抗 CYP アイソフォーム特異的抗体の影響 アナグレリド濃度 抗 CYP アイソフォーム 特異的抗体 アナグレリド代謝活性 （pmol/分/mg） 残存活性 （%） 20 nmol/L 対照 0.265 100.0 CYP1A2 0.0292 11.0 400 nmol/L 5.16 CYP2C9 0.264 99.6 CYP2C19 0.262 98.9 CYP2D6 0.262 98.9 CYP3A4 0.267 100.8 対照 3.54 100.0 CYP1A2 0.222 6.3 CYP2C9 3.79 107.1 CYP2C19 3.75 105.9 CYP2D6 3.69 104.2 CYP3A4 3.82 107.9 アナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝に関わるチトクローム P450 の 誘導試験（V00852-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.15] CYP450 誘導及び薬物-薬物相互作用が in vivo で起こる可能性を探る目的で試験を実施した。（1） アナグレリド又はその代謝物 BCH24426、RL603 がヒト肝細胞中の CYP1A 又は CYP3A4 を誘導 する能力があるかどうかを試験した。（2）CYP1A 誘導剤であるオメプラゾールがアナグレリド から BCH24426 及び RL603 への代謝に影響する能力を有するかどうかを検討した。 1. アナグレリドと BCH24426 のいずれも CYP1A プローブ基質であるエトキシレゾルフィンの 代謝を誘導することはないと思われた。RL603 についてはレゾルフィン生成のわずかな増加 （33%）が観察された。この増加は有意（p<0.05）であるが、その生物学的関連性は疑わし い。アナグレリド、BCH24426、RL603 のいずれも CYP3A4 を誘導しなかった（表 23 及び表 24）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 23： CONFIDENTIAL Page 35 of 44 アナグレリド（100 ng/mL）、BCH24426 （100 ng/mL）及び RL603 （100 ng/mL）の新鮮分離したヒト肝細胞における CYP1A 誘導能 化合物 レゾルフィン生成 レゾルフィン生成 誘導% 平均値 標準偏差 （pmol/分/106 細胞） （pmol/分/106 細胞） 溶媒対照 2.39 0.38 - オメプラゾール （50 μM） 22.47** 1.26 840 溶媒対照 2.64 0.54 - アナグレリド （100 ng/mL） 3.21 0.13 22 BCH24426 （100 ng/mL） 3.44 0.47 30 RL603 （100 ng/mL） 3.50* 0.27 33 * = 溶媒対照との間に有意差有り（p<0.05 独立、片側 t-検定） ** = 溶媒対照との間に有意差有り（p<0.01 独立、片側 t-検定） 表 24： アナグレリド（100 ng/mL）、BCH24426 （100 ng/mL） 及び RL603 （100 ng/mL）の新鮮分離したヒト肝細胞における CYP3A4 誘導能 化合物 1-ヒドロキシミダゾラム生成 1-ヒドロキシミダゾラム 平均値 生成 （pmol/分/106 細胞） 誘導% 標準偏差 （pmol/分/106 細胞） 溶媒対照 6.83 0.42 - デキサメサゾン （50μM） 268.15** 6.32 3824 溶媒対照 22.02 0.53 - アナグレリド （100 ng/mL） 18.59 1.36 - BCH24426 （100ng/mL） 16.54 1.48 - RL603 （100 ng/mL） 19.96 2.52 - ** = 溶媒対照との間に有意差有り（p<0.01 独立、片側t-検定） 2. オメプラゾール曝露により誘導した凍結保存肝細胞中でアナグレリド濃度は有意に低下した （p<0.01）。BCH24426、RL603 のいずれも溶媒対照のウェル中、又はオメプラゾールに曝露 した細胞中で検出されなかった（表 25）。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 表 25： CONFIDENTIAL Page 36 of 44 オメプラゾールにより誘導された付着性凍結保存肝細胞の in vitro アナ グレリド代謝に対する影響 化合物 アナグレリド アナグレリド 残存% 平均値（μM） 標準偏差 溶媒対照 2.80 0.25 100 オメプラゾール （50 μM） 1.86** 0.07 66.4 （インキュベーション開始 1 時間後にデータを取得） ** = 溶媒対照との間に有意差有り（p<0.01） 5.17 ラット培養肝細胞を用いるアナグレリド及びその代謝物 BCH24426、RL603 の肝 CYP450 酵素誘導能の評価（V01233M-SPD422） [4.2.2.4.16] 酵素誘導の可能性を評価するため、in vitro 系として培養ラット肝細胞を用いて検討した。ラット 肝細胞の培養を 4 日間維持し、その間、アナグレリドとその代謝物 BCH24426 と RL603 を（混合 物として）2 種類の濃度で頻回添加して曝露させた（アナグレリド：BCH24426：RL603 濃度、1.5： 0.5：0.25 μg/mL、及び 15：5：2.5 μg/mL）。ここで使用した薬物濃度は、げっ歯類がん原性試験 で観察された血漿中濃度の Cmax 及びその 10 倍濃度を網羅している。また、ヒト肝細胞の培養を 4 日間維持し、その間、混合物としてアナグレリドとその代謝物 BCH24426 と RL603 を 3 種類の濃 度で頻回添加して曝露させた（アナグレリド：BCH24426：RL603 濃度、0.1：0.2：0.05 μg/mL、 1.0：2.0：0.5 μg/mL 及び 10：20：5 μg/mL）。培養後、この肝細胞を種々のチトクローム 450 酵 素の選択的基質と共にインキュベーションした。同時に、プロトタイプの P450 酵素を誘導する 薬剤を対照として試験した。 ラット肝細胞（雄、雌の両方）の結果から、アナグレリド混合成分（アナグレリド：BCH24426： RL603 濃度、1.5：0.5：0.25 μg/mL）の曝露後、7-エトキシレゾルフィン O-脱エチル化酵素（EROD） 活性の著しい増加が示された。このデータは、アナグレリド混合成分中の 1 成分又はそれ以上の 成分による CYP1A 酵素の誘導を示唆している。他の CYP450 酵素誘導作用は観察されなかった。 ヒト肝細胞（女性）の結果より、アナグレリドの混合物（アナグレリド：BCH24426：RL603 濃 度、1.0：2.0：0.5 μg/mL）への曝露後、EROD とフェナセチンの O-脱エチル化酵素活性が陽性対 照薬と比較して約 18%増加し、CYP1A 酵素誘導がもたらされることが示された。ただし、この 誘導の程度は、in vivo での臨床評価が必要とされる誘導の推奨レベルより低かった。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 37 of 44 排泄 6. 表 26： アナグレリドの排泄試験一覧表 動物種 用量 塩／ 塩基 経路 試験概要 試験番号（その他の 試験番号） アカゲザル 1 mg/kg 3～4 mg/kg 塩基 静脈内 14 292-063（4162-03） Long-Evans ラット 塩基 経口（溶液） 14 C-アナグレリド の尿中代謝物プ ロファイル 292-060 （817-BL-4162-06） ヒト 72～78 μg/kg 48 μg/kg 26～28 μg/kg 15 μg/kg SD ラット 50 mg/kg U 経口（懸濁液） ビーグル犬 50 mg/kg U 経口（懸濁液及び カプセル） アナグレリドの 代謝物 X00196-SPD422-IIIG （SPD/05） ヒト 1 mg 塩基 経口（カプセル） アカゲザル 4 mg/kg U 強制経口 14 C-アナグレリド 単回投与の薬物 動態試験及び排 泄 P00228-SPD422-IIIG （6988-100） SD ラット 5 mg/kg 塩基 経口／胃挿管 胆汁排泄 KRB0001（PKC0514） SD ラット（分娩後約 10 日） 3 mg/kg 塩 強制経口 乳汁移行 R4845M-SPD422 （8259362） アカゲザル ビーグル犬 C-アナグレリド 経口（種々の剤形） の薬物動態 塩基 塩基 塩基 アナグレリド塩酸塩一水和物（塩） 0.825 = 塩基 U = 報告が塩酸塩又は塩基のどちらの意味で投与量が表現されているのか不明 6.1 アカゲザルにおける BL-4162A （アナグレリド）の薬物動態（292-063） [4.2.2.2.4] 雌アカゲザルに 14C-アナグレリドを静脈内注入、経口溶液、経口懸濁液、又は経口カプセルで投 与した（n=2／投与剤形）。投与量は、静脈内投与の約 1 mg/kg から他の 3 つの投与剤形の約 3 から 4 mg/kg の範囲であった。投与後 192 時間にわたり尿及び糞を採取し、それら検体中の放射 能濃度を測定した。主要な排泄経路は尿中排泄であり、192 時間の尿中の排泄量は投与量の 54% （カプセル）から 73%（静脈内）であった。すべての投与形態において尿糞中の平均総回収率は、 投与された放射能の 92%であった。静脈内投与及び経口投与した各 1 匹のサルから回収された尿 中アナグレリドの測定によってアナグレリドの広範な代謝が示された。 6.2 14 C-BL-4162A（14C-アナグレリド）経口投与後の実験動物における尿中代謝 物プロファイル（292-060） [4.2.2.4.8] 14 C-アナグレリドを 6 匹のラット（72～78 μg/kg）、2 匹のアカゲザル（48 μg/kg）、2 匹のイヌ（26 ～28 μg/kg）及び一人のヒト（15 μg/kg）に経口投与し、HPLC により尿中代謝物を分析した。ア カゲザルは、排泄経路、速度、量のいずれもヒトに最も類似しており、ヒトの被験者は 72 時間 で投与量の約 70%を尿中に排泄したのに対し、アカゲザルは約 60%であった。ラットとイヌは 24 時間で尿中に投与量のそれぞれ 40%及び 25%を排泄した。アナグレリドはすべての動物種で広範 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 38 of 44 に代謝され、尿中放射能の少なくとも 98%が代謝物の形であった。動物の尿中代謝物プロファイ ルはヒトのプロファイルと質的には類似するが、量的には異なっていた。ヒトで 3 つの主要な代 謝物は、HPLC の溶出順に、投与量の 14%、12%及び 24%であった。これらの代謝物は他の 3 種 の動物の尿中にも存在したが、概して少量であった。 6.3 14 C-アナグレリド：ヒト、ラット及びイヌで得られた代謝物の性質のクロマ トグラフィー検討（X00196-SPD422-IIIG） [4.2.2.4.9] ラットとイヌに投与量 50 mg/kg の 14C-アナグレリドを経口投与した場合、尿中に排泄された放射 能量（投与量に対する%）はラットで 26.5%、カプセル投与したイヌで 2.5%、強制経口投与した イヌで 16.7%であった。糞中排泄量はそれぞれ 79.6%、69.1%及び 84.0%であった。 ラットとイヌの排泄物中に存在する放射性成分をヒト被験者（1 mg[塩基相当量]）のものと比較 した。 ヒトの尿中には 4 つの顕著なピークがあり、 その内 2 つは既知代謝物の RL603 と BCH24426 と一致した。他の 2 つは、使用した HPLC システムではより極性のある物質であった。未変化の 14 C-アナグレリドは検出されなかった。 ラットとイヌの糞中では、アナグレリド標準品と同一位置に溶出される放射性物質が検出され、 これは未吸収の薬物を反映していると考えられた。 6.4 14 C-アナグレリド単回経口投与後のアカゲザルにおける放射能の薬物動態 と排泄（P00228-SPD422-IIIG） [4.2.2.5.1] 3 匹の絶食雄アカゲザルに 4 mg/kg の 14C-アナグレリドを単回経口投与した。その後 168 時間にわ たり血液、尿、糞を採取し、放射能を測定した。血漿中放射能の終末相半減期は約 54 時間、平 均 Tmax は 6 時間、Cmax は 282 ng/g（アナグレリド遊離塩基相当量）であった。平均 AUC0-inf は 12100 ng･hr/g であった。糞中排泄量は投与量の 66%、尿中排泄量は 26%であった。 投与後 6 時間に採取された血漿検体の HPLC 分析によって、総放射能の 47%を占める親化合物の 14 C-アナグレリドと 5 つの代謝物ピークが認められた。この主要な代謝物は総放射能の 34%を占 め、その他の各代謝物は 6%未満であった。プールした 0～96 時間尿の HPLC 分析により 4 つの 代謝物ピークが見出された。 これらの主要な代謝物は総放射能の 66%、又は投与量の 16%であり、 その他の各ピークは総放射能の 12%以下、または投与量の 3%未満であった。アナグレリド未変 化体は尿中には確認できなかった。 血漿中又は尿中の放射性ピークのいずれもヒト尿中代謝物 RL603（2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジ ヒドロキナゾリン）に相当するのもは認められなかった。 6.5 [10a-14C ]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、 胆汁排泄及び代謝物 プロファイリング試験（KRB0001、Phase C） [4.2.2.2.3] 胆管カニュレーション処置ラット 14 C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）を絶食させた雄の胆管カニュレーション処置ラットに 単回経口投与した。フレキシブルカニューレの一端を各ラットの総胆管内に、もう一方を十二指 腸内に挿入し、カニューレループを外に取り出した。投与後 0～2、2～4、4～6、6～24、24～48 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 39 of 44 時間に胆汁を各ラット別々にドライアイスで冷却した容器に採取した。投与後 0～6、6～24、24 ～48 時間に尿を各ラット別々にドライアイスで冷却した容器に採取し、糞は投与後 0～24、24～ 48 時間に採取した。結果を表 27 に示した。 48 時間までに採取された検体中に投与放射能量の計 95.23%が排泄され、この時点の屠殺体内に 平均 1.27%が残存し、投与量に対する平均総回収率は 96.51%となった。胆汁中には投与量の平均 20.39%が 0～48 時間内に排泄され、尿中及び糞中の 0～48 時間における平均排泄量はそれぞれ 39.03%及び 34.72%であった（表 27）。 投与後最初の 6 時間内に投与量の平均 6.79%（総胆汁中放射能の 33%）が胆汁中に排泄された。 この胆汁中排泄率は投与後 24 時間には投与量の 19.91%（総胆汁中放射能の 98%）に増加した。 投与量の平均 0.48%が 24～48 時間に採取された検体から回収されたため、投与後 48 時間以後も 胆汁排泄が続いているものと思われる。平均血漿中放射能濃度は投与後 48 時間には 47.6 ng/g（ア ナグレリド遊離塩基相当）と測定された。48 時間の胆汁中及び尿中排泄放射能量、屠殺体、屠殺 時の消化管壁中の残存放射能量の合計として吸収量を算出すると、経口投与量の少なくとも 60% が吸収されたことになる。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 40 of 44 14 表 27： C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）単回経口投与後 48 時間の胆 管カニュレーション処置絶食雄ラットにおける放射能の排泄率（Phase C） 採取期間（時間） 胆汁中排泄 0～2 2～4 4～6 6～24 24～48 計 1.99 ± 1.60 2.20 ± 1.48 2.59 ± 1.20 13.13 ± 2.20 0.48 ± 0.10 20.39 ± 6.16 （投与量に対す る％） 排泄率 累積排泄率 0～2 0～4 0～6 0～24 0～48 計 1.99 ± 1.60 4.19 ±3.08 6.79 ±4.27 19.91 ±6.11 20.39±6.16 20.39 ±6.16 採取期間（時間） 尿中排泄（投与量に 対する%） 排泄率 累積排泄率 0～6 6～24 24～48 計 8.86 ± 2.27 29.32 ± 5.03 0.85 ± 0.12 39.03 ± 3.04 0～6 0～24 0～48 計 8.86±2.27 38.18±2.94 39.03±3.04 39.03±3.04 採取期間（時間） 糞中排泄（投与量に 対する%） 排泄率 0～24 24～48 計 33.75 ± 4.84 0.97 ± 0.30 34.72 ± 4.81 0～24 0～48 計 33.75 ± 4.84 34.72 ± 4.81 34.72 ± 4.81 累積排泄率 採取期間（時間） ケージ洗浄 総排泄率 0～48 計 1.09± 0.09 1.09± 0.09 95.23± 1.39 表中のデータは平均値±標準偏差（n=3） 6.6 SPD422：ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与した後 の乳汁分泌及び胎盤通過（R4845M-SPD422） [4.2.2.3.6] 18 匹の分娩後の雌授乳ラット（投与時点で分娩約 10 日後）に[14C]-SSP-001001A（3 mg/kg[14Cアナグレリド塩酸塩一水和物]）を単回強制経口投与した。投与後 0.5、1、2、4、8 及び 24 時間 に、3 匹の分娩後ラットから乳汁及び血液を採取し、各検体（乳汁、血漿及び血液）中の放射能 濃度を測定した。 哺乳新生児の母ラットに 14C-アナグレリドを単回経口投与した場合、母ラット血液中の放射能濃 度は母ラットの血漿中濃度より高かった。このことは血液/血漿比に反映され、試験の時間経過に 伴い 1.08 から 13.9 になり、14C-アナグレリド及びその代謝物又はそのいずれかが赤血球に対する 結合親和性を有することが示唆された。放射能の血液、血漿及び乳汁中のピーク濃度（全て投与 後 2 時間）は、それぞれ 894、739 及び 2140 ng/g（アナグレド遊離塩基相当量）であった。乳汁 ／母ラット血漿の濃度比は最大 3.50 まで上昇し、薬物関連物質が容易に乳汁中に移行することが 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 41 of 44 示された。放射能の血液、血漿及び乳汁からの消失半減期はそれぞれ 12.5、4.61 及び 3.42 時間と 推定された。 7. 薬物動態学的相互作用 アナグレリドとその主要な代謝物 RL603 の血漿タンパク結合率はそれぞれ約 75～約 89%及び約 86～約 90% （V00145-SPD422-IIIG 試験及び V00146-SPD422-IIIG 試験）であった。これらの結合 率は、例えば結合率が 99%を超える抗炎症剤のような薬物群と比較すると極端に高い訳ではない ので、タンパク結合部位での置換は薬物－薬物相互作用の作用機序になるとは思われない。 アナグレリドは CYP1A2 に対する中等度の阻害活性（V00232-SPD422-IIIG 試験）を有するので、 初めにテオフィリンやイミプラミン等の主にこの酵素で分解される薬物の同時投与による相互 作用を考慮すべきであろう。 しかし、 アナグレリドの阻害作用は約 20 μM でようやく顕著になり、 典型的な平均 1 日臨床用量である 1 mg（BID）投与後のヒト血漿中濃度の Cmax（約 0.02μM）を 大きく超えるので、このような相互作用の可能性は低いと考えられる。一方、肝臓では吸収過程 でこの濃度を超える可能性もあり、初回通過の過程で同時投与される薬物のクリアランスの阻害 につながる可能性がある。しかし、このような高濃度になるのは一時的なものであると考えられ る。また、定量的なラット組織分布試験では、肝臓／血漿（放射能）濃度比は投与後 2 時間でわ ずか 2.5:1 であった（292-062 試験）。主要な代謝物 RL603 はアナグレリドより CYP1A2 に対す る阻害活性が低い。 アナグレリドは CYP1A2 に対して多少の阻害作用を有するだけでなく、それ自体、この酵素で主 に代謝される（V00183-SPD422-IIIG 試験）。したがって、この酵素のより強力な阻害剤又は誘導 剤を同時投与した場合、アナグレリドのクリアランスを変化させる可能性がある。かかる薬物に は、阻害剤としてフルボキサミンやシプロフロキサシンなど、誘導剤としてオメプラゾールなど があげられる（Eaton et al. 1995）。グレープフルーツジュース（Fuhr & Kummert, 1995）も CYP1A2 を阻害するので、アナグレリドのクリアランスを低下させる可能性がある。これら薬物との臨床 相互作用試験はこれまで実施されておらず、この分野に関する知見は不足している。しかし、患 者では血小板数の減少が許容できるレベルまでアナグレリドの用量が調整されるため、薬物動態 における留意点は同時投与する薬剤であり、理論的に懸念すべき薬剤は治療係数の狭い薬剤であ ろう。ところが、治療係数の狭い薬剤であるワルファリンやジゴキシンの薬物動態に対するアナ グレリドの影響に関する臨床試験（ボランティアに対する単回投与試験）では、これらの症例に おける相互作用は見られていない。 アナグレリドはヒドロキシ尿素と同時投与される可能性があるので、例えば、移行期間中のイヌ における相互作用試験を実施した（D00231-SPD422-IIIG 試験）。臨床的に使用される用量比（総 投与量はアナグレリド 2 mg／ヒドロキシ尿素 500 mg）で投与された時、いずれの薬物について も他の薬物の存在下で薬物動態への影響が見られなかった。 アナグレリドは、PDEIII 阻害作用に起因すると思われる下痢を動物に誘発することが知られてお り（第 2.6.6.3.6 項、第 2.6.6.3.8 項及び第 2.6.6.3.9 項参照）、ヒトでも多少の消化管障害を引き起 こすことが知られている。かかる腸運動性の亢進は、同時投与される薬物の吸収に不利な影響を 与え、有効性を減じる可能性が考えられる。 8. 他の薬物動態試験 この項には該当する試験はない。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL 9. 考察及び結論 9.1 吸収（トキシコキネティクス含む） Page 42 of 44 14 C-アナグレリドのカーボワックス（ポリエチレングリコール 300）溶液をラットに経口又は静脈 内投与（5 mg/kg[塩基相当量]）した場合の糞中放射能排泄率はそれぞれ約 50%、44%と類似する ため、糞中に排泄された物質は不十分な吸収によるものではなく胆汁排泄によってもたらされた ことが示唆される。したがって、アナグレリドの（少なくともカーボワックス溶液中での）ラッ トにおける経口吸収は良好であると考えられる。このことは TC7 細胞（Caco-2 細胞株のサブク ローン）を用いた腸管側から基底膜側への透過性を評価した in vitro 試験にて、アナグレリドの透 過性がプロプラノロールやラニチジンより高いことと一致している。同様に、アカゲザルに 4 mg/kg（塩基相当量）をカプセルで経口投与、又は 1 mg/kg（塩基相当量）を静脈内投与した場合 の尿中の放射能排泄率は、それぞれ 54%、73%であり、経口投与量の少なくとも 74%が吸収され たことを示す。 親薬物アナグレリドによる高い血漿中曝露がラット、イヌ及びウサギで認められた。アナグレリ ドに対する曝露はマウスと霊長類でも認められた。アナグレリド経口投与後のマウス、ラット及 びイヌにおける BCH24426 と RL603 の曝露が観測された。動物の毒性試験におけるアナグレリド のゼロ時間から 24 時間の血漿中薬物濃度－時間曲線下面積（AUC0-24）値は、典型的な平均 1 日 臨床用量である 1 mg（BID）投与後のヒトにおける AUC0-24 値の約 3000 倍であった。 アナグレリドの半減期は検討したすべての動物種で約 1～3 時間と比較的短かった。代謝物 RL603 は動物では同様に短い半減期であったが、ヒトでは幾分長かった（約 8 時間）。ラットとイヌの 反復投与に関してアナグレリドと RL603 の限定的な蓄積（2～3 倍）を示す証拠があるが、確定 的ではない。 9.2 分布 アナグレリドの血漿タンパク結合率はそれぞれの動物種において、ラット約 88%、ウサギ約 75%、 イヌ約 82%、ヒト約 89%であった。14C-アナグレリドをラットに経口投与した場合、すべての組 織における放射能濃度は概して血漿中濃度と同様な推移で減少したことから、アナグレリドとそ の代謝物のいずれも組織には残留しないと考えられた。妊娠ラットに 14C-アナグレリドを経口投 与すると全ての胎児組織中に放射能が検出され、薬物関連物質の胎盤バリア通過性も明確になっ た。 9.3 代謝 アナグレリドの生体内変換は検討したすべての動物種で極めて広範に生じ、未変化体での排泄は ほとんど認められなかった。 ラットとイヌの尿中に BCH24426、RL603 及びキナゾリン環がヒドロキシ化された化合物を含む 少なくとも 5 つの代謝物が存在すると思われた。 ヒトでは代謝はより単純であり、 尿中には RL603 と BCH24426 から成る 2 つの主要成分と、少量の未変化体が存在し、RL603 の抱合体の存在を示 唆する証拠も得られた。一般化したアナグレリド代謝経路の全体像を図 4 に示す。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid CONFIDENTIAL Page 43 of 44 図 4：動物及びヒトにおけるアナグレリドの代謝経路 アナグレリド BCH24426 ラット/イヌ/ヒト Structure 4 RL603 ラット/イヌ/ヒト ラット/イヌ （ヒトなし） グルクロン酸抱合体 ヒト ラットとイヌの尿中に RL603 と BCH24426 が存在することは、代謝の観点から、これらの動物種 がヒトのモデルとして適切であることを支持している。Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9（in vitro 遺 伝毒性試験に使用） はアナグレリドの RL603 及び BCH24426 への広範な代謝を示し、 ゆえに in vitro 遺伝毒性スクリーニングはこれら 2 つのヒト代謝物に対する曝露も含め評価されている。マウス が in vivo 遺伝毒性試験においてアナグレリド及び上記 2 種のヒト代謝物に曝露されることがレト ロスペクティブなトキシコキネティクス試験によって明らかとなった。 種々の発現ヒトチトクローム系を使用した結果、CYP1A1 と CYP1A2 のみがアナグレリドを代謝 すると思われた。 9.4 14 排泄 C-アナグレリドをラットとイヌに投与量 50 mg/kg で強制経口投与した場合、尿中に排泄された 放射能は、 投与量に対してラットで 26.5%、イヌで 16.7%であった。糞中排泄量はそれぞれ 79.6%、 84.0%であった。より低用量を経口投与した場合（ラット：72～78 μg/kg、イヌ：26～28 μg/kg）、 尿中排泄率はラット：40％、イヌ：25％と増加し、高用量では吸収が不完全であることが示唆さ れた。ラットに 14C-アナグレリドを 5 mg/kg で静脈内投与すると、投与量の約 44％が糞中に排泄 され、胆汁排泄の可能性が示唆された。実際、14C-アナグレリド（5 mg/kg[塩基相当量]）を胆管 カニュレーション処置ラットに経口投与した場合、胆汁中には 0～48 時間で投与量に対して平均 20.39%が排泄され、胆汁中に排泄されることが明らかとなった。授乳ラットに 14C-アナグレリド （3 mg/kg[塩基相当量]）を単回経口投与した場合、薬物関連物質が乳汁中に検出され、乳汁移行 が確認された。 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Anagrelid 9.5 CONFIDENTIAL Page 44 of 44 薬物相互作用 アナグレリドはCYP1A2に対する中等度の阻害活性を有するため、テオフィリンやイミプラミン 等の主にこの酵素で分解される他の同時投与薬物との相互作用を引き起こすことを考慮すべき であろう。しかし、アナグレリドのIC50値と臨床のCmaxを比較した結果、相互作用の可能性は低い ことが明らかである。 アナグレリドはCYP1A2に対する多少の阻害作用を有するだけでなく、それ自体、主にこの酵素 によって代謝される。したがって、この酵素のより強力な阻害剤（フルボキサミンやシプロフロ キサシンなど）や誘導剤（オメプラゾールなど）を同時投与した場合、アナグレリドのクリアラ ンスを変化させる可能性がある。しかし、患者は血小板数の減少が許容できるレベルまでアナグ レリドの用量が調整されるため、薬物動態における留意点は同時投与する薬剤であり、理論的に 懸念すべき薬剤は治療係数の狭い薬剤であろう。しかし、ボランティアに対する単回投与後のワ ルファリンやジゴキシンの薬物動態に対するアナグレリドの影響に関する臨床試験では、これら の症例における相互作用は見られていない。 10. 参考文献 Eaton DL, Gallagher EP, Bammler TK & Kunze KL (1995) Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: implications for human variability in expression and enzyme activity. Pharmacogenetics: 5 259-274. Fuhr U & Kummert AL (1995) The fate of naringin in humans: a key to grapefruit juice-drug interactions. Clin. Pharmacol Ther: 58 365-373. アグリリンカプセル 0.5mg 第 2 部（モジュール 2）：CTD の概要（サマリー） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.5 薬物動態概要表 シャイアー・ジャパン株式会社 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL 薬物動態概要表 目次 1. 薬物動態試験一覧 .......................................................................................................................1 2. 分析方法及びバリデーション試験 ...........................................................................................6 3. 薬物動態試験：吸収－in vitro－................................................................................................9 4. 薬物動態試験：吸収－単回投与－ .........................................................................................10 5. 薬物動態試験：吸収－反復投与－ .........................................................................................17 6. 薬物動態試験：分布 .................................................................................................................31 7. 薬物動態試験：タンパク結合 .................................................................................................35 8. 薬物動態試験：妊娠動物における試験 .................................................................................39 9. 薬物動態試験：その他の分布試験 .........................................................................................41 10. 薬物動態試験：可能な代謝経路 .............................................................................................42 11. 薬物動態試験：代謝物 － in vitro － .......................................................................................43 12. 薬物動態試験：代謝物 － in vivo －........................................................................................59 13. 薬物動態試験：薬物代謝酵素の誘導／阻害 .........................................................................68 14. 薬物動態試験：排泄 .................................................................................................................74 15. 薬物動態試験：胆汁中排泄 .....................................................................................................81 16. 薬物動態試験：授乳動物における試験 .................................................................................83 17. 薬物動態試験：薬物相互作用 .................................................................................................84 18. 薬物動態試験：その他 .............................................................................................................85 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 1. CONFIDENTIAL Page 1 of 85 薬物動態試験一覧 (1/5) 被験物質：アナグレリド 試験の種類 吸収－in vitro－ Caco-2 細胞膜透過性の評価 吸収－単回投与－ 尿中排泄放射能測定によるアベイラビ リティ 血漿中放射能濃度の測定 a 動物種／系統 In vitro ***** ラット／Long Evans 経口（強制、混餌） （0.2%トラガカントゴム） 経口（0.5% (w/v) メチルセルロース 溶液） 静脈内（DMSO、PEG400、水： 20、40、40 v/v/v） 経口及び静脈内 （カーボワックス 300、0.2%トラガ カントゴム又はカプセル 経口 （1%カルボキシメチルセルロー ス） 経口 （1%カルボキシメチルセルロー ス） ラット／Crl:CD (SD) IGS BR 経口（混餌） イヌ／ビーグル ウサギ／New Zealand White ラット／SD サル／アカゲザル 血液中アナグレリド濃度の測定 ラット／SD 血漿中アナグレリド濃度の測定 イヌ／ビーグル マウス小核試験サポートのための薬物 及び代謝物曝露の評価 a a GLP 試験 実施施設 TC7 細胞 血漿中放射能濃度の測定 吸収－反復投与－ 4 週間経口（混餌）投与毒性試験におけ る曝露 a 4 週間経口（カプセル）投与毒性試験に おける曝露 a 14 日間反復強制経口投与薬物動態試験 a 投与方法 （溶媒） マウス／Crl:CD-1 (ICR) BR 試験番号 （その他の試験番号） 記載箇所 V00754-SPD422-IIIG (7444) 4.2.2.2.1 ******************** 292-061 (4162-05) 4.2.2.2.2 *********************** KRB0001 (PKC0514) 4.2.2.2.3 ******************** 292-063 (4162-03) 4.2.2.2.4 ********************* 292-067 (88075) 4.2.3.2.1 ********************* 292-059 (89038) 4.2.2.2.5 *********************** R00074-SPD422-IIIA (SRU023) 4.2.3.2.3 経口（ゼラチンカプセル） *********************** D00075-SPD422-IIIG (SRU021) 4.2.3.2.8 経口 （0.5% (w/v) メチルセルロース水溶 液） 強制経口投与 （リン酸緩衝液、pH 6.5） *********************** L00076-SPD422-IIIA (SRU022) 4.2.2.2.6 動物；******************** 分析；***************** *********** M00251-SPD422-IIIG (SRU067, YAH006) 4.2.2.2.7 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 1. CONFIDENTIAL Page 2 of 85 薬物動態試験一覧 (2/5) 被験物質：アナグレリド 試験の種類 吸収－反復投与－ マウス小核試験サポートのための薬物 及び代謝物曝露の追加評価 a 動物種／系統 投与方法 （溶媒） 実施施設 試験番号 （その他の試験番号） 記載箇所 マウス／Crl:CD-1 (ICR) 強制経口 （リン酸緩衝液、pH 6.5） 動物；************ 分析；****************** ***************** M4887M-SPD422 (SPD0401) 4.2.2.2.8 ラット／SD 静脈内、強制経口 *********************** KRB0002 (PKC0716) 4.2.2.2.9 分布 マスバランス及び組織分布試験 ラット／SD 強制経口及び静脈内（カーボワック ス 300） ******************** 292-062 (4162-04) 4.2.2.3.5 血漿及び主要組織分布試験 a ラット／SD 経口（胃挿管）（0.5% (w/v) メチル セルロース溶液） *********************** KRB0001 (PKC0514) 4.2.2.2.3 In vitro - *********************** V00150-SPD422-IIIG (SRU041) 4.2.2.3.1 ラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおけ る in vitro 血漿タンパク結合 a In vitro - *********************** V00145-SPD422-IIIG (SRU039) 4.2.2.3.2 RL603 の非特異的結合並びにラット、 ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合の評価 In vitro - *********************** V00146-SPD422-IIIG (SRU040) 4.2.2.3.3 アナグレリド及び BCH24426 のヒト血 漿タンパク結合率に関する検討 妊娠動物における試験 14 C-アナグレリド塩酸塩一水和物のラッ ト単回経口投与後の胎盤通過 a In vitro - ********************** V00851-SPD422IIIG(CYP0085_R5) 4.2.2.3.4 R4845M-SPD422 (8259362) 4.2.2.3.6 単回静脈内投与並びに単回及び反復経 口投与後の薬物動態試験 a タンパク結合 非特異的結合並びにラット、ウサギ、 イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タン パク結合の予備的評価 a GLP 試験 ラット／SD 強制経口 （0.5%ヒドロキシメチルセルロース 溶液） ************************* （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 1. CONFIDENTIAL Page 3 of 85 薬物動態試験一覧 (3/5) 被験物質：アナグレリド 試験の種類 投与方法 （溶媒） 動物種／系統 可能な代謝経路 可能な代謝経路の推定 - 代謝物－in vitro－ In vitro 代謝の比較 －ヒト肝細胞－a 実施施設 試験番号 （その他の試験番号） 記載箇所 - ************************* X00187-SPD422-IIIG 4.2.2.4.1 In vitro DMF（14C-アナグレリド塩酸塩用） 又は DMSO（アナグレリド塩酸塩及 び RL603 用） ************************* V00121-SPD422-IIIG (SRU038) 4.2.2.4.2 発現ヒトチトクローム P450 による可能 な代謝の検討 In vitro ************************* V00183-SPD422-IIIG (SRU051) 4.2.2.4.3 ヒト消化管内細菌叢による可能な代謝 の検討 In vitro DMSO（CYP1A2 用）、アセトン （CYP2C9 用）又はメタノール （CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 用） DMF ************************* V00172-SPD422-IIIG (SRU045) 4.2.2.4.4 ヒト肝及び腸ミクロソームを用いた in vitro 代謝予備試験 In vitro アセトニトリル ************************* V00261-SPD422-IIIG (SPD/08) 4.2.2.4.6 Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラク ションを用いた in vitro 代謝予備試験 In vitro アセトニトリル ************************* V00292-SPD422-IIIG (SPD/11) 4.2.2.4.7 In vitro 代謝に影響する要因の評価 In vitro DMSO ********************** 4.2.2.4.13 アナグレリド代謝に関わるヒトチトク ローム P450 の同定 In vitro DMSO ******************** V00855-SPD422 (CYP0085_R7) PK0702 a GLP 試験 4.2.2.4.14 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 1. CONFIDENTIAL Page 4 of 85 薬物動態試験一覧 (4/5) 被験物質：アナグレリド 試験の種類 代謝物－in vivo－ 経口投与後の実験動物における尿中代 謝物プロファイル 動物種／系統 投与方法 （溶媒） 実施施設 ラット／Long Evans（雄） サル／アカゲザル（雌） イヌ／ビーグル（雄） ヒト 強制経口（ラット、イヌ）；強制経 鼻胃（サル） （カーボワックス 400） ******************** 代謝物の性質に関するクロマトグラ フィー検討 a ラット／SD、Crl:CD BR イヌ／ビーグル、Hsd:DOBE 強制経口（ラット及び 1 匹のイヌ） 経口、カプセル（ヒト及び 1 匹のイ ヌ）、 （1%メチルセルロース［強制経 口］） ヒト血漿中及び尿中のアナグレリド推 定代謝物の検討 シャイアー社プロトコール AGR-1-01-J によるヒト被験者か らの血漿と尿 Roberts プロトコール 13,970107A によるヒト被験者からの 尿 乾燥イヌ尿抽出物 ラット尿中のアナグレリド推定代謝物 の検討 経口投与後のラット尿抽出物 ラット単回投与後の代謝物プロファイ リング試験 a ラット／SD イヌ尿中のアナグレリド推定代謝物の 検討 a GLP 試験 試験番号 （その他の試験番号） 記載箇所 292-060 (817-BL-4162-06) 4.2.2.4.8 ************ X00196-SPD422-IIIG (SPD/05) 4.2.2.4.9 - ************************** ******** X00281-SPD422-IIIG (YAH/004h) 4.2.2.4.10 - ************************** ******** D00313-SPD422-IIIG (YAH/004/d) 4.2.2.4.11 - ************************** ******** R00312-SPD422-IIIG (YAH/004/r) 4.2.2.4.12 KRB0001 (PKC0514) 4.2.2.2.3 経口（胃挿管） （0.5% (w/v) メチルセルロース溶 液） *********************** （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 1. CONFIDENTIAL Page 5 of 85 薬物動態試験一覧 (5/5) 被験物質：アナグレリド 試験の種類 薬物代謝酵素の誘導／阻害 In vitro 代謝に関わるチトクローム P450 の誘導試験 ラット培養肝細胞を用いたアナグレリ ド及びその代謝物 BCH24426、RL603 の 肝 CYP450 酵素誘導能の評価 a 投与方法 （溶媒） 動物種／系統 実施施設 In vitro DMSO ********************** In vitro DMSO ************************* ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対する アナグレリド及びその代謝物 RL603 の 作用の in vitro 探索試験 a 排泄 アカゲザルにおける薬物動態試験 In vitro - ***************** サル／アカゲザル ******************** 代謝物の性質のクロマトグラフィー検 討a ラット／SD、Crl:CD BR イヌ／ビーグル、Hsd:DOBE 放射能の薬物動態及び排泄 a サル／アカゲザル 静脈内（カーボワックス 300） 経口（カーボワックス 300、0.2%ト ラガカントゴム） 強制経口（ラット及び 1 匹のイヌ） 経口、カプセル（ヒト及び 1 匹のイ ヌ）、 （1%メチルセルロース［強制経 口］） 強制経口 （0.2%トラガカントゴム） 胆汁中排泄 ラットにおける胆汁中排泄 a ラット／SD 経口（胃挿管） （0.5% (w/v) メチルセルロース溶 液） *********************** ラット／SD 強制経口 （0.5%ヒドロキシメチルセルロース 溶液） ************************* 授乳動物における試験 14 C-アナグレリド塩酸塩一水和物のラッ ト単回経口投与後の乳汁移行 a a GLP 試験 試験番号 （その他の試験番号） 記載箇所 V00852-SPD422-IIIG (CYP0085_R6) 4.2.2.4.15 V01233M-SPD422 (SPD/13) 4.2.2.4.16 V00232-SPD422-IIIG (201254) 4.2.2.4.5 292-063 (4162-03) 4.2.2.2.4 *********** X00196-SPD422-IIIG (SPD/05) 4.2.2.4.9 ************************* P00228-SPD422-IIIG (6988-100) 4.2.2.5.1 KRB0001 (PKC0514) 4.2.2.2.3 R4845M-SPD422 (8259362) 4.2.2.3.6 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 2. CONFIDENTIAL Page 6 of 85 分析方法及びバリデーション試験 アナグレリド (1/3) 系統 分析対象物質 サンプルマトリックス マウス アナグレリド 血漿 マウス ラット ラット ラット ラット ウサギ イヌ イヌ イヌ 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 検体容量（mL） 前処置 0.02 タンパク沈殿 0.025 タンパク沈殿 0.1 液-液抽出 0.1 固相抽出 0.05 固相抽出 0.025 タンパク沈殿 0.2 液-液抽出 0.5 液-液抽出 0.2 固相抽出 0.05 固相抽出 アッセイ 内部標準物質 LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS 13 C3-アナグレ リド LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS 13 C3-アナグレ リド LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS クアジノン 250～10000 0.9988 20.0～10000 >0.996 0.5～250 5～5000 >0.995 0.1～50 0.9964 20.0～10000 >0.995 0.25～125 >0.994 0.1～50 >0.992 1～1000 5～1000 バッチ内／分析（n） 真度（%） 精度（%） バッチ間／分析（n） 真度（%） 精度（%） 安定性 6 97.2～104 1.8 ～9.1 19 時 間 （ 室 温） 6 -1.8～6.4 1.0～3.8 6 -6.4～-1.8 3.2～4.8 24 時 間 （ 室 温) 6 -9.3～2.6 7.9～9.6 1 ヶ月 （-20℃） 6 94.3～108.9 4.4～5.9 6 94.3～108.8 4.6～8.5 16 時間 b 6 -5.1～5.1 2.8～7.8 18 -5.0～5.0 4.7～11.6 24 時 間 （ 室 温） 6 -4.4～1.2 1.7～3.5 6 -4.4～1.0 2.8～14.6 24 時間（室 温） 6 -1.3～6.1 3.5～10.9 2 時間 （22℃） 5～6 -3.8～6.6 6.4～13.9 17～18 1.4～5.0 6.1～10.1 1 ヶ月 （-20℃）c 6 -4.0～5.5 4.0～8.5 18 -4.0～5.4 4.4～11.7 2 ヶ月 （-20℃）d 6 -13.6～3.4 2.8～4.7 - 試験番号 （その他の試験番号） A00249SPD422-IIIG (YAH/005) e A4881MSPD422 (YAH/234) e A00090SPD422-IIIG (SRU/030) e A00770SPD422-IIIG (YAH/038) e YBU/013 e A4880MSPD422 (YAH/236) e A00114SPD422 (SRU029) e A00072SPD422-IIIG (SRU/027) e YBU/008 e A01177MSPD535 (YAH/072) 直線性 定量範囲（ng/mL） 4.2.2.1.1 4.2.2.1.2 4.2.2.1.3 4.2.2.1.4 記載箇所 a 1,4-ジクロロ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,8-エタノフタラジン b 室温（遮光）最大 16 時間、及び最大 4 回の凍結融解サイクル操作時 c 室温（約 22℃）2 時間、約-20℃で少なくとも 1 ヶ月、及び 3 回の凍結融解サイクル後 d 室温最大 24 時間、及び 4 回の凍結融解サイクル操作時 e GLP 試験 - = 報告書には記載なし 4.2.2.1.5 4.2.2.1.6 4.2.2.1.7 4.2.2.1.8 4.2.2.1.9 4.2.2.1.10 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 2. CONFIDENTIAL Page 7 of 85 分析方法及びバリデーション試験 (2/3) RL603 系統 分析対象物質 サンプルマトリックス マウス RL603 血漿 マウス ラット ラット ラット ラット ウサギ イヌ イヌ イヌ 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 血漿 - 検体容量（mL） 前処置 0.02 タンパク沈殿 0.025 タンパク沈殿 0.1 液-液抽出 0.1 固相抽出 0.05 固相抽出 0.025 タンパク沈殿 0.2 液-液抽出 0.5 液-液抽出 0.2 固相抽出 - アッセイ 内部標準物質 LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS C 2H2 15N3RL603 LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS C 2H2 15N3RL603 LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS ジクロロフタ ラジン a LC-MS/MS クアジノン - 250～10000 0.9834 2.00～1000 >0.998 0.5～250 >0.987 0.1～50 0.9948 2.00～1000 >0.998 0.25～125 >0.995 0.1～50 バッチ内／分析（n） 真度（%） 精度（%） バッチ間／分析（n） 真度（%） 精度（%） 安定性 6 84.8～101 3.5～9.6 19 時 間 （ 室 温） 6 1.8～6.3 5.9～8.5 6 1.8～6.4 5.7～9.5 6 時間（室 温） 6 -7.1～4.8 6.9～11.4 1 ヶ月 （-20℃） 6 88.3～99.3 6.0～11.7 6 88.3～99.2 6.6～17.7 16 時間 b 6 -6.5～12.5 6.1～14.2 18 -6.4～12.4 7.3～15.0 7 時間（室 温） 6 -3.9～-1.5 2.2～2.8 6 -4.0～-1.5 2.7～3.7 24 時 間 （ 室 温） 6 -2.3～5.9 3.2～8.1 2 時間 （22℃） 5～6 -4.2～2.1 6.2～8.8 17～18 0.1～4.2 6.6～9.3 1 ヶ月 （-20℃）c 6 -10.7～5.3 5.8～8.9 18 -9.6～6.0 6.5～16.4 2 ヶ月 （-20℃）d 試験番号 （その他の試験番号） A00249SPD422-IIIG (YAH/005) e A4881MSPD422 (YAH/234) e A00090SPD422-IIIG (SRU/030) e A00770SPD422-IIIG (YAH/038) e YBU/013 e A4880MSPD422 (YAH/236) e A00114SPD422 (SRU029) e A00072SPD422-IIIG (SRU/027) e YBU/008 e 直線性 定量範囲（ng/mL） 13 5～5000 4.2.2.1.1 4.2.2.1.2 4.2.2.1.3 4.2.2.1.4 記載箇所 a 1,4-ジクロロ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,8-エタノフタラジン b 室温（遮光）最大 16 時間、及び 4 回までの凍結融解サイクル操作時 c 室温（約 22℃）2 時間、約-20℃、少なくとも 1 ヶ月、及び 3 回の凍結融解サイクル後 d 室温最大 24 時間、及び 4 回の凍結融解サイクル操作時 e GLP 試験 - = 報告書には記載なし 4.2.2.1.5 13 4.2.2.1.6 4.2.2.1.7 4.2.2.1.8 >0.997 1～1000 4.2.2.1.9 - A01177MSPD535 (YAH/072) 4.2.2.1.10 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 2 CONFIDENTIAL Page 8 of 85 分析方法及びバリデーション試験 (3/3) BCH24426 系統 分析対象物質 サンプルマトリックス 検体容量（mL） 前処置 マウス BCH24426 - マウス ラット ラット ラット 血漿 0.025 タンパク沈殿 - 血漿 0.1 固相抽出 血漿 0.05 固相抽出 LC-MS/MS C3-ヒロドキ シアナグレリ ド - LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS クアジノン ラット ウサギ イヌ - LC-MS/MS C3-ヒロドキ シアナグレリ ド 血漿 0.025 タンパク沈殿 イヌ イヌ - 血漿 0.2 固相抽出 血漿 0.05 固相抽出 - - LC-MS/MS クアジノン LC-MS/MS クアジノン アッセイ 内部標準物質 - 直線性 定量範囲（ng/mL） - 0.9982 20.0～10000 - 5～5000 >0.994 0.25～125 0.9955 20.0～10000 - - バッチ内（n） 真度（%） 精度（%） バッチ間（n） 真度（%） 精度（%） 安定性 - 6 -2.0～1.3 2.2～5.5 6 -2.0～1.3 2.7～7.4 24 時 間 （ 室 温） - 6 86.1～104.7 6.7～14.6 6 86.0～104.8 9.1～14.3 16 時間 a 6 -12.3～13.5 3.6～13.9 18 -12.8～13.6 4.1～15.9 13 時 間 （ 室 温） 6 -2.6～-8.1 1.7～5.1 6 -8.0～-2.7 2.5～6.6 24 時 間 （ 室 温） - - A00770SPD422-IIIG (YAH/038) c YBU/013 c A4880MSPD422 (YAH/236) c A00114SPD422 (SRU029) c 4.2.2.1.6 4.2.2.1.7 試験番号 （その他の試験番号） A00249SPD422-IIIG (YAH/005) c 13 A4881MSPD422 (YAH/234) c A00090SPD422-IIIG (SRU/030) c 4.2.2.1.1 4.2.2.1.2 4.2.2.1.3 記載箇所 a 室温（遮光）最大 16 時間、及び 4 回までの凍結融解サイクル操作時 b 室温最大 24 時間、及び 4 回の凍結融解サイクル操作時 c GLP 試験 - = 報告書には記載なし 4.2.2.1.4 4.2.2.1.5 13 A00072SPD422-IIIG (SRU/027) c 4.2.2.1.8 >0.996 1～1000 5～1000 6 -6.6～10.0 4.5～8.9 18 -6.6～10.0 7.1～14.7 2 ヶ月 （-20℃）b 6 -11.2～2.3 3.2～14.1 - YBU/008 c A01177MSPD535 (YAH/072) 4.2.2.1.9 4.2.2.1.10 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 3. CONFIDENTIAL Page 9 of 85 薬物動態試験：吸収－in vitro－ アナグレリドの Caco-2 細胞膜透過性の評価 報告書の表題：Investigation of permeability of Anagrelide through Caco-2 cell membranes 被験物質：アナグレリド 試験番号：V00754-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.1 生物材料の由来： 溶媒（作用溶液）： アッセイ系： 試験濃度： 標準薬物： 20 代から 40 代の継代期にある培養 13 日目から 25 日目の培養単層 TC7 細胞 1%DMSO（A：腸管側）、5mM HBSS-HEPES（B：基底膜側） HPLC-MS スクリーニング（HPLC-UV/VIS 及び HPLC-MS/MS 又はそのいずれか）を使用する A-B 透過性 50 µM in HBSS、1%DMSO プロプラノロール、ラニチジン、及びビンブラスチン（A-B 及び B-A 透過性）、 細胞単層膜の完全性を検討するため、14C-マンニトール（約 4 µM）も作用溶液に含有させた。 重要な知見： 化合物 試験濃度（µM） 平均 TC7 透過性（10-6 cm/s） 回収率（%） アナグレリド 50 65.1 54 プロプラノロール 50 29.2 69 ラニチジン 50 0.8 77 ビンブラスチン 50 0.3 166 結論： 透過性の値はプロプラノロール及びラニチジンより高く、アナグレリドが高い透過性を有する化合物であることが明らかとなった。 注：ドナーの検体採取時間：0、120 分。レシーバーの検体採取時間：120 分。アッセイは各化合物 2 回実施した。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL 4. 薬物動態試験：吸収－単回投与－ 4A 実験用ラット飼料からのアベイラビリティ Page 10 of 85 報告書の表題：Availability of 14C-BL-4162A from laboratory rat diet 被験物質：14C-アナグレリド 試験番号：292-061 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.2 動物種／系統： 性別及び 1 群当たりの動物数 摂食状態： ラット／Long Evans 雄、5 匹 － 雄、5 匹 14 C-薬物-飼料混合物 （ピュリナ実験動物用粉末飼料） げっ歯類用飼料 混餌投与 2.39 b 溶媒／投与形態： 0.2%トラガカントゴム a 投与方法： 強制経口投与 2.36 投与量（mg/kg/日[塩基相当量]） 検体： 尿 分析対象物質： 放射能 HPLC アッセイ系： PK パラメータ： 検体採取時間（h） 0～24 24～48 48～72 0～24 40.4 ± 3.9 1.0 ± 0.4 0.3 ± 0.1 35.3 ± 3.4 摂取投与量に対する尿中放射能% 結論：飼料からのアナグレリドのアベイラビリティ（尿中放射能から測定）は経口懸濁液投与と統計的に有意差は無かった（スチューデント t-検定） 24～48 0.9 ± 0.5 48～72 0.2 ± 0.2 注： a 最初に、カーボワックス 300 中の溶液を 5 匹のラットに経口投与したところ下痢を発生したため、代わりにトラガカントゴムを追加の動物に使用したところ、下痢は一匹も発生しなかった。 b 飼料 1 グラム当たり 100 µg のアナグレリドをラットに与えた。これらの動物の摂餌量は強制経口投与時の投与量の算定に使用した。1g の摂餌量につき、200 µg/mL の被験物質懸濁液 0.5 mL を 強制経口投与した。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL 4B [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態試験、胆汁中排泄、 及び代謝物プロファイリング試験（Phase A、及び Phase B） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing Page 11 of 85 (1/2) 被験物質：[10a-14C]KRN654 （14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 動物種／系統： 性別及び 1 群当たりの動物数： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 投与量： 検体及び採取ポイント： 分析対象物質： アッセイ系： PK パラメータ： 平均投与量（mg/kg[塩基相当量]） Cmax（ng/mL[遊離塩基相当量]） Tmax（hr） AUCt（ng·h/mL[遊離塩基相当量]） AUC0-24（ng·h/mL[遊離塩基相当量]） AUC（ng·h/mL[遊離塩基相当量]） λz（消失速度定数、時間-1） t1/2（時間） F（全身アベイラビリティ） ラット／SD[Crl:CD(SD)] 雄、3 匹 絶食 経口投与用：0.5% (w/v) メチルセルロース溶液 静脈内投与用：DMSO、PEG400、水（20、40、40 v/v/v） 胃挿管による経口投与及び静脈内投与（尾静脈内ボーラス注射） 経口：5 mg/kg（塩基相当量）、静脈内：0.1 mg/kg（塩基相当量） 血漿 （動物）薬物動態試験用血液採取：経口投与後 15、30、45 分及び 1、2、3、4、6、8、24、48、72 時間 ：静脈内投与後 5、10、15、30 分及び 1、2、4、6、8、24、48、72 時間 放射能 放射能は全てWallac 1409自動液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer Life & Analytical Sciences、Cambridge）を用いる液体シン チレーション分析法により測定した。 経口（3 匹） 静脈内（3 匹） 5.25 0.109 1800 101a 4 21300 209 21300 209 21900 212 0.0298 0.0427 23.3 16.2 2.1 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL 4B [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態試験、胆汁中排泄、 及び代謝物プロファイリング試験（Phase A、及び Phase B） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing Page 12 of 85 (2/2) 被験物質：[10a-14C]KRN654 （14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 血漿中濃度（ng/mL[遊離塩基相当量]） 経口（3 匹） 静脈内（3 匹） 検体採取時間（時間） 0.083 97.3 ± 17.7 0.167 93.9 ± 3.5 0.25 266 ± 21 91.3 ± 16.2 0.5 491 ± 170 64.7 ± 3.7 0.75 701 ± 52 1 686 ± 259 42.8 ± 12.7 2 1310 ± 176 18.5 ± 0.5 3 1320 ± 250 4 1800 ± 305 8.79 ± 2.10 6 1550 ± 333 4.38 ± 0.64 8 1050 ± 291 3.78 ± 0.87 24 79.3 ± 4.6 0.993 ± 0.156 48 32.1 ± 6.1 0.327 ± 0.042 72 19.0 ± 1.7 0.128 ± 0.112b 結論：本試験の結果から、14C-アナグレリドを絶食雄ラットに単回経口投与（懸濁液）した後ゆっくりと吸収され、投与 4 時間後に平均血漿中最高放射能濃度に達することが示された。 注： 平均 ± 標準偏差 a 時間 0 の濃度 b 1 匹の動物では放射能を検出せず（平均値を算出する場合は 0 とした） - = 血液を採取せず 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 4C CONFIDENTIAL Page 13 of 85 アカゲザルにおける薬物動態 (1/2) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Disposition of BL-4162A in the rhesus monkey 試験番号：292-063 動物種／系統： 性別及び 1 群当たりの匹数 摂餌条件： 溶媒／投与形態： 投与方法： 動物番号： 投与量（mg/kg[塩基相当量]）： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： PK パラメータ： Cmax（µg/mL[塩基相当量]） Tmax（hr） t1/2（hr） AUC 0-無限大（µg･hr/mL[塩基相当 量]） 分布容積（L） 終末相消失速度定数（時間-1） 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 0～12 時間 12～24 時間 24～48 時間 48～72 時間 72～144 時間 144～192 時間 合計 0～192 時間 サル／アカゲザル 雌、2 匹 絶食 カーボワックス 300／溶液 経口（溶液） 1 2 4.0 3.5 血漿 放射能 HPLC サル／アカゲザル 雌、2 匹 絶食 0.2%トラガカントゴム／懸濁液 経口（懸濁液） 3 4 4.2 3.2 血漿 放射能 HPLC サル／アカゲザル 雌、2 匹 絶食 -／カプセル 経口（カプセル） 5 3.9 6 4.9 血漿 放射能 HPLC CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.4 サル／アカゲザル 雌、2 匹 絶食 カーボワックス 300／静脈内 静脈内 7 8 0.87 0.82 血漿 放射能 HPLC 該当せず 該当せず 1.4 6.9 40 0.75 12 35 0.90 4.9 62 0.60 2.9 41 0.71 26 41 0.79 1.2 74 45 69 0.39 0.25 0.23 0.20 0.30 0.28 0.29 0.34 2.5 0.017 4.1 0.020 4.3 0.011 5.0 0.017 3.3 0.017 3.4 0.009 2.9 0.015 2.0 0.010 尿 C（投与量に対する％） HPLC 22.5 12.9 19.1 14.0 13.7 20.7 6.1 7.3 1.7 2.9 0.2 0.1 63.3 57.9 14 尿 C（投与量に対する％） HPLC 25.7 36.0 11.0 11.7 15.4 7.7 4.5 2.0 1.0 0.5 0.2 0.1 57.8 58.0 14 尿 C（投与量に対する％） HPLC 4.5 25.2 24.5 16.6 16.1 9.4 5.8 1.6 2.3 0.8 0.1 0.2 53.3 53.8 14 尿 C（投与量に対する％） HPLC 64.9 23.8 3.7 31.0 2.4 13.0 1.0 2.4 0.7 1.5 0.2 0.3 72.9 72.0 14 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 4C CONFIDENTIAL Page 14 of 85 アカゲザルにおける薬物動態 (2/2) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Disposition of BL-4162A in the rhesus monkey 試験番号：292-063 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.4 検体： 糞 糞 糞 糞 14 14 14 14 分析対象物質： C（投与量に対する％） C（投与量に対する％） C（投与量に対する％） C（投与量に対する％） HPLC HPLC HPLC HPLC アッセイ系： 11.3 0.6 0.8 19.0 0.0 24.6 14.2 0～24 時間 糞なし 5.3 4.5 28.5 9.7 14.3 15.9 7.4 11.5 24～48 時間 8.8 25.1 5.0 1.5 14.5 2.6 1.6 3.7 48～72 時間 6.3 3.5 0.6 0.6 6.3 0.5 0.4 1.2 72～144 時間 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 144～192 時間 31.9 33.8 35.0 30.9 35.2 43.8 23.6 16.6 合計 0～192 時間 95.2 91.7 92.8 88.9 88.5 97.6 96.5 88.6 総回収率 0～192 時間 結果： 血漿中放射能濃度は血液中濃度より高く、同様に推移した。血液中の細胞フラクションは総放射能の 10～20%を占めるのみであった。親化合物は血漿中放射能の 50%以上を占めた。 Tmax 時点では投与量の 1～2%のみが血漿中に存在した。尿中放射能に占める親化合物の割合はわずか 3%以下であった。 結論： AUC はすべての経口投与形態及び静脈内投与経路で似ていた。アナグレリドは比較的ゆっくりと吸収され、広く分布し、広範に代謝された。主要な排泄経路は尿経由であった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 4D CONFIDENTIAL Page 15 of 85 懸濁液経口投与後のラット血液中濃度の予備試験 報告書の表題：Anagrelide: oral toxicologic range-finding study in rats 被験物質：アナグレリド 試験番号：292-067 CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.1 動物種／系統： ラット／SD (Crl: CD(SD) BR COBS) 摂餌条件： 記載なし 溶媒／投与形態： 1%カルボキシメチルセルロース／懸濁液 投与方法： 強制経口投与 検体： 血液 分析対象物質： アナグレリド HPLC-UV アッセイ系： 200 500 投与量（mg/kg）： 性別及び 1 群当たりの動物数： 雄 3匹 雄 2匹 1 2 3 4 5 動物番号： 6.0 5.2 4.9 2.7 2.7 Cmax（µg/mL） 7 5 5 7 7 Tmax（h） 23.7 24.1 27.0 10.0 10.6 AUC0-7（µg·h/mL） 72.9 44.2 50.0 AUC0-24（µg·h/mL） 結論： アナグレリド吸収量は投与量とは比例せず、予想より少なかった。500 mg/kg 又は 1000 mg/kg の総曝露量は 200 mg/kg より少なかった。 注： 500 mg/kg、1000 mg/kg 投与用の調製液は濃厚で、シェービングクリームの稠度を有していた。 1000 雄 2匹 7 2.2 7 7.5 41.0 8 4.9 24 11.2 80.6 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 4E CONFIDENTIAL Page 16 of 85 懸濁液経口投与後のイヌの血漿中濃度 報告書の表題：Anagrelide plasma concentrations in dogs after oral administration of suspension doses (50, 100, 200, and 400 mg/kg) 被験物質：アナグレリド 試験番号：292-059 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.5 動物種／系統： イヌ／ビーグル 性別及び 1 群当たりの匹数： 雄 2匹 摂餌条件： 記載なし 溶媒／投与形態： 1%カルボキシメチルセルロース／懸濁液 投与方法： 強制経口投与 検体： 血漿 分析対象物質： アナグレリド HPLC-UV アッセイ系： 方法の概略： UV 検出を付属する HPLC 法につき、直線性、日内・日間の真度、精度、回収率及び安定性（室温及びフリーザー）をバリデートした。検出限界は 0.05 µg/mL であった。投与後 0、0.5、1、1.5、 2、3、5、7、10、24 時間に採取した検体につき血漿中濃度を測定した。 50 100 200 400 投与量（mg/kg）： 1 2 3 4 5 6 7 8 動物番号： 0.25 0.28 0.91 0.36 1.5 1.5 7.4 5.2 Cmax（µg/mL） 3 5 1.5 1.0 1.5 3.0 3.0 2.0 Tmax（h） 8.7 a 1.4 b 2.1 a 8.0 c 5.2 c T1/2（h） 1.1 1.7 6.5 2.5 4.8 7.2 59 32 AUC（µg·h/mL） 0～10h 3.7 4.8 8.3 106 43 0～24h 4.7 4.8 7.7 124 45 無限大 267 545 433 45 94 Cltb（L/h） 推定代謝物： 投与後、0.5 時間から 10 又は 24 時間に得られた投与検体においてアナグレリドの前にもう一つのピークが溶出した。このピークをアナグレリド相当で換算 して算出した推定 Cmax 及び AUC のアナグレリドに対する比率を算定した。この比率はそれぞれ 50 mg/kg の 0.8、0.7 から 400 mg/kg の 0.2 から 0.3 に減少し た。 結論： 吸収速度と吸収量にばらつきが認められた。高用量（400 mg/kg）のデータは 200 mg/kg を超える用量では代謝が飽和することを示唆している。 注： a 最終ポイントは 10 時間 b 最終ポイントは 7 時間 c 最終ポイントは 24 時間 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5. 5A CONFIDENTIAL Page 17 of 85 薬物動態試験：吸収－反復投与－ ＣＤラット混餌投与毒性試験における 4 週間 PK データ (1/2) 報告書の表題：Anagrelide HCl: Toxicity study by oral (dietary) administration to CD rats for 4 weeks 被験物質：アナグレリド 試験番号：R00074-SPD422-IIIA 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 試験デザイン 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） サテライト動物数 到達用量 （mg/kg/日[塩相当量]） Cmax アナグレリド （ng/mL） Tmax（GMT） Cmin （ng/mL） Tmin（GMT） Cmax/Cmin AUC24 （ng·h/mL） Day 3b Week 4 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.3 ラット／Crl:CD (SD) IGS BR 混餌 Special Diet Services 社の Rat and Mouse No. 1 Maintenance Diet 混餌 血漿 アナグレリド及び RL603a LC-MS/MS バリデートされた LC-MS/MS 法を用いてアナグレリド及び RL603 a の血漿中濃度を測定するため、サテライト試験動物を血漿薬物動態の評 価用に供した。Day 2 と Day 28（グリニッジ標準時[GMT]にて 16.00 時から 16.00 時の間）に 3 時間間隔で検体を採取した。検体採取はラッ ト 3 匹／性／群／1 時点とした。 雄 雌 5 50 120 360 5 50 120 360 10 10 10 10 10 10 10 10 4.5 34.2 65.6 154.4 3.9 33.9 63.2 169.4 4.6 46.2 111.5 330.2 4.8 48.1 114.3 324.9 14.44 445.73 1599.73 3236.85 13.07 247.73 1259.63 2802.84 37.05 2303.40 5236.46 5853.74 57.18 1051.38 2680.03 5254.00 22:00 01:00 22:00 19:00 04:00 19:00 19:00 07:00 22:00 22:00 04:00 16:00 13:00 07:00 22:00 22:00 4.60 100.44 367.70 1323.12 6.13 68.15 306.47 1026.01 9.96 675.85 2738.07 3989.07 8.16 106.03 847.71 2129.93 13:00 13:00 16:00c 07:00 16:00c 13:00 13:00 01:00 13:00 13:00 10:00 13:00 19:00 13:00 13:00 10:00 3.1 4.4 4.4 2.4 2.1 3.6 4.1 2.7 3.7 3.4 1.9 1.5 7.0 9.9 3.2 2.5 250 6532 21203 50082 242 3552 21477 43403 583 34165 87654 119319 634 11670 44655 90018 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5A CONFIDENTIAL Page 18 of 85 ＣＤラット混餌投与毒性試験における 4 週間 PK データ (2/2) 報告書の表題：Anagrelide HCl: Toxicity study by oral (dietary) administration to CD rats for 4 weeks 被験物質：アナグレリド 試験番号：R00074-SPD422-IIIA 雄 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） サテライト動物数 Cmax RL603 （ng/mL） Tmax（GMT） Cmin （ng/mL） Tmin（GMT） Cmax/ Cmin AUC24 （ng·h/mL） 代謝物の比率 e Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 Day 2 Day 28 5 10 11.82 18.69 01:00 22:00 4.33 7.60 13:00 13:00 2.7 2.5 210 327 1.00 0.66 50 10 542.81 1093.71 22:00 07:00 70.25 633.19 13:00 19:00 7.7 1.7 6388 19172 1.16 0.67 120 10 2060.24 2186.42 22:00 19:00 581.78 1486.04 16:00c 10:00 3.5 1.5 32155 43854 1.80 0.59 360 10 1729.56 2603.06 19:00 16:00 708.75 2190.13 16:00c 07:00 2.4 1.2 29604 56922 0.70 0.57 5 10 11.11 38.05 01:00 13:00 4.62 7.03 16:00d 19:00 2.4 5.4 190 394 0.93 0.74 CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.3 雌 50 120 360 10 10 10 150.94 970.18 1556.94 589.36 1674.74 2196.05 04:00 04:00 07:00 16:00 19:00 22:00 37.40 399.04 854.86 192.41 932.03 1409.67 16:00c 16:00d 01:00 13:00 10:00 13:00 4.0 2.4 1.8 3.1 1.8 1.6 2528 15553 28241 9732 29608 45736 0.84 0.86 0.77 0.99 0.79 0.60 結論： アナグレリドと代謝物 RL603 の血漿中濃度は 24 時間にわたり維持された。この濃度維持は長時間に及ぶ摂餌と溶解速度律速による吸収又はそのいずれかによるものと思われる。アナグレリドと RL603 の曝露は用量増加に比例する以上に増加し、アナグレリドと RL603 の排泄能力に限界があることが示唆された。雌動物の曝露は雄動物に比べ低かった。反復投与により蓄積性が低用量（5 及び 50 mg/kg/日）で認めらたが、高用量では明確ではなかった。この蓄積は長時間に及ぶ高脂溶性の薬物摂取が原因と思われる。 注： a RL603 はヒトにおけるアナグレリド塩酸塩の主要な代謝物である。 b 検体採取日（Day 2）の到達摂餌量は得られていない。 c 最初の検体採取時 d 最後の検体採取時 e アナグレリド塩酸塩に対する RL603 の AUC24 値（分子量で補正）から決定。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5B CONFIDENTIAL Page 19 of 85 ビーグル犬経口（カプセル）投与毒性試験における 4 週間 PK データ (1/3) 報告書の表題：Anagrelide HCl tocixity study by oral capsule administration to beagle dogs for 4 weeks 被験物質：アナグレリド 試験番号：D00075-SPD422-IIIG 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 試験デザイン 投与量（mg/kg/日） 供試動物数 途中死亡数 アナグレリド： 投与量（mg/kg/day） Day 1 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h）d Day 28 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h）d 蓄積比 i CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.8 イヌ／ビーグル 記載なし なし（カプセル投与） 経口（ゼラチンカプセル） 血漿 アナグレリド及び RL603a LC-MS/MS アナグレリド塩酸塩連日経口投与後のアナグレリド及び主要な代謝物 RL603a に対する雄及び雌イヌの全身曝露を評価するため、4 週間毒性 試験の Day 1 と Day 28 の投与後 0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24 時間に血液検体を採取した。アナグレリドと RL603 の血漿中濃度 は、バリデートされた液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）法により測定した。分散分析により、アナグレリド及び RL603 のいずれについても投与量、時間、性の間に相互作用が示されたため、各性別及び日別個々に分散分析を実施した。 雄 雌 0 1 10 100 300 0 1 10 100 300 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 雄 雌 1 10 100 300 1 10 100 300 10.17 318.41 72.20 1330.91 14.18 339.78 2432.40 902.04 1.5 4 6 6 2 2 8 8 38 1777 625 19856 35 5130 h 21610 20116 h 0.2281 e 0.3545 e -f -g -g 0.1714 e -f -f 3.0 2.0 4.0 17.30 66.91 407.07 2062.33 12.34 525.08 910.51 1865.15 2 8 4 6 1 4 6 1 150 604 1916 28909 119 4066 10959 22696 -g -g -g -f -g 0.1572 e -g -f 4.4 3.91 0.35 3.04 1.55 3.62 1.03 b 0.26 1.76 b （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5B CONFIDENTIAL Page 20 of 85 ビーグル犬経口（カプセル）投与毒性試験における 4 週間 PK データ (2/3) 報告書の表題：Anagrelide HCl tocixity study by oral capsule administration to beagle dogs for 4 weeks 被験物質：アナグレリド 試験番号：D00075-SPD422-IIIG RL603： 投与量（mg/kg/day） Day 1 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h）d Day 28 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h）d 蓄積比 i j 代謝物の比率 ： 投与量（mg/kg/日） Day 1 Day 28 雄 1 25.05 1.5 142 0.2375 2.9 46.92 2 297 0.2824 e 2.5 1.75 10 1041.05 6 8084 0.1329 e 5.2 185.70 6 1851 -f 0.19 1 4.64 2.08 10 5.55 2.93 100 182.64 8 2238 0.1542 e 4.5 1331.50 4 10968 -g 4.86 300 664.90 6 9278 -f 1350.42 6 17451 -g 2.22 1 36.58 2 210 -f 71.03 1 502 -f 1.69 10 263.12 4 2261 -f 331.28 4 3414 0.1916 e 3.6 d 1.35 100 5.04 8.07 300 1.12 1.60 1 7.64 3.56 10 0.75 b 1.84 雄 CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.8 雌 100 300 1270.95 780.28 4 6 9460 8452 -g -f 1481.56 1921.22 8 8 12721 20122 -g -f 1.12 2.29 雌 100 300 0.55 0.87 b 2.42 1.87 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5B CONFIDENTIAL Page 21 of 85 ビーグル犬経口（カプセル）投与毒性試験における 4 週間 PK データ (3/3) 報告書の表題：Anagrelide HCl tocixity study by oral capsule administration to beagle dogs for 4 weeks 被験物質：アナグレリド 試験番号：D00075-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.3.2.8 結論： アナグレリド及び RL603 の血漿中濃度のばらつきから、用量相関性、性別の影響、及び反復投与効果の解釈は困難であった。概して、曝露量は用量と共に増加し、雌で高く、反復投与後に高くな る傾向があった。今回の結果から、イヌではヒトの主要な代謝物 RL603 に広範に曝露されていることが明らかとなった。 アナグレリドの血漿中濃度のばらつきは、特に高用量での不完全な吸収及びそれに伴う吸収量のばらつきに由来する可能性がある。これを裏付けるように、Tmax 値が高用量で遅延（最大 18 時間） しており、溶解速度律速による吸収が示唆される。アナグレリドの水への溶解度は僅か約 1.5 µg/mL である。カプセル投与は溶解速度律速による吸収をさらに悪化させた可能性がある。このばら つきのもう 1 つの説明は広範な初回通過代謝の可能性である。 生体内変換の検討結果は未変化で排泄される薬物量がきわめて少量であることを示しており（X00196-SPD422-IIIG 試験）、広範な代謝と、それ故に、おそらく全身吸収前のクリアランスが示唆さ れる。 注： k = 終末相消失速度定数 a RL603 はヒトにおけるアナグレリド塩酸塩の主要な代謝物である。 b 1 匹については結果が無い。 c 中央値 d ln2/（平均速度定数）として算出 e 1 匹の値が適切に見積りできなかった。 f 2 匹の値が適切に見積りできなかった。 g すべての動物の値が適切に見積りできなかった。 h 1 匹の動物の値（AUC18）を算定から除外 i 幾何平均、AUC24（Day 28）/AUC24（Day 1）として算出 j 幾何平均、AUC24 RL603/AUC24 アナグレリド（分子量で補正した AUC24）として算出 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5C CONFIDENTIAL Page 22 of 85 ウサギにおける反復強制経口投与後の薬物動態試験 (1/4) 報告書の表題：Anagrelide HCl 14 day repeat dose (oral gavage) pharmacokinetic study in rabbits 被験物質：アナグレリド 試験番号：L00076-SPD422-IIIA 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 測定及び観察： 生活相における 試験デザイン 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） 供試動物数 途中死亡数 死亡 一般状態： 軟便 糞量減少 飲水減少 触ると冷たい 腹臥位 瞳孔散大 脱毛 体重（kg）： Day -7 Day 1 Day 4 Day 8 Day 11 Day 15 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.6 ウサギ／New Zealand White、雌 自由摂取 0.5% (w/v) メチルセルロース水溶液 強制経口 血漿 アナグレリド及び RL603a LC-MS/MS トキシコキネティクス用血液採取：Day 1 と Day 14 の投与後 0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24 時間（各採取時点で 3 匹／群）。ア ナグレリド及び RL603a 血漿中濃度分析：液体クロマトクラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）法。被験物質調製液の安定性と均一 性の HPLC 分析：投与前。被験物質調製液の濃度分析：第 1 週目。死亡と臨床症状：1 日 2 回。投与時一般状態：第 1 週目連日、第 2 週目 2 回。体重：-Day 7 と Day 1、その後週 2 回。摂餌量：毎週。血小板数：Day 1 と Day 14 の投与後 1 時間（各採取時点で 3 匹／群）。剖検と 肉眼検査：すべての死亡動物。 雌 1 10 20 6 6 6 0 0 2 Day 7 に 1 匹を屠殺（各種症状を呈していた）；2 匹目は Day 15 発見時に死亡していた。 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） 1 10 20 0/6 1/6 3/6 1/6 1/6 2/6 0/6 1/6 1/6 0/6 0/6 1/6 0/6 0/6 1/6 0/6 0/6 1/6 0/6 1/6 0/6 3.82 3.86 3.83 3.84 3.91 3.90 3.88 3.89 3.83 3.82 3.84 3.83 3.94 3.90 3.89 3.88 3.90 3.83 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5C CONFIDENTIAL Page 23 of 85 ウサギにおける反復強制経口投与後の薬物動態試験 (2/4) 報告書の表題：Anagrelide HCl 14 day repeat dose (oral gavage) pharmacokinetic study in rabbits 被験物質：アナグレリド 試験番号：L00076-SPD422-IIIA CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.6 摂餌量（g/日）： Week 1 Week 2 投与後 1 時間の血小板数（x109 /L）b 剖検 分析 Day 1 Day 14 134 76 70 125 114 68 437 345 414 435 347 453 7 日目に屠殺した動物の所見は、肝臓と腎臓の退色、空腸、回腸、盲腸、結腸の液化した内容物であった。 15 日目発見時に死亡していた動物の胸部に澄明な液体、盲腸と結腸に液化した内容物、並びに空腸、回腸、十二指腸に黄色のゼラチン様 物質を認めた。同様な消化管の所見が自然に発生しており、薬物投与がこれを悪化させた可能性がある。 0.5% (w/v) メチルセルロース水溶液中のアナグレリド塩酸塩の投与前の製剤は、均一性、並びに室温 2 日、冷蔵庫内 15 日後の保存の安定性 はいずれも良好であった。調製された製剤の試験中の真度は、実濃度が名目濃度の 1.5%の範囲に収まり、良好であった。 結論： 本試験は、トキシコキネティクスデータを提供することによって、主要なウサギ生殖発生毒性試験（292-**-004 試験）をサポートするためにデザインされた。ヒトの薬力学反応（血小板減少）も 検査したが、血小板数には、なんら明確な作用も見られなかった。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5C CONFIDENTIAL Page 24 of 85 ウサギにおける反復強制経口投与後の薬物動態試験 (3/4) 報告書の表題：Anagrelide HCl 14 day repeat dose (oral gavage) pharmacokinetic study in rabbits 被験物質：アナグレリド 試験番号：L00076-SPD422-IIIA 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 測定及び観察： 薬物動態データ. 試験デザイン 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） 供試動物数 途中死亡数 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） Day 1 Cmax（ng/mL） Tmax（h） C24（ng/mL） AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h） 1 40.37 1 -c 120 0.4135 1.7 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） Day 1 Cmax（ng/mL） Tmax（h） C24（ng/mL） AUC24（ng·h/mL） k（h-1） t1/2（h） 1 187.99 1.5 -c 679 0.3517 2.0 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.6 ウサギ／New Zealand White、雌 自由摂取 0.5% (w/v) メチルセルロース水溶液 強制経口投与 血漿 アナグレリド及び RL603a LC-MS/MS Day 1 と Day 14 にトキシコキネティクス用の血液を採取した。 3 匹／群で 0.5、1.5、3、6、12、24 時間、更に 3 匹につき 1、2、4、8、18 時間に検体を採取した。アナグレリド及び RL603 a の血漿中濃度 をバリデートされた液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）法で分析した。 雌 1 10 20 6 6 6 0 0 2 アナグレリドの薬物動態パラメータ 10 20 1 10 20 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） 439.69 1083.71 Day 14 32.66 541.08 1810.46 Cmax（ng/mL） 1.75 1.75 1 1.5 1.5 Tmax（h） 2.72 37.07 -c 2.20 3.12 C24（ng/mL） 2487 9385 143 3038 5400 AUC24（ng·h/mL） 0.2384 0.1972 0.3150 0.3037 0.2127 k（h-1） 2.9 3.5 2.2 2.3 3.3 t1/2（h） 10 1140.11 2.5 18.78 8989 0.2304 3.0 RL603 の薬物動態パラメータ 20 投与量（mg/kg/日[塩相当量]） 2531.89 Day 14 Cmax（ng/mL） 5 Tmax（h） 147.53 C24（ng/mL） 28241 AUC24（ng·h/mL） 0.1525 k（h-1） 4.5 t1/2（h） 1 173.85 1 -c 804 0.2454 2.8 10 2469.68 3 30.24 17562 0.2961 2.3 20 3662.48 3 35.62 36006 -d -d （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5C CONFIDENTIAL Page 25 of 85 ウサギにおける反復強制経口投与後の薬物動態試験 (4/4) 報告書の表題：Anagrelide HCl 14 day repeat dose (oral gavage) pharmacokinetic study in rabbits 被験物質：アナグレリド 試験番号：L00076-SPD422-IIIA CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.6 トキシコキネティクス： 当初は異なる動物からのデータを用いて総合的な PK プロファイルを作成する予定であった。しかし、動物間の大きなばらつきのため、個々の動物の薬物動態パラメータを算定する必要があっ た。 結論： アナグレリドは迅速に吸収され、Tmax 値は概して 1 から 1.5 時間の範囲であった。消失は迅速であり、t1/2 値は約 2.6 時間であった。ウサギは有意な濃度のヒト主要代謝物 RL603 に曝露され、その 半減期はアナグレリドと同等又はやや長かった。アナグレリドと RL603 の曝露量は用量増加に比例する以上に増加した。概してウサギでは RL603 血漿中濃度がラットやイヌと（用量対用量で）比 較してはるかに高かった。 反復連日投与によるアナグレリドの顕著な蓄積は見られなかった。RL603 は中等度の蓄積を示すデータが得られたが、観察された半減期約 3 時間とは一致しなかった。 注： k = 終末相速度定数 a RL603 はヒトにおける主要なアナグレリドの代謝物である。 b 各採取時点、3 匹／群の血小板数 c 算定不可能 d 適切な見積りが不可能 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5D CONFIDENTIAL Page 26 of 85 マウス小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物及び代謝物による曝露の評価 (1/2) 報告書の表題：Anagrelide HCl The assessment of exposure to drug and metabolite in CD-1 mice in support of mouse micronucleus study 試験番号：M00251-SPD422-IIIG 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 測定及び観察： 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.7 マウス／Crl:CD-1（ICR）BR 自由摂取 リン酸緩衝液、pH6.5 強制経口 血漿 アナグレリド、RL603a 及び BCH24426a LC-MS/MS （動物）薬物動態試験用血液採取：アナグレリド塩酸塩の最終（3 回目）投与後 1、2、3、4、5、6、8、10、12、18、24 時間（各採取時点 3 匹／性／群）。無処置マウスからも検体を採取。 （分析）アナグレリドと RL603 血漿中濃度分析：液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法による検出。同一バッチからの無処置マ ウスを分析対照とした。続いて、これらの検体につき、半定量的でバリデートされていないクロマトグラフィー・タンデム質量分析法を用 いて BCH24426 を再分析した。 雄 投与量（mg/kg[塩相当量]） 動物数／時点 総動物数 途中死亡数 アナグレリドの薬物動態パラメータ Cmax（µg/mL） C24（µg/mL） AUC24[SE]（µg·h/mL） RL603 血漿中濃度 BCH24426 の血漿分析 製剤分析 2000 3 33 0 雌 5000 3 33 0 2000 3 33 0 5000 3 33 0 3.41 4.95 3.04 3.35 0.837 2.20 -b 3.09 45.0 [3.69] 71.4 [5.74] 41.1 [2.73] 63.7 [3.49] RL603 の血漿中濃度は概して定量下限値（< 0.25 µg/mL）未満であった。3 回目の投与後 5 時間と 24 時間の間に 2000 mg/kg（塩相当量）の 2 匹の雄マウス及び 5000 mg/kg（塩相当量）の 2 匹のマウス／性で測定可能な濃度が認められた。 分析により、有意な濃度の曝露と、血漿中濃度の経時的な減少が確認された。 使用された製剤は室温で 8 時間安定であった。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5D CONFIDENTIAL マウス小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物及び代謝物による曝露の評価 報告書の表題：Anagrelide HCl The assessment of exposure to drug and metabolite in CD-1 mice in support of mouse micronucleus study 試験番号：M00251-SPD422-IIIG Page 27 of 85 (2/2) 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.7 結論： アナグレリドの Tmax は大きく変動し（1 から 18 時間）、高用量では遅延する傾向にあった。 アナグレリドの曝露は本試験の用量範囲では用量増加に比例した増加は見られず、雄雌間で同様であった。全体として、5000 mg/kg の Cmax と AUC24 値は直線的な比例関係から予測される値よりそ れぞれ約 49%及び 38%低かった。アナグレリドの血漿中濃度は長期にわたり維持され、遅延性の吸収を反映していた可能性がある。これは、アナグレリドの高用量では、この薬物の高い脂溶性に 基づく溶解速度律速による吸収と一致する。 RL603 と BCH24426 による曝露が確認されたが、正確な濃度は少数例のマウスで RL603 のみ測定可能であった。 注： a RL603 と BCH24426 はヒトにおけるアナグレリドの主要な代謝物である。 b 2 匹の動物の値は定量下限値（0.250 µg/mL）未満であった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5E CONFIDENTIAL Page 28 of 85 マウス小核試験サポートのための CD-1 マウスにおける薬物及び代謝物による曝露の追加評価 報告書の表題：SPD-422: Oral (gavage) single dose toxicokinetic study in the mouse 被験物質: アナグレリド 試験番号: M4887M-SPD422 動物種／系統: 摂餌条件: 溶媒: 投与方法: 検体: 分析対象物質: アッセイ系: 測定及び観察: CTD 内の記載箇所: 4.2.2.2.8 マウス／Crl: CD-1 (ICR) 自由摂取 リン酸緩衝液、pH6.5 強制経口 血漿 アナグレリド、RL603 及び BCH24426 LC-MS/MS （動物）薬物動態試験用血液検体採取：アナグレリド塩酸塩の最終（3 番目の分割）投与後 1、2、4、12、18、24 時間（各採取時点マウス 3 匹／性／群）。 （分析）血漿中アナグレリド及びその代謝物（BCH24426 及び RL603）濃度の分析：HPLC-MS/MS 法。 性別 投与量 (mg/kg[塩相当量]) 動物数／時点 途中死亡数 雄 5000 3 0 Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUC0-最終測定時点 (h*ng/mL) 3760 1 62700 雌 5000 3 0 アナグレリドの薬物動態パラメータ 2790 2 39700 RL603 a の薬物動態パラメータ Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUC0-最終測定時点(h*ng/mL) 208 18 3660 209 24 2970 BCH24426 a の薬物動態パラメータ Cmax (ng/mL) 1050 717 Tmax (h) 18 24 18100 10900 AUC0-最終測定時点(h*ng/mL) 結論: マウスにアナグレリド塩酸塩を 5000mg/kg/日の用量で強制経口投与（2 時間間隔で 3 回に分けて同一用量を分割投与）した結果、被験物質とその代謝物 RL603、BCH24426 に曝露された。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5F CONFIDENTIAL Page 29 of 85 雄ラットに対する単回静脈内投与並びに単回及び反復経口投与後の薬物動態 報告書の表題：KRN654 (1/2) 被験物質：アナグレリド Pharmacokinetic study following single intravenous and single and repeated oral doses to male rats 試験番号：KRB0002 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 測定及び観察： 投与量（mg/kg[塩基相当量]） 動物数 途中死亡数 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.9 ラット／SD（CD） 自由摂取 静脈内：DMSO/PEG400/水（20/40/40、v/v/v）、強制経口投与：0.5% (w/v) メチルセルロース 静脈内、強制経口投与 血漿 アナグレリド、RL603a 及び BCH24426a LC-MS/MS 薬物動態試験用血液採取： 単回投与：静脈内投与後 5、15、30 分、1、2、4、8、12、24 時間、経口投与後 15、30 分、1、2、4、6、8、12、24 時間に各雄ラットか ら検体を採取（すべての投与群）。アナグレリド経口投与（1 及び 10 mg/kg）後 48 時間にも検体を採取。 反復経口投与：Day 2、3、4、5、6、7 に投与前および投与後 2 時間に、並びに Day 7 の最終投与後 15、30 分、1、2、4、6、8、12、24、 48 時間に各雄ラットから検体を採取した。 アナグレリド、RL603‡ 及び BCH24426‡の血漿中濃度の分析：液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法による検出。同一バッチから の無処置動物を分析対照とした。 静脈内 0.1 4 0 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUCt（ng·h/mL）d AUC（ng·h/mL） T1/2（h）d 132b 56.0 56.4 0.9 Cmax（ng/mL） Tmax（h）c AUCt（ng·h/mL）d AUC（ng·h/mL） T1/2（h）e 0.304 0.5 0.718 1.07 1.8 0.1 4 0 アナグレリドの薬物動態パラメータ 1.26 1 3.99 4.54 2.8 RL603 の薬物動態パラメータ 0.861 1 2.91 3.18 1.8 単回経口 1 4 0 10 4 0 反復経口 1 4 0 15.8 1.5 57.4 61.8 1.7 1110 4 6940 6650 1.6 15.6 1 47.9 1.7 6.37 2 28.9 33.3 2.6 118 7 853 - 3.43 0.75 15.8 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 5F CONFIDENTIAL 雄ラットに対する単回静脈内投与並びに単回及び反復経口投与後の薬物動態 報告書の表題： KRN654 Pharmacokinetic study following single intravenous and single and repeated oral doses to male rats 試験番号：KRB0002 Page 30 of 85 (2/2) 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.9 BCH24426 の薬物動態パラメータ 3.42 1.08 0.25 1 4.05 2.82 4.61 3.70 0.7 1.7 投与製剤の安定性は記載されていない。 9.52 230 11.0 Cmax（ng/mL） 1.5 1.5 1 Tmax（h）c 33.0 1490 28.3 AUCt（ng·h/mL）d 35.1 AUC（ng·h/mL） 2.5 T1/2（h）e 製剤分析 結論： 静脈内投与：アナグレリドは平均消失半減期 0.9 時間で低下した。アナグレリドの平均全身クリアランスは 1.81 L/h/kg であった。終末相における平均分布容積と定常状態における平均分布容積は それぞれ 2.77 及び 1.54 L/kg であった。ラットの総体内水分容量（0.67 L/kg；Davies and Morris、1993）よりも分布容積の方が大きかったため、アナグレリドが血漿以外の組織と結合することが示 唆された。 経口投与：アナグレリドと代謝物 BCH24426 の終末相における半減期は短く、概して 1.8 時間未満であった。アナグレリド、BCH24426 及び RL603 のラットにおける全身曝露速度と全身曝露量は 0.1～1 mg/kg の用量範囲では用量比例関係にあったが、0.1 から 10 mg/kg の用量範囲では、全身曝露は用量依存的（ただし非直線的）関係にあった。用量を 1 mg/kg 以上に増加すると、用量比例関 係から予測される以上に高い全身曝露がもたらされる傾向にあった。7 日間の反復投与によるアナグレリド、BCH24426、RL603 の蓄積性は認められなかった。7 日間の反復投与後のアナグレリド と BCH24426 の薬物動態プロファイルは単回投与後のプロファイルと同様であった。7 日間反復投与後の RL603 の AUC と Cmax は単回投与後の値よりも低かった。アナグレリドから BCH24426 へ の変換は極めて速かったが、広範ではなかった。RL603 への変換は緩徐であり、広範でもなかった。 注: a RL603 と BHC24426 はヒトにおけるアナグレリドの主要な代謝物 b 時間 0 の値 c 中央値 d AUCt：最終の定量可能時間ポイントまでの平均血漿中濃度-時間曲線下面積 e ln2/（平均消失速度定数）から算出 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 6. 6A CONFIDENTIAL Page 31 of 85 薬物動態試験：分布 ラットにおけるマスバランス及び組織分布試験 14 (1/3) 14 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Balance and tissue distribution study with C-BL-4162A ( C-Anagrelide HCl) in the rat 試験番号：292-062 CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.5 第 I 相：マスバランス試験 動物種／系統： ラット／SD 性及び 1 群あたりの動物数： 雄、5 匹（1 匹は最初の検体採取前に死亡） 摂餌条件： 記載なし 溶媒／投与形態： カーボワックス 300／溶液 投与方法： 強制経口及び静脈内 5 投与量（mg/kg[塩基相当量]）： 14 C 放射性核種： 比放射能： 約 23 µCi/mg 塩基 分析対象物質： 放射能 アッセイ系： 液体シンチレーションカウンター 結果： 投与放射能（平均値）に対する回収％ 検体採取時間（h） 0～24 24～48 48～72 Total（0～72） 32.9 ± 5.1 3.9 ± 2.1 0.6 ± 0.2 37.3 ± 6.5 尿 35.4 ± 18.1 12.9 ± 9.4 2.0 ± 1.0 50.3 ± 10.4 糞 68.3 ± 16.5 16.8 ± 11.1 2.6 ± 1.2 87.6 ± 4.7 合計 注： 本試験は 1 mg/kg（塩基相当量）で静脈内投与した 5 匹の雄ラットについても実施した。14C-アナグレリド塩酸塩を尾静脈内に注射された 4 匹のラットにおいて 72 時間の糞中に投与放射能のうち平 均 44%が排泄された（残る 1 匹の結果については報告されていない）。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 6A CONFIDENTIAL Page 32 of 85 ラットにおけるマスバランス及び組織分布試験 (2/3) 報告書の表題：Balance and tissue distribution study with 14C-BL-4162A (14C-Anagrelide HCl) in the rat 被験物質：14C-アナグレリド 試験番号：292-062 CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.5 第 II 相：組織分布試験 動物種／系統： 性及び 1 群あたりの動物数： 摂餌条件： 溶媒／投与形態： 投与方法： 投与量（mg/kg[塩基相当量]）： 放射性核種： 比放射能： 分析対象物質： アッセイ系： 試験デザイン： 結果： 検体採取時間（h） 胃内容物 小腸内容物 大腸内容物 組織及び臓器 検体採取時間（h） 血液細胞 腎臓 肝臓 胃 小腸 肺 副腎 血漿 甲状腺 下垂体 全血 ラット／SD 雄、3 匹 記載なし カーボワックス 300／溶液 強制経口 5 14 C 約 23 µCi/mg 塩基 放射能 液体シンチレーションカウンター 2 13 ± 3 28 ± 4 <1 63 ± 7 投与放射能（平均値）に対する存在％ 21 50 <1 < 0.01 2±2 0.12 ± 0.03 10 ± 13 0.43 ± 0.13 6.0 ± 2.8 2.3 ± 0.8 72 0.03 ± 0.01 0.09 ± 0.04 1.4 ± 0.5 2 2810 14414 10708 8728 6631 4689 5906 4349 5272 3046 3716 組織中放射能濃度（ng アナグレリド遊離塩基相当/g or mL 組織） 21 50 2197 818 1293 329 815 365 337 60 340 32 439 305 187 82 306 184 342 183 208 158 1093 446 72 202 124 225 51 39 172 57 52 36 36 116 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 6A CONFIDENTIAL Page 33 of 85 ラットにおけるマスバランス及び組織分布試験 (3/3) 報告書の表題：Balance and tissue distribution study with 14C-BL-4162A (14C-anagrelide HCl) in the rat 被験物質：14C-アナグレリド 試験番号：292-062 CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.5 組織中放射能濃度（ng アナグレリド遊離塩基相当/g or mL 組織） 21 50 159 77 125 55 116 59 280 121 1015 82 102 55 77 35 293 108 138 51 144 60 83 52 35 36 77 40 22 9 2 72 検体採取時間（h） 3299 60 心臓 3447 17 顎下腺 3119 43 膵臓 2622 38 脾臓 2257 50 大腸 2506 20 リンパ 1992 23 筋 1874 103 皮膚 1702 前立腺及び精嚢 1487 精巣上体 913 18 脂肪 501 15 眼 572 12 生殖線 518 6 脳 結論： ラットに経口投与された 14C-アナグレリドは吸収され、分布し、そして胆汁中及び尿中に排泄された。放射能は調べたいずれの組織、臓器にも蓄積しなかった。 注： 本試験は、1mg/kg（塩基相当量）を静脈内投与した 1 群 3 匹の雄ラットについても実施され、動物は投与 1、18、48 時間後に屠殺された。1 及び 48 時間後に屠殺された 3 匹のラットの内 2 匹の尾 に投与量のそれぞれ 87%、20%の残存が確認された。最終的に、静脈内投与のデータは報告されていない。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 6B CONFIDENTIAL Page 34 of 85 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁排泄、及び代謝物プロファイリング試験（Phase D） 被験物質：[10a-14C]KRN654 （14C-アナグレリド） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing 試験番号：KRB0001 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 動物種／系統： ラット／SD [Charles River code Crl:CD(SD)] 性及び 1 群あたりの動物数： 雄、3 匹 摂餌条件： 絶食 投与方法： 単回経口（胃挿管） 投与量： 5 mg/kg（塩基相当量） 溶媒： 0.5% (w/v) メチルセルロース溶液 検体： 血漿、腎臓、肝臓、及び骨髄 分析対象物質： アッセイ系： 放射能 放射能は全て Wallac 1409 自動液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer Life & Analytical Sciences、Cambridge）を用いる液体シンチレー ション分析法により測定した。 重要な知見： 組織中総放射能 血漿 肝臓 （投与量に対する%） 腎臓 （投与量に対する%） プールした骨髄 濃度比（対血漿） 肝臓 腎臓 濃度（µg 遊離塩基相当/g） 4 時間 24 時間 1.72 ± 0.34 0.065 ± 0.004 6.52 ± 1.47 0.426 ± 0.035 (4.790%) (0.5014%) 48 時間 0.022 ± 0.005 0.285 ± 0.011 (0.3429%) 14.8 ± 2.2 (2.840%) 17.2 ± 2.0 (3.144%) 0.538 ± 0.035 (0.1040%) 0.214 ± 0.026 (0.0456%) 0.726 1.15 0.053 0.013 4 時間 3.8 10 24 時間 6.6 8.3 48 時間 13 10 2 時間 1.43 ± 0.46 6.35 ± .1.71 (4.452%) 2 時間 4.5 11 0.51 0.67 0.82 0.59 プールした骨髄 データは平均値±標準偏差（n = 3） 結論：14C-アナグレリドを絶食雄ラットに経口投与後、組織中濃度を測定した結果、放射能の組織中濃度は投与後 2 時間と 4 時間が高かった。肝臓と腎臓においては、組織：血漿比はすべての時 間で 1 より大きく、アナグレリド由来物質が血漿よりもこれらの組織に容易に結合することが明らかとなった。しかし、骨髄では組織：血漿比は全ての時間で 1 未満であった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 7. 7A CONFIDENTIAL Page 35 of 85 薬物動態試験：タンパク結合 非特異的結合並びにラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合の予備的評価 報告書の表題：14C-Anagrelide hydrochloride Preliminary assessment of the 'non-specific' binding of Anagrelide hydrochrolide and of the in vitro plasma protein binding in rat, rabbit, dog and man 試験番号：V00150-SPD422-IIIG 生体試料の由来： 溶媒： 方法： アッセイ系： 14 C-アナグレリド塩酸塩の器具への非特異的結 合： In Vitro タンパク結合 濃度（ng 塩基/mL） 実測濃度 a（ng 塩基/mL） 平均結合%（± 標準偏差） 放射化学的純度 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.1 薬物未投与無処置のラット／Crl:CD(SD)IGS BR（雄）、ウサギ／New Zealand White（雌）、ヒト被験者（男）からの新鮮血漿。系統不特定の薬物 未投与無処置のイヌ（雄）からの凍結血漿 。 メタノール In vitro／平衡透析法 液体シンチレーションカウンターにより放射能を測定。放射化学的純度は HPLC 及び TLC により測定。 透析前濃度（ng 塩基/mL） 平均非特異的結合（%） 8.7 8.1 ラット ウサギ イヌ ヒト 10 10 10 10 8.5 8.6 8.7 9.0 88.0 (± 1.7) 77.4 b 81.0 (± 0.6) 87.8 (± 6.6) 14 再精製した C-アナグレリド塩酸塩の放射化学的純度は 97.1%（HPLC、方法 1）、95.5%（HPLC、方法 2）又は 98.4%（TLC）、比放射能は 26.25 mCi/mmol（102.5 µCi/mg 塩基）であった。 注： a 2 連測定の平均。 b 3 連測定の検体の内１つを喪失（緩衝液のコンパートメントに血漿が存在）したので、標準偏差は算定できず。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 7B CONFIDENTIAL Page 36 of 85 ラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合試験 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：In vitro plasma protein binding studies in rat, rabbit, dog and man 試験番号：V00145-SPD422-IIIG 生物材料の由来： 溶媒： 方法： アッセイ系： 器具に対する 14C-アナグレリド塩酸塩の非特異 的結合： 平衡時間： 血漿タンパクに対する 14C-アナ 4 時間 グレリド塩酸塩の結合 % 8 時間 浸透圧性の体積変化： 4 時間後の平均変化率（%） 放射化学的安定性： 非透析血漿（t = 0） 透析血漿（t = 4 時間） 透析緩衝液（t = 4 時間） In vitro タンパク結合： 名目濃度（ng 塩基/mL） 実測濃度 a（ng 塩基/mL） 平均結合%（± 標準偏差） CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.2 薬物未投与無処置のラット／Crl:CD(SD)IGS BR（雄 4 匹、雌 4 匹）、ウサギ／New Zealand White（雄 2 匹、雌 2 匹）、イヌ／系統不特定（雄 2 匹、雌 2 匹）、及びヒト被験者（男性 2 例、女性 2 例）からの血漿 メタノール In vitro／平衡透析法 放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定。放射化学的純度は HPLC 及び TLC により測定。 透析前の濃度 器具に対する平均非特異的結合 9.8% 5.31 ng 塩基/mL ラット ウサギ イヌ ヒト 87.3 76.9 81.4 91.3 84.7 75.6 80.1 91.8 6.5 6.0 7.5 11.9 95.7 95.5 92.3 96.6 95.2 91.4 1000 1094 88.2 (± 0.4) 5000 4920 89.7 (± 0.5) 1066 75.2 (± 0.8) 4963 76.4 (± 0.5) 1072 82.1 (± 0.5) 5324 83.4 (± 0.4) 平均放射化学的純度（%） 95.8 95.6 91.4 96.6 96.5 94.2 10 9.78 86.8 (± 0.2) 100 105.4 88.0 (± 0.3) 実測濃度 a（ng 塩基/mL） 平均結合%（± 標準偏差） 9.59 73.1 (± 1.8) 96.87 73.6 (± 0.3) 実測濃度 a（ng 塩基/mL） 平均結合%（± 標準偏差） 9.68 81.3 (± 0.6) 101.0 81.5 (± 0.2) ラット血漿タンパク ウサギ血漿タンパク イヌ血漿タンパク 名目濃度（ng 塩基/mL） 実測濃度 a（ng 塩基/mL） 平均結合%（± 標準偏差） 放射化学的純度： 注： a 2 連の測定値の平均 ヒト血漿タンパク 5 10 100 1000 6.32 12.93 116.6 1153 88.8 (± 0.4) 89.5 (± 0.2) 89.6 (± 0.4) 90.5 (± 0.3) 再精製した 14C-アナグレリド塩酸塩の放射化学的純度は 96.1%（HPLC）、98.1%（TLC）、比放射能は 26.25 mCi/mmol（102.5 µCi/mg 塩基）であっ た。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 7C CONFIDENTIAL Page 37 of 85 RL603 の非特異的結合並びにラット、ウサギ、イヌ及びヒトにおける in vitro 血漿タンパク結合の評価 報告書の表題：RL603 Assessment of the 'non-specific' binding of RL603 and of the in vitro plasma protein binding in rat, rabbit dog and man 試験番号：V00146-SPD422-IIIG 生物材料の由来： 溶媒： 方法： アッセイ系： 器具に対する RL603 の非特異的結合： 被験物質：アナグレリド／RL603 CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.3 薬物未投与無処置のラット Crl:CD (SD) IGS BR（雌雄）、ウサギ／New Zealand White（雌雄）、ヒト被験者（男女）からの新鮮血漿。薬物未投与 無処置のイヌからの凍結血漿（系統不特定、雌雄） メタノール In vitro／平衡透析法 LC-MS/MS 緩衝液中の実測濃度 インキュベーション後の 透析後の濃度 a 平均非特異的結合（%） （ng/mL[塩基相当量]） 緩衝液中の濃度 （ng/mL[塩基相当量]） （ng/mL[塩基相当量]） 17.3 19.6 12.9 32.4 ± 7.8 13.7 10.6 10.2 11.2 11.6 In vitro タンパク結合： ラット 20 名目濃度（ng/mL[塩基相当量]） 24.10 実測濃度 a（ng/mL[塩基相当量]） 88.7 b 平均結合%（± 標準偏差） 注： a 2 連の測定値の平均 b 3 連の検体の内 1 つが損失したため、標準偏差は算定できず。 ウサギ 20 23.81 86.1 ± 1.4 イヌ 20 22.87 90.5 ± 0.5 ヒト 20 18.44 89.9 ± 0.3 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 7D CONFIDENTIAL Page 38 of 85 アナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿タンパク結合率に関する検討 報告書の表題：Study to investigate the extent of binding of Anagrelide and BCH24426 to human plasma protein 試験番号：V00851-SPD422-IIIG 被験物質：アナグレリド／BCH24426 CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.4 生物材料の由来： 溶媒： 方法： アッセイ系： 重要な知見： 男女混合ヒト血漿 DMSO In vitro／平衡透析法 LC-MS/MS 平衡透析後のアナグレリド及び BCH24426 のヒト血漿非結合フラクション 化合物 アナグレリド BCH24426 濃度（ng/mL） 平均値 標準偏差 回収率（%） 1 0.112 0.013 97 10 0.098 0.014 115 50 0.145 0.040 100 5 0.087 0.008 108 50 0.119 0.054 116 0.009 101 100 0.101 結論：アナグレリド、BCH24426 のいずれも血漿タンパク結合率は同程度であり、化合物の約 10%が非結合型であった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 8. 8A CONFIDENTIAL Page 39 of 85 薬物動態試験：妊娠動物における試験 ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与した後の胎盤通過 (1/2) 報告書の表題：SPD422: Milk secretion and placental transfer of [14C]-Anagrelide hydrochloride monohydrate following a single oraldose in the rat 試験番号：R4845M-SPD422 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.6 第 2 相試験：胎盤通過 動物種／系統： 妊娠日／１群当たりの動物数： 摂餌条件： 溶媒／投与形態： 投与方法： 投与量（mg/kg[塩相当量]）： 分析対象物質： アッセイ： 消失動態 組織 母動物血液 母動物血漿 羊水 胎児 全身 胎児 副腎 胎児 血液 胎児 脳 胎児 眼 胎児 消化管 胎児 腎臓 胎児 肝臓 胎児 肺 胎児 心筋 胎児 ブドウ膜 乳腺組織 胎盤 ラット／SD 妊娠 17 日目／6 匹 非絶食 0.5%ヒドロキシメチルセルロース水溶液／懸濁液 強制経口 3 放射能 定量的全身オートラジオグラフィー r2 t1/2 測定点 （hr） 0.999 3 9.11 0.956 3 5.44 0.886 3 NR 0.990 3 6.60 0.947 5 6.30 1.000 3 8.42 0.988 4 5.78 0.969 4 6.12 0.991 4 4.94 0.957 3 4.92 0.999 4 7.17 0.967 4 5.44 0.947 4 8.72 0.905 4 6.48 0.980 4 4.82 0.914 3 8.28 Tmax （hr） 4 2 4 4 1 4 2 4 2 4 2 2 2 4 2 4 Cmax （ng/g） 1140 1030 25.0 193 336 348 132 202 257 234 347 233 228 198 419 525 測定可能時点 15400 5810 136 1990 2760 4380 1170 1680 2020 1720 3400 1770 2240 1480 3100 5280 AUC（ng･hr/g） 最終採取時点 15400 9770 209 1990 2760 4380 1170 1680 2020 1720 3400 1770 2240 1480 3100 5280 無限大 18700 9700 NR 2200 3000 5200 1260 1830 2110 1800 3820 1880 2720 1650 3230 6260 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 8A CONFIDENTIAL ラットに 14C-アナグレリド塩酸塩一水和物を単回経口投与した後の胎盤通過 報告書の表題：SPD422: Milk secretion and placental transfer of [14C]-Anagrelide hydrochloride monohydrate following a single oraldose in the rat 試験番号：R4845M-SPD422 Page 40 of 85 (2/2) 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.6 結論： 薬物関連物質は妊娠動物組織中へ広範に分布し、母動物及び胎児の組織中のピーク濃度は概して投与後 1 時間から 4 時間の間に観察された。大部分の母動物組織及び胎児組織中の薬物関連物質濃 度は対応する母動物の血液中濃度より低かった。試験期間中に薬物関連物質に対する最も高い曝露を示した組織として、副腎髄質、胆管、血液、腎臓の皮質と髄質、肝臓、肺、小腸粘膜、膀胱の 壁と内容物、及び子宮が含まれた。薬物関連物質が胎盤バリアを通過することは明白であった。定量可能な放射能濃度が全ての胎児組織のほとんどの採取時間で観測された。測定が可能であった 部位における母動物と胎児組織中の放射能の消失半減期はほとんどが 10 時間未満であった。 注： 投与後 0.5、1、2、4、8、24 時間の各時間にイソフルラン深麻酔下、各 1 匹の妊娠動物を寒冷ショックにより屠殺した。 NR：報告なし。表中の ng は遊離塩基としての値を表示。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 9. 該当なし 薬物動態試験：その他の分布試験 CONFIDENTIAL Page 41 of 85 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 10. CONFIDENTIAL Page 42 of 85 薬物動態試験：可能な代謝経路 可能な代謝経路の推定 報告書の表題：An evaluation of the potential routes of metabolism of anagrelide 試験番号：X00187-SPD422-IIIG 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.1 重要な知見： 構造的に関連する種々の化合物を参照することによって、以下に示す推定代謝経路を推察した。 アナグレリド 結論： 化合物 1 と 3 は加水分解による開環によって形成されると考えられるが、これが主要な経路であるという構造関連化合物からの証拠はない。すべての代謝物、特に化合物 2、3、6、7 はグルクロン 酸抱合、硫酸抱合等の抱合体を形成する可能性もある。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11. 11A CONFIDENTIAL Page 43 of 85 薬物動態試験：代謝物 － in vitro － ヒト、ラット、及びイヌ肝細胞を用いた in vitro 代謝の比較 (1/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Comparative in vitro metabolism using human, rat and dog hepatocytes 試験番号：V00121-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.2 生物材料の由来： ヒト・ドナー肝細胞（液体窒素中凍結保存） 溶媒： DMF（14C-アナグレリド塩酸塩用）又は DMSO（アナグレリド塩酸塩及び RL603 用） インキュベーション培地： HEPES（10 mmol/L）添加ウィリアム培地Ｅ、ウシ胎児血清（10%v/v）、デキサメタゾン（1 µmol/L）及び SPITE（1%v/v）. アッセイ系： 液体シンチレーションカウンター、HPLC（UV 及び放射能検出） 試験デザイン： 14 C-アナグレリド塩酸塩とのインキュベーション及び代謝物の分析 DMF 中に溶解した 14C-アナグレリド塩酸塩又は DMF のみを補充ウィリアム培地 E に必要濃度で添加した。肝細胞を融解し、 プール、遠心分離後、補充ウィルアム培地 E に再懸濁し、インキュベーション液に加えた（最終インキュベーション濃度： 1×106 生細胞/mL、及び 1%v/v 有機溶媒を含有する 2、6、20 µmol/L の 14 C-アナグレリド塩酸塩）。すべての検体を加湿した 95% O2：5% CO2 大気圧条件下、37°C で、0、0.5、1 又は 3 時間インキュベーションした。冷却アセトニトリルを添加してインキュベーション を停止した。各検体をホモジナイズし、2 連の一定量にシンチレーションカクテルを混合し、液体シンチレーションカウンターで測定した。併行して対照インキュベーション（14C-アナグレリド塩 酸塩又は肝細胞を非添加）を同様の手順にて実施した。各検体の残りを遠心分離し、タンパクペレットを沈殿させた。上澄み液を窒素下で乾燥し、25、40、又は 120 µL の非放射性アナグレリド塩 酸塩（100 µg/mL DMSO）溶液で再溶解し、酢酸アンモニウムを加え、10、20 又は 50～60 µL の RL603（0.5 mg/mL DMSO：酢酸アンモニウム、1：1 v/v）でスパイクし、遠心分離後、上澄み液を HPLC により分析した。溶出物につき波長 254 nm の UV 吸収及び[14C]-放射能をモニターした。14C-アナグレリド塩酸塩と RL603 はそれぞれ約 20 分及び約 16 分に溶出した。1 連の陽性対照（基質 として[14C]7-エトキシクマリンを DMF に溶解、肝細胞なし）を併行してインキュベーションした。これらの処置は、インキュベーションの最後に補充ウィルアム培地 E をアセトニトリルで置換 し、検体を 5 mmol/L PIC A 試薬（酢酸：アセトニトリルを含有）に再溶解し、HPLC 分析前に 7-エトキシクマリン（7-EC）と 7-ヒドロキシクマリン（7-HC）の両化合物のメタノール溶液でスパイ クする以外は同様な手順を適用した。溶出物につき波長 325 nm の UV 吸収及び[14C]-放射能をモニターした。[14C] 7-EC 及び 7-HC はそれぞれ約 46 分及び約 22 分に溶出した。 肝細胞の生存率とタンパク濃度 最初の肝細胞の生存率はトリパンブルー色素排除試験法で測定し、添加ウィルアム培地 E 中のプールした肝細胞のタンパク濃度は Coomassie タンパク質アッセイ 試薬を用いて分光光度計により測定した。 肝細胞からの乳酸脱水素酵素（LDH）の遊離 対照インキュベーションを併行して実施し、14C-アナグレリド塩酸塩が肝細胞からの LDH の遊離に影響するかどうかを調べた。細胞ペレットをリン 酸緩衝生理食塩水中のトリトン X-100 で溶解し、分光光度計により 340 nm 吸収の変化速度を 2 分間測定した。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11A CONFIDENTIAL Page 44 of 85 ヒト、ラット、及びイヌ肝細胞を用いた in vitro 代謝の比較 (2/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Comparative in vitro metabolism using human, rat and dog hepatocytes 試験番号：V00121-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.2 重要な知見： 14 C-アナグレリド塩酸塩インキュベーション後の放射能の分布： 0 時間 % % 速度 a % 速度 a % 速度 a % % 速度 a % 速度 a % 速度 a % % 速度 a % 速度 a % 速度 a 0.5 時間 14 2 µmol/L C-アナグレリド塩酸塩 1.0 時間 3.0 時間 0 時間 0.5 時間 6 µmol/L 14C-アナグレリド塩酸塩 1.0 時間 3.0 時間 0 時間 0.5 時間 14 20 µmol/L C-アナグレリド塩酸塩 1.0 時間 3.0 時間 20 µmol/L（対照） 0 時間 0.5 時間 1.0 時間 3.0 時間 MF-1 0.8 1.1 20 1.1 15 1.3 6 0.9 0.9 29 1.3 59 0.9 7 0.7 0.7 0 0.7 49 0.7 8 0.5 0.7 0.5 0.6 MF-2 0.6 1.0 15 1.0 7 1.0 2 0.8 0.7 0 0.8 7 0.7 0 0.7 0.6 0 0.6 0 0.7 0 0.3 0.7 0.7 0.7 関心領域の％ MF-3 2.2 4.8 141 5.9 85 10.7 64 2.1 3.2 190 3.8 102 5.5 66 1.6 2.2 146 2.3 0 1.9 0 1.7 1.9 2.4 2.8 MF-4 0.6 7.4 288 8.6 168 10.6 71 0.3 3.8 337 3.3 117 3.6 41 0.4 0.2 0 0.3 0 0.3 0 0.4 1.5 1.7 1.9 親化合物 93.4 79.8 644 78.1 346 69.8 176 92.6 87.2 849 85.3 512 83.0 205 92.8 94.0 0 93.8 0 94.0 0 95.3 93.0 92.3 91.4 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11A CONFIDENTIAL Page 45 of 85 ヒト、ラット、及びイヌ肝細胞を用いた in vitro 代謝の比較 (3/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Comparative in vitro metabolism using human, rat and dog hepatocytes 試験番号：V00121-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.2 20 µmol/L 14C-アナグレリド 3 時間対照インキュベーションの放射能： 関心領域の％ MF-3 2.6 2.8 2.6 2.0 2.3 1.8 MF-1 MF-2 MF-4 親化合物 0.2 0.8 0.2 92.2 ウィリアム培地 E + ウシ胎児血清 0.8 0.8 0.7 91.5 ウシ胎児血清を含まないウィリアム培地 E 0.3 0.9 0.2 91.4 ウィリアム培地 E + 煮沸したウシ胎児血清 0 0 0.5 93.4 Na/K リン酸緩衝液 0 0.3 0 93.7 Na/K リン酸緩衝液+ ウシ胎児血清 0 0 2.0 94.3 インキュベーションなし 結論： 14 C-アナグレリドの変換レベルは低かった。対照インキュベーションとして使用した親化合物 14C-アナグレリド溶液中に 2 つのフラクションが存在し、これらは MF-3 と MF-4 と同じ保持時間に溶 出された。しかし、肝細胞存在下では対照と比較し MF-3 と MF-4 の割合が時間依存性に増加し、特に低濃度側の 14C-アナグレリドの 2 濃度における増加は顕著であった。MF-3 と MF-4 はおそらく 本来の代謝物を表していると結論された。[14C] 7-EC（50 µmol/L）は 3 時間のインキュベーション期間中、時間依存性に代謝され、LDH アッセイにより最初の細胞の約 66%が 3 時間後にもインタ クトな膜を有していることが示された。 ヒト肝細胞を用いた代謝速度が遅かったため、予定していたラット及びイヌの凍結保存肝細胞を用いたインキュベーションは実施しなかった。 注： a pmoles/時間/mg タンパクで表示される生成速度又は代謝速度（20 µmol/L 14C-アナグレリド塩酸塩濃度における各時間ポイントの肝細胞なしの対照インキュベーションに基づく）。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11B CONFIDENTIAL Page 46 of 85 発現ヒトチトクローム P450 による可能な代謝の検討 (1/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Investigation of possible metabolism by expressed human cytochromes P450 試験番号：V000183-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.3 生物材料の由来： バキュロウイルス感染昆虫細胞 Supersomes（Gentest Corporation）を使用： 発現ヒトチトクローム P450 レダクターゼ及び CYP1A2 又は CYP2D6 のいずれかを含むミクロソーム、 発現ヒトチトクローム P450 レダクターゼ、チトクローム b5 及び CYP2C9、CYP2C19 又は CYP3A4 のいずれかを含むミクロソーム、 及び昆虫細胞対照 Supersomes 溶媒： DMSO（CYP1A2 用）、アセトン（CYP2C9 用）又はメタノール（CYP2C19、CYP2D6 又は CYP3A4 用） 試験デザイン： 反応混合物は、Na/K リン酸緩衝液（CYP1A2 及び CYP2C9 用）又は Tris-HCI 緩衝液（CYP2C19、CYP2D6 及び CYP3A4 用）のいずれか、適切なミクロソーム、及び NADPH を含有した。2 連のプ レインキュベーション（37°C、3 分）した一定量の反応混合物を 14C-アナグレリド塩酸塩（600 µmol/L、適切な溶媒中に溶解）と 30 分、及び 120 分インキュベーションした（最終基質濃度 6 µmol/L、有機溶媒含量 1%[v/v]）。対照インキュベーション（昆虫細胞対照 Supersomes、タンパク濃度 50 pmole 相当の各 P450 アイソフォーム）を同様の方法で実施した。14C-アナグレリドとその 代謝物を HPLC で分析した。溶出物は 254 nm の UV 吸収と[14C]放射能でモニターした。プレインキュベーション（37°C、3 分）後、以下の表に記載の基質を用いた陽性対照インキュベーションを 並行して実施した。： 陽性対照用： P450 含有量 インキュベーション時間 反応停止用に添加： 基質 活性測定 CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 5 pmoles/mL 20 pmoles/mL 25 pmoles/mL 25 pmoles/mL 4 pmoles/mL 3分 5分 45 分 15 分 5分 アセトン 冷却アセトニトリル 冷却過塩素酸 冷却アセトニトリル エトキシレゾルフィン [14C] ジクロフェナク [14C] S-メフェニトイン [14C] デブリソキン [14C] テストステロン 7-エトキシレゾルフィン ジクロフェナク S-メフェニトイン デブリソキン テストステロン O-脱エチル化酵素 4'-ヒドロキシラーゼ 4'-ヒドロキシラーゼ 4'-ヒドロキシラーゼ 6β-ヒドロキシラーゼ アッセイ法 蛍光分光光度法 HPLC、UV 吸収（波長 280、214、211、254 nm：それぞれ CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 用）及び [14C]-放射能 各陽性対照インキュベーション用に、関連するアイソフォームの P450 含量に相当するタンパク濃度で昆虫細胞対照 Supersomes を含む陰性対照インキュベーションを設定した。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11B CONFIDENTIAL Page 47 of 85 発現ヒトチトクローム P450 による可能な代謝の検討 (2/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Investigation of possible metabolism by expressed human cytochromes P450 試験番号：V000183-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.3 重要な知見： 14 C-アナグレリド塩酸塩インキュベーション後の放射能分布： CYP1A2 CYP2C9 30 分 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 MF-1 0.6 0.6 0.10 0.1 0.0 0 0.1 0.1 0.05 0.1 0.1 0.05 0.1 0.2 0.05 MF-2 0.8 0.6 0.25 0.3 0.2 0.25 0.5 0.3 0.45 0.6 0.6 0.60 0.2 0.5 0.40 関心領域の％ MF-3 3.5 3.0 1.30 1.2 1.1 1.00 1.5 1.5 1.45 1.3 1.2 1.10 1.0 1.7 1.35 MF-4 4.8 3.9 0.3 0.5 0.6 0.20 0.3 0.6 0.4 0.2 0.2 0.15 0.5 0.4 0.35 アナグレリド 83.2 87.3 96.1 95.2 96.1 96.15 94.0 93.5 96.6 96.3 94.9 96.05 96.2 91.2 96.2 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11B CONFIDENTIAL Page 48 of 85 発現ヒトチトクローム P450 による可能な代謝の検討 (3/3) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Anagrelide Investigation of possible metabolism by expressed human cytochromes P450 試験番号：V000183-SPD422-IIIG 14 C-アナグレリド塩酸塩インキュベーション後の放射能分布： CYP1A2 CYP2C9 120 分 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 放射化学的純度 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 レプリケート A レプリケート B 対照 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.3 関心領域の％ MF-1 MF-2 MF-3 MF-4 アナグレリド 1.0 1.2 3.9 7.5 78.9 0.8 1.0 3.8 6.2 80.0 0 0.45 1.20 0.35 95.50 0.1 0.4 1.5 0.9 94.0 0.2 0.4 1.4 1.1 93.6 0.05 0.20 0.85 0.15 98.05 0.0 0.4 1.1 0.7 95.5 0.0 0.5 1.1 0.9 94.7 0.10 0.55 1.25 0.50 93.90 0.1 0.5 1.4 0.3 95.6 NS NS NS NS NS 0 0.45 1.00 0.10 97.25 0.1 0.3 1.8 0.6 92.3 0.1 0.4 1.7 0.6 95.2 0.05 0.35 1.30 0.35 95.45 供給された原材料又は***で再精製された 14C-アナグレリド塩酸塩のデータは無い。 再精製された 14C-アナグレリド塩酸塩の比放射能は 26.25 mCi/mmol であった.。 結論： 14 C-アナグレリドを 6 µmol/L の濃度でインキュベーション後、明確に代謝される証拠が認められたものは CYP1A2 のみであった。ここでも代謝は極めて遅く、2 時間での最高変換率は約 16.6%で あった。MF-1 から MF-4 と命名した 4 つの生成物が観察された。MF-1 と MF-2 は微量（≦ 1%）であったが、MF-3 と MF-4 は明らかに主要な生成物（≧ 2%）であった。既知の代謝物 RL603 と同 じ保持時間の MF-3 は対照インキュベーションでも認められたが、量的には微量であった。 検討した発現チトクローム P450 の内、CYP1A2 が 14C-アナグレリドの生体内変換に最も重要な寄与をすると結論した。アナグレリドの迅速かつ広範な in vivo ヒト代謝を説明するために、アナグレ リドのヒト代謝は今回試験した酵素以外の酵素によって介在される可能性が示唆された。 注： NS = サンプル欠損 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11C CONFIDENTIAL Page 49 of 85 ヒト消化管内細菌叢による可能な代謝の検討 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Investigation of possible metabolism by human gut microflora 試験番号：V00172-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.4 生物材料の由来： 薬物未投与無処置ヒト被験者の新鮮糞便からの細菌叢懸濁液 DMF 溶媒： 試験デザイン： 一人のボランティアの新鮮な糞便から得られた細菌ペレットをリン酸緩衝液（0.1 mol/L、pH 7、1.5 mmol/L 硫化ナトリウムを含有）中に懸濁した。2 連のプレインキュベーション（37°C、3 分）し た一定量の懸濁液を窒素下で 14C-アナグレリド塩酸塩（最終濃度 6 µmol/L）と 0.25、1、24 時間インキュベーションした。冷却アセトニトリルを添加してインキュベーションを停止させた。2 連の 対照インキュベーション（菌体無し）について同様の手順を実施した。遠心分離後、上澄み液を窒素下で乾燥した。検体を DMSO で再溶解後、酢酸アンモニウム緩衝液を加え、RL603（0.5 mg/mL、DMSO：酢酸アンモニウム緩衝液、pH 4）でスパイク後、HPLC で分析した。溶出物を UV 吸収（254 nm）と[14C] 放射能でモニターした。14C-アナグレリドと RL603 はそれぞれ 21 分と 17 分に溶出した。代謝のバイアビリティを評価するため、フェノールフタレイン β-グルクロン酸又は p-ニトロカテコール O-硫酸塩のいずれかの存在下に菌体懸濁液の併行インキュベーションを 1 時 間と 24 時間窒素存在下で実施した。NaOH を添加して、β-グルクロニダーゼ及びスルファターゼの有効な活性を決定した。有効な活性を示さなかった菌体懸濁液は超音波破壊して菌体内成分を溶 出させた。好気性菌は滅菌生理食塩水で菌体懸濁液を希釈して測定した。各希釈液をトリプトンソーヤ寒天培地で 35°C、2 日間インキュベーションし、生じたコロニー数を記録した。各希釈液を Oxoid AN35 Anaerogen ガスパックジャーを用い、Fastideous Anaerobe Agar でインキュベーションして嫌気性菌を測定した。 14 C-アナグレリド塩酸塩インキュベーション後の放射能分布： 関心領域の％ FMF-1 FMF-2 FMF-3 FMF-4 アナグレリド 0.3, 0.3 1.4, 1.4 0.6, 0.6 2.1, 1.6 93.9, 94.8 BCS 含有 0.25 時間 0.3, 0.3 1.0, 1.4 0.9, 0.4 1.2, 0.9 94.2, 95.1 BCS 不含 0.3, 0.5 1.4, 1.8 0.9, 0.5 1.5, 1.5 93.1, 93.1 BCS 含有 インキュベーション時間 1.00 時間 0.4, 0.4 1.2, 1.4 0.5, 0.6 1.0, 1.0 94.2, 94.4 BCS 不含 0.8, 0.9 2.1, 2.1 1.2, 1.6 2.3, 5.8 92.9, 87.2 BCS 含有 24.00 時間 0.8, 0.8 1.2, 1.4 0.3, 0.5 0.7, 0.7 93.6, 93.4 BCS 不含 代謝のバイアビリティ 1 時間及び 24 時間インキュベーション後、有効な β-グルクロニダーゼ活性を確認した。有効なスルファターゼ活性は 24 時間後のみ明白に確認された。 細菌計数 一般生菌数 1.12×103 cfu/mL 嫌気性菌数 結論： 6 µmol/L 濃度 の 14C-アナグレリド塩酸塩溶液を嫌気的条件下で 24 時間までインキュベーション後、生体内変換の証拠はほとんど確認できなった。 10%未満のアナグレリド塩酸塩が見かけ上消失したが、菌体懸濁液を含まない対照インキュベーションとの間に有意差は無かった。 注： BCS = 菌体懸濁液 4.25×107 cfu/mL 又は 8.5×107 cfu/g 糞便 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11D CONFIDENTIAL Page 50 of 85 ヒト肝及び腸ミクロソームを用いた in vitro 代謝予備試験 報告書の表題：Anagrelide Preliminary in vitro metabolism studies of [14C]-anagrelide with human liver and intestinal microsomes 試験番号：V00261-SPD422-IIIG 生物材料の由来： 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.6 ヒト肝ミクロソームの調製と保存（約 -75°C）は***********社で実施した。各 6 人のドナーから等量をプールした。ミクロソームのタンパク含 量は 35.2 mg/mL であった。 アセトニトリル 溶媒： 試験デザイン： 最終濃度 5 µmol/L の 14C-アナグレリド塩酸塩をプールしたヒト肝ミクロソーム（最終インキュベーション濃度 1mg タンパク/mL）と 37℃で 60 分インキュベーションした。インキュベーションの 開始時点と終了時点で分析用に検体を採取した。アセトニトリル（100 µL）を加えて酵素反応を停止させた。遠心分離後、シャイアー社により開発されたオンライン UV 検出と放射能検出を伴う HPLC 法により検体を分析した。対照として酵素の補助因子を含まないか又はヒト肝ミクロソームを含まない状態で同様に実施した。[14C] テストステロン（最終濃度 125 µmol/L）を含有する陽性 対照インキュベーションも実施した。 重要な知見： 14 60 分後の 14C-アナグレリド塩酸塩の代謝量 R-1 生成% R-2 生成% C-アナグレリド の減少% a 1.8 0 NA ミクロソーム不含対照 1.6 0 NA 補助因子不含対照 3.7 3.1 6.0 完全なインキュベーション 放射化学的純度 再精製した 14C-アナグレリド塩酸塩の放射化学的純度は 93.1%、比放射能は 26.25 mCi/mmol であった。 結論： プールしたヒト肝ミクロソームによる 14C-アナグレリドの代謝速度は遅かった。補助因子を含まない対照と比較して約 6%が代謝されたのみであった。親化合物 14C-アナグレリド以外に 2 つの微量 な放射性成分を検出した（各成分は総溶出放射能の約 3%に相当）。フラクション R-1 は微量ではあるが非代謝経路によっても明らかに生成した。フラクション R-2 は使用した HPLC 系にてヒトの 主要な代謝物 BCH24426 と同じ保持時間を有していた。 [14C]テストステロンは、その主要なヒト代謝物である 6β-ヒドロキシテストステロンに代謝された（10%生成）。このことから使用したヒト肝ミクロソームの代謝的活性が確認された。 アナグレリドは in vitro にてプールしたヒト肝ミクロソームによって有意な量までには代謝されなかった。計画したヒト腸ミクロソームのインキュベーションは実施しなかった。 注： a 補助因子無しの対照インキュベーションと比較 NA = 該当無し 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11E CONFIDENTIAL Page 51 of 85 Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクションを用いた in vitro 代謝予備試験 報告書の表題：Anagrelide Preliminary in vitro metabolism study of [14C]-anagrelide with aroclor 1254 induced rat hepatic S9 fraction 試験番号：V00292-SPD422-IIIG 生物材料の由来： 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.7 Totam Biologicals 社（英国 Northampton）経由で Xenotech LLC 社（米国）から供給された Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクション。 バッチ番号：R-1080（0494）、ミクロソームタンパク含量 10 mg/mL。 アセトニトリル 溶媒： 試験デザイン： 14 C-アナグレリド塩酸塩を 最終濃度 1 及び 2 µmol/L で Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクション（最終濃度 1 mg タンパク/mL）と 37℃、60 分インキュベーションした。検体をインキュベーショ ンの開始時点及び終了時点で分析用に採取した。アセトニトリル（50 µL）を加えて酵素反応を停止させた。遠心分離後、シャイアー社により開発されたオンライン UV 検出と放射能検出を伴う HPLC 法により検体を分析した。 酵素の補助因子又は S9 フラクションを含まない対照を実施した。 重要な知見： 14 60 分後の 14C-アナグレリド塩酸塩の代謝量 14 C-アナグレリド濃度（µmol/L） C-アナグレリドの減少% a 1 84.2 2 86.3 再精製した 14C-アナグレリド塩酸塩の放射化学的純度は 90.6%、比放射能は 26.25 mCi/mmol であった。 放射化学的純度 結論： 14 C-アナグレリドは Aroclor 1254 誘導ラット肝 S9 フラクションにより RL603 と BCH24426 を含む幾つかの放射性フラクションに広範に代謝された。試験した 2 種類の濃度のいずれも S9 フラク ション不含の対照検体に比べ 80%を超える量が代謝された。 補助因子不含、S9 フラクション不含のいずれの対照インキュベーションにおいても幾つかの微量な放射性フラクションが観察されたが、放射化学的純度をチェックした際に明らかになったよう に、これらの成分はこの試験で使用した 14C-アナグレリドの保存溶液でも同じ濃度で存在した。 補助因子不含の対照において主要な代謝物が存在しないことから、14C-アナグレリドの代謝は NADPH-依存性の酵素系を介することが示された。インキュベーションの開始時点の検体でもかなりの代謝物が生成していた。これは S9 フラクション中に誘導された高濃度の酵素が 50 µL のアセ トニトリル添加では直ちに不活化されなかった可能性があることで説明可能である。 既知のヒトの主要なアナグレリド代謝物の生成が確認されたことも含め、ラット S9 フラクションによる広範な代謝が実証されたことから、in vitro 遺伝毒性試験で使用された代謝系が適切であっ たことが保証された。 注： a S9 フラクション不含の対照インキュベーションと比較 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11F CONFIDENTIAL アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 Page 52 of 85 (1/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 試験番号：V00855-SPD422 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 方法及び材料： 1. ヒト肝ミクロソーム存在下のアナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝 1.1 アナグレリド基質濃度 5 µM、BCH24426 基質濃度 5.3 µM プールしたヒト肝ミクロソーム（社内で調製）と被験化合物（最終基質濃度：アナグレリド、5 µM 及び BCH24426、5.3 µM）を 37℃、15 分プレインキュベーション後、NADPH（最終濃度 1 mM）を加えて反応を開始した。DMSO の最終濃度は 0.25%、最終インキュベーション容量は 500 µL とした。対照インキュベーションとして、試験する各化合物を含有し、NADPH の代わりに 0.1 M リン酸緩衝液をウェルに加えた。 各化合物を 0、5、15、30、45 分インキュベーションした（各採取時点 3 連のインキュベーション）。対照（- NADPH）は 45 分のインキュベーションのみとした。特定の時点で、一定量（50 µ Ｌ）の培養液を採取し、アセトニトリル（100 µL）を加えて反応を停止させた。プレートを 4℃で 2500 rpm、20 分遠心分離してタンパクを沈殿させた。 特定の LC-MS/MS 条件でアナグレリド、BCH24426、RL603 の濃度を測定した。 2 つの陽性対照化合物デキストロメトルファン及びベラパミルをアッセイに含めた。これらの対照インキュベーションでは、親化合物のみをモニターし、親化合物消失の算定には濃度ではなく ピーク面積を使用した。対照化合物の検体は標準的な LC-MS/MS 法で測定した。 1.2 アナグレリド基質濃度 4 nM 及び 20 nM プールしたヒト肝ミクロソーム（社内で調製）をアッセイプレートに加えた（最終基質濃度 4 nM 及び 20 nM；最終 DMSO 濃度 0.25%）。プレートを 37℃で 15 分プレインキュベーション後、 NADPH（最終濃度 1 mM）を加えて反応を開始した。最終インキュベーション容量は 25 µL とした。対照インキュベーションには NADPH の代わりに 0.1 M リン酸緩衝液をウェルに加えた。内部 標準物質ナドロール（27 pmol）を含有するメタノール 50 µL を加えて反応を停止させた。アナグレリドは 0、5、15、30、45 分インキュベートした。対照（-NADPH）は 45 分インキュベートし、 その後内部標準物資ナドロール（27 pmol）を含有するメタノール 50 µL を加えて停止させた。プレートを 4℃で 2500 rpm、20 分遠心分離してタンパクを沈殿させた。遠心分離後、上澄み液を脱イ オン水で希釈し、標準的な LC-MS/MS 法を用いて分析した。陽性対照化合物デキストロメトルファンとベラパミルをアナグレリドインキュベーションに含めた。これらは最終基質濃度 3 µM で処 理し、標準的な LC-MS/MS 法を用いて分析した。 2. ヒト腸ミクロソーム存在下のアナグレリドの in vitro 代謝 0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.4）中のヒト腸ミクロソームとアナグレリドをアッセイプレートに加えた。プレートを 15 分プレインキュベーションして、培養液を 37℃に加温後 NADPH（最終濃度 1 mM）を加えて反応を開始した。最終インキュベーション容量は 25 µL とした。対照インキュベーションには、NADPH の代わりに 0.1 M リン酸緩衝液をウェルに加えた。調製液の活性を確認する ため陽性対照にミダゾラムを使用した（最終濃度 2 µM）。 アナグレリドとミダゾラムを 0、5、15、30、45 分インキュベーションし、内部標準物質（ナドロール：27 pmol）を含有するメタノール 50 µl を添加して代謝反応を停止させた。 対照インキュベーション（-NADPH）を 45 分インキュベーションし、その後反応停止剤を加えた。プレートを 4℃で 2500 rpm、20 分遠心分離してタンパクを沈殿させた。タンパクを沈殿、遠心 後、上澄み液中のアナグレリドとミダゾラムを標準的な LC-MS/MS を使用して分析した。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11F CONFIDENTIAL Page 53 of 85 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 (2/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 試験番号：V00855-SPD422 方法及び材料： 3. アナグレリド及び BCH24426 の代謝への CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 関与の検証 対照 bactosome と CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 を発現する bactosome を Cypex 社（英国、スコットランド、Dundee）より購入した。 アナグレリド（最終基質濃度 2 µM）又は BCH24426（最終基質濃度 2 µM）をヒト CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、又は CYP3A4 bactosome（最終 P450 濃度 100 pmol/mL）及び 0.1 M リン酸緩衝液 pH 7.4 とインキュベーションした。合計インキュベーション容量は 0.5 mL であった。 37℃、10 分プレインキュベーション後、NADPH（最終濃度 2 mM）を加えて反応を開始した。最終 DMSO 濃度は 0.25%であった。その他、CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 又は CYP3A4 bactosome の代わりに対照 bactosome をアナグレリド又は BCH24426 とインキュベーションした。 NADPH 添加後、0、5、15、30、45 分に一定量（50 µL）を採取した。アナグレリドと BCH24426 については、検体を内部標準物質（55 pmol メトプロロール）含有アセトニトリル（100 µL）中に 分注して反応を停止させた。陽性対照化合物については、検体を内部標準物質（55 pmol メトプロロール）含有メタノール（100 µL）中に分注して反応を停止させた。反応停止後、検体を 4℃で 2500 rpm、20 分遠心分離してタンパクを沈殿させた。タンパク沈殿後、上澄み液につき標準的な LC-MS/MS 法を用いてアナグレリドを分析した。代謝物が反応中に生成しているかどうかを確認す るため、BCH24426 の定性的分析も実施した。 4. CYP1A2 基質エトキシレゾルフィンの代謝に対する BCH24426 の阻害能力の検討 エトキシレゾルフィン（0.5 µM）を BCH24426（濃度 0、0.011、0.053、0.11、0.53、1.1、5.3、11、21.3 µM）存在下に、社内で調製したヒト肝ミクロソーム（0.25 mg/mL）とインキュベーションし た。NADPH（最終濃度 1 mM）を添加して反応を開始した。5 分後、インキュベーション液 100 µL を採取し、メタノール 50 µL を添加して反応を停止した。レゾルフィン生成に対する BCH24426 の阻害作用を、Spectrofluor Plus プレートリーダーを用いて蛍光を測定することにより評価した（励起波長 535 nm；蛍光波長 595 nm）。 BCH24426 プレインキュベーションの影響も検討した。基質添加前に種々の濃度の BCH24426 をヒト肝ミクロソーム及び NADPH（1 mM）存在下に 15 分インキュベーシュンした。すべてのイン キュベーションは 3 連で実施した。被験物質のインキュベーションに加え、対照阻害剤 α-ナフトフラボン（0.006、0.03、0.06、0.3、0.6、3 µM）、及びフラフィリン（0.04、0.2、0.4、2、4、20 µM）も試験に加えた。 重要な知見 1. ヒト肝ミクロソーム存在下のアナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝 1.1 ヒト肝ミクロソームとアナグレリド（5 µM）または BCH24426（5.3 µM）をインキュベーションした後の残存濃度 残存親化合物（%） 化合物 インキュベーション時間（分） 対照 （-NADPH） 0 5 15 30 45 45 アナグレリド（5 µM） 100 89.7 82.8 77.0 64.1 90.8 BCH24426（5.3 µM） 100 94.8 88.5 88.5 74.6 84.8 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL Page 54 of 85 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 11F (3/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 被験物質：アナグレリド 試験番号：V00855-SPD422 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 1.2 ヒト肝ミクロソーム（0.5 mg/mL）及び NADPH（1 mM）存在下にアナグレリドまたは陽性対照化合物を 45 分インキュベーションした後の親化合物残存率（%） 残存親化合物（%） 化合物 0 5 インキュベーション時間（分） 15 対照 （-NADPH） 30 45 45 デキストロメトルファン（3 µM） 100 100 88.5 79.8 65.6 95.1 ベラパミル（3 µM） 100 83.6 55.6 36.9 27.0 93.5 アナグレリド（4 nM） 100 90.1 75.0 82.7 80.9 88.4 アナグレリド（20 nM） 100 101 82.7 88.8 71.0 71.7 2. ヒト腸ミクロソーム存在下のアナグレリドの in vitro 代謝 ヒト腸ミクロソーム（1 mg/mL）及び NADPH（1 mM）存在下にアナグレリド（2 µM）または陽性対照化合物ミダゾラム（2 µM）を 45 分インキュベーションした後の親化合物残存率（%） 化合物 ID 残存親化合物（%） 対照 （-NADPH） 0分 5分 15 分 30 分 45 分 45 分 アナグレリド（2 µM） 100 98.3 92.7 83.1 86.4 79.3 ミダゾラム（2 µM） 100 66.1 27.9 5.90 2.10 101 n=1 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11F CONFIDENTIAL Page 55 of 85 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 (4/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 試験番号：V00855-SPD422 3. アナグレリド及び BCH24426 の代謝への CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 の関与の検証 種々のヒト CYP bactosome（100 pmol/mL）存在下にアナグレリド（2 µM）、BCH24426（2 µM）、エトキシクマリン（2 µM）、ジクロフェナク（2 µM）、ジアゼパム（2 µM）、デキストロメ トルファン（2 µM）及びテストステロン（2 µM）を 45 分インキュベーションした後の親化合物残存率（%） 残存親化合物（%） 化合物 0分 5分 15 分 30 分 45 分 エトキシクマリン（対照 bactosome） 100 103 117 104 109 エトキシクマリン（CYP1A1 bactosome） 100 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1a アナグレリド（対照 bactosome） 100 99.9 101 93.4 96.6 アナグレリド（CYP1A1 bactosome） 100 9.18 5.73 2.25 0.672 BCH24426（対照 bactosome） 100 103 100 81.9 80.7 BCH24426（CYP1A1 bactosome） 100 42.2 25.5 15.0 8.11 a エトキシクマリン（対照 bactosome） 100 97.1 97.0 102 101 エトキシクマリン（CYP1A2 bactosome） 100 1.64 < 0.1 < 0.1 < 0.1 アナグレリド（対照 bactosome） 100 86.9 100 90.1 87.6 アナグレリド（CYP1A2 bactosome） 100 69.4 38.8 21.1 16.8 BCH24426（対照 bactosome） 100 106 103 92.7 91.8 BCH24426（CYP1A2 bactosome） 100 73.4 68.5 56.2 54.8a ジクロフェナク（対照 bactosome） 100 103 114 109 106 ジクロフェナク（CYP2C9 bactosome） 100 ND ND ND ND アナグレリド（対照 bactosome） 100 101 99.0 91.3 86.0 アナグレリド（CYP2C9 bactosome） 100 99.1 93.3 88.3 82.7 BCH24426（対照 bactosome） 100 98.9 103 102 96.0 BCH24426（CYP2C9 bactosome） 100 95.5 93.8 88.2 81.7 ジアゼパム（対照 bactosome） 100 111 109 100a 95.8a ジアゼパム（CYP2C19 bactosome） 100 91.2 83.6 74.8 63.9 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11F CONFIDENTIAL Page 56 of 85 アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 (5/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 試験番号：V00855-SPD422 3. アナグレリド及び BCH24426 の代謝への CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 の関与の検証 種々のヒト CYP bactosome（100 pmol/mL）存在下にアナグレリド（2 µM）、BCH24426（2 µM）、エトキシクマリン（2 µM）、ジクロフェナク（2 µM）、ジアゼパム（2 µM）、デキストロメ トルファン（2 µM）及びテストステロン（2 µM）を 45 分インキュベーションした後の親化合物残存率（%） 残存親化合物（%） 化合物 0分 5分 15 分 30 分 45 分 アナグレリド（対照 bactosome） 100 95.9 91.8 100 112 アナグレリド（CYP2C19 bactosome） 100 93.0 90.3 84.4 91.3 BCH24426（対照 bactosome） 100 90.8 104 97.9 90.2 BCH24426（CYP2C19 bactosome） 100 91.8 88.3 81.5 82.7 デキストロメトルファン（対照 bactosome） 100 93.0 103 100 111 デキストロメトルファン （CYP2D6 bactosome） 100 0.408 < 0.1 < 0.1 < 0.1 アナグレリド（対照 bactosome） 100 90.7 84.9 87.0 87.8 アナグレリド（CYP2D6 bactosome） 100 93.7 89.4 85.6 86.9 BCH24426（対照 bactosome） 100 98.9 93.2 87.3 85.7 BCH24426（CYP2D6 bactosome） 100 89.0 81.9 88.6 82.7 テストステロン（対照 bactosome） 100 100 90.3 95.3 110 テストステロン（CYP3A4 bactosome） 100 18.4 3.83 1.38 0.798 アナグレリド（対照 bactosome） 100 111 108 97.3 86.9 アナグレリド（CYP3A4 bactosome） 100 98.0 80.4 69.4 63.5 BCH24426（対照 bactosome） 100 108 105 101 82.6 BCH24426（CYP3A4 bactosome） 100 112 105 101 99.5 n=2 ND：検出されず a n = 1 繰り返し測定の内 1 回で内標準物質が低いことによる （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11F CONFIDENTIAL アナグレリドの in vitro 代謝に影響する要因の評価 Page 57 of 85 (6/6) 報告書の表題：Evaluation of factors influencing the in vitro metabolism of anagrelide 試験番号：V00855-SPD422 被験物質：アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.13 4. CYP1A2 基質エトキシレゾルフィンの代謝に対する BCH24426 の阻害能力の検討 BCH24426、及び陽性対照化合物フラフィリン、α-ナフトフラボンによる CYP1A（エトキシレゾルフィン O-脱アルキル化）の阻害 化合物 IC50（µM） 標準偏差（µM） フラフィリン（プレインキュベーション有り） 1.79 0.342 フラフィリン（プレインキュベーション無し） 28.2 5.21 α-ナフトフラボン（プレインキュベーション有り） 0.0127 0.000379 0.0148 0.00228 α-ナフトフラボン（プレインキュベーション無し） 29.6 2.15 BCH24426（プレインキュベーション有り） 26.8 2.33 BCH24426（プレインキュベーション無し） 結論：ヒト肝ミクロソーム存在下、アナグレリド（5 µM）は 45 分後、ゼロ時間の 64.1%残存まで代謝された。ヒト腸ミクロソーム存在下、アナグレリド代謝に関する証拠は得られなかった。 CYP1A はアナグレリドの BCH24426 への生体内変換に関与する主要なアイソフォームであると思われる。ヒト CYP1A bactosome による代謝は極めて迅速であった。CYP1A2 もアナグレリドを 代謝できるが、この反応は遅かった。その他の調べたチトクローム P450 bactosome のいずれも、アナグレリドから BCH24426 への有意な代謝に関する証拠は得られなかった。 BCH24426 をヒト CYP1A1 bactosome とインキュベートするとこの化合物は更に代謝された。CYP1A2 とのインキュベーションでは BCH24426 濃度は 45 分で 54.8%まで減少した。調べた他のチ トクローム P450 bactosome のいずれも BCH24426 の更なる有意な代謝に関する証拠は得られなかった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 11G CONFIDENTIAL Page 58 of 85 アナグレリドの代謝に関わるヒトチトクローム P450 の同定 報告書の表題： KRN654 の代謝に関わる CYP 分子種同定試験 被験物質：KRN654（アナグレリド） 試験番号：PK0702 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.14 ヒト肝ミクロソーム DMSO HPLC-MS/MS アナグレリド（20、400 nmol/L）を抗 CYP 抗体存在下又は非存在下、ヒト肝ミクロソーム（最終濃度：0.6 mg/mL）中に 37℃、120 分インキュ ベーションした。インキュベーションは 2 連で実施し、アナグレリド代謝活性及び残存活性の値を測定した。アナグレリド濃度を LC-MS/MS 法 により測定した。参照（陽性化合物）として SKF525A をシステムのバリデーションとして使用した。 生物材料の由来： 溶媒： アッセイ系： 試験デザイン： 重要な知見： 1）アナグレリドの消失に対する SKF525A の影響 アナグレリド濃度 400 nmol/L SKF525A（CYP 阻害剤）濃度（µmol/L） 0 5 50 500 1000 アナグレリド代謝活性（pmol/分/mg） 2.19 2.14 2.00 0.736 0.194 残存活性（%） 100.0 97.7 91.3 33.6 8.9 抗 CYP アイソフォーム特異的抗体 アナグレリド代謝活性（pmol/分/mg） 残存活性（%） 対照 0.265 100.0 CYP1A2 0.0292 11.0 CYP2C9 0.264 99.6 CYP2C19 0.262 98.9 CYP2D6 0.262 98.9 CYP3A4 0.267 100.8 対照 3.54 100.0 CYP1A2 0.222 6.3 CYP2C9 3.79 107.1 CYP2C19 3.75 105.9 CYP2D6 3.69 104.2 CYP3A4 3.82 107.9 2）アナグレリドの in vitro 代謝に対する抗 CYP アイソフォーム特異的抗体の影響 アナグレリド濃度 20 nmol/L 400 nmol/L 結論：アナグレリドはヒト肝ミクロソーム中の CYP1A2 によって代謝された。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12. 12A CONFIDENTIAL Page 59 of 85 薬物動態試験：代謝物 － in vivo － 経口投与後の実験動物における尿中代謝物プロファイル 報告書の表題：Urinary metabolite profiles in laboratory animals after oral doses of 14C-anagrelide (BL-4162A) 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： ラット／Long Evans（雄） 投与前夜約 16 時間絶食 カーボワックス 400 ラット及びイヌ強制経口、 サル強制経鼻胃管 尿 放射能、代謝物 HPLC サル／アカゲザル（雌） 試験番号：292-060 イヌ／ビーグル（雄） 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.8 ヒト 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 方法概要： XAD-2 カラムを使用して尿から放射能を抽出し、続いて HPLC カラムに負荷して代謝物プロファイルを調べた。多段階グラジエント溶出システムを使用して代謝物を分離した。 試験デザイン： 動物種： ラット サル イヌ ヒト 48 15 投与量（µg/kg[塩基相当量]） 72～78 26～28 6 2 2 1 被験動物（被験者）数 41.8 24.2 投与量に対する 0～24 時間尿中の放射能% 63.3 26.1 投与量に対する 0～72 時間尿中の放射能% 約 70 特徴的な代謝物 投与量に対する% HPLC 保持時間（分） ラット サル イヌ ヒト 1 1 1 0～1 19 18 4 14 1～2 3 3 4 6 2～3 2 2 2 12 3～4 1 1 1 1 4～5 21 1 1 5～6 1 2 2 4 6～8 2 1 14～16 1 2 3 24 22～25 結論： 排泄経路、排泄速度、及び排泄量の観点からアカゲザルが最もヒトに類似していた。尿中放射能の約 98%が代謝物の形であった。ヒトの主要な 3 つの代謝物は他の動物種でも生成していた。本試 験の実験動物では幾つかの代謝物がヒトよりも低濃度で観察されたが、今回の結果から、毒性試験で使用されるレベルにおいては、サルとラットはアナグレリドの主要なヒト代謝物に数倍高く曝 露されるであろうことが示唆された。 注： 追加の動物から 24 時間（ラット）又は 72 時間（サル、イヌ）のコントロール尿を採取した。アッセイ系のバリデーションのために、このコントロール尿に 14C-アナグレリド塩酸塩をスパイクし、 アッセイ系に負荷した。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12B CONFIDENTIAL ヒト、ラット、及びイヌで得られた代謝物の性質に関するクロマトグラフィー検討 Page 60 of 85 (1/2) 報告書の表題：[14C]-Anagrelide: Chromatographic investigation into the nature of the metabolites obtained in human, rat and dog 被験物質：14C-アナグレリド 試験番号：X00196-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.9 動物種／系統： ラット／SD、Crl:CD BR イヌ／ビーグル、Hsd:DOBE 摂餌条件： ラット；自由摂取 イヌ；投与前約 16 時間及び投与後 4 時間絶食 溶媒： 1%メチルセルロース（強制経口投与） 投与方法： 強制経口（ラット及びイヌ 1 匹） 経口カプセル（ヒト及びイヌ 1 匹） 検体： ラット及びイヌ；尿、糞、血漿 ヒト； 13,970-107A 試験に登録された男性被験者 4 例、女性被験者 1 例の尿 分析対象物質： 放射能、代謝物 アッセイ系： HPLC（インライン放射能検出） 試験デザイン： ラットとイヌに投与量 50 mg/kg の 14C-アナグレリド塩酸塩を投与し、72 時間にわたり尿と糞を採取した。別の検討として、血漿も採取し、使用した。 適切にプールした尿検体を固相抽出カートリッジに負荷してエタノールで溶出した。インライン放射能検出を用いて、尿抽出物を HPLC 分析にかけた。適切にプールした糞検体をメタノールで抽 出後、薄層クロマトグラフィーで分析した。放射性成分を検出し、蛍光画像システムで定量した。 抽出率、投与量に対する% ラット：強制経口 イヌ：カプセル イヌ：強制経口 ヒト：カプセル 50 50 50 投与量（mg/kg） 1（mg） 3 1 1 5 被験動物（被験者）数 重要な知見： 15.1 1.0 8.1 53.2 尿、0～24 時間 7.9 0.9 1.6 13.8 尿、24～48 時間 1.3 0.3 0.8 3.3 尿、48～72 時間 45.8 63.1 74.6 糞、0～24 時間 30.5 4.0 6.6 糞、24～48 時間 3.4 2.0 2.8 糞、48～72 時間 106.2 71.6 100.7 合計 71.9（168 時間値） （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12B CONFIDENTIAL ヒト、ラット、及びイヌで得られた代謝物の性質に関するクロマトグラフィー検討 Page 61 of 85 (2/2) 報告書の表題：[14C]-Anagrelide: Chromatographic investigation into the nature of the metabolites obtained in human, rat and dog 被験物質：14C-アナグレリド 試験番号：X00196-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.9 参照化合物と被験化合物に対応する放射能（%） RL603 BCH24426 検体 アナグレリド 32.16 10.44 1.22 ラット尿 9.40 14.32 < 1.0 イヌ尿（強制経口） 45.49 4.78 < 1.0 ヒト尿 < 1.0 < 1.0 > 99.9 ラット糞 < 1.0 < 1.0 78.08 イヌ糞、0～24 時間（カプセル） 4.33 < 1.0 14.96 イヌ糞、0～24 時間（強制経口） 5.23 < 1.0 29.54 イヌ糞、24～48 時間（強制経口） 結論： ラットとイヌの代謝は、尿中に多くの構造不明な代謝物が存在し、ヒトと比べてより広範であった。糞中の主要な分子種は未変化のアナグレリドであり、おそらく未吸収の薬物であろうと推測さ れる。 ラットとイヌはいずれも、ヒト尿中に観察される主要な代謝物に曝露されると結論付けられた。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12C CONFIDENTIAL Page 62 of 85 LC-MS/MS 分析法によるヒト血漿中及び尿中のアナグレリド推定代謝物の検討 報告書の表題：Investigation of potential metabolites of anagrelide in human plasma and urine by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection 被験物質：アナグレリド 試験番号：X00281-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.10 生物材料の由来： シャイアー社プロトコール AGR-1-01-J によるヒト被験者からの血漿と尿。Roberts プロトコール 13,970-107A 試験によるヒト被験者からの尿 検体： 血漿及び尿 分析対象物質： アナグレリド及びその代謝物 LC-MS/MS アッセイ系： 試験デザイン： アナグレリド塩酸塩を 2 mg（塩基相当量）投与された 6 例の日本人男性ボランティアからの血漿と尿検体、及び放射標識した同薬物を投与された 5 例の被験者からの尿を種々の質量分析条件で検 討し、X00187-SPD422-IIIG 試験で提案されている推定代謝物を探索した。RL603 と BCH24426 の標準検体を使用して、HPLC データとマススペクトルデータを比較した。 重要な知見： 質量電荷比（m/z） 216 256 272 血漿中に観察されたピーク 216 256 272 392 尿中に観察されたピーク RL603 BCH24426 予想された化合物 アナグレリド RL603 のグルクロン酸抱合体 血漿： m/z 216 のピーク面積はアナグレリドの 10 倍大きかった。m/z 272 のピーク面積はアナグレリドと同程度であった。 m/z 216 と m/z 256 のピークのプロダクトイオンスペクトルから、それぞれ RL603 とアナグレリドであることが確かめられた。m/z 272 の顕著なプロ ダクトイオンは m/z 244、216、199、174 であった。このデータに基づき代謝物の仮の構造が提唱された： BCH24426： 尿： ニュートラルロススキャンでは推定された抱合体生成物に該当するピークは同定されなかった。さらに、X00187-SPD422-IIIG 試験で提唱された推 定代謝物に該当する他のピークも見出されなかった。 尿中では未変化薬物に一致するピークは無視できる量のみが観察された。主要な成分は m/z 216 のピークであると思われ、プロダクトイオンスペク トルでは RL603 に一致した。m/z 272 のピークは、前掲の BCH24426 の構造と一致するプロダクトイオンスペクトルと HPLC の保持時間を有して いた。X00187-SPD422 試験に提唱された他の推定代謝物と一致する他のピークは観察されなかった。唯一の例外は m/z 392 のイオンからの 176 の欠 損を示すニュートラルロススキャンから観察された RL603 グルクロン酸抱合体の明らかな存在であった。 結論： アナグレリド投与後のヒト血漿と尿の分析により、2 つの重要な代謝物（RL603 及び BCH24426）と RL603 のグルクロン酸抱合体を同定した。他の提唱された代謝物は同定されなかった。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12D CONFIDENTIAL Page 63 of 85 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法によるイヌ尿中のアナグレリド推定代謝物の検討 報告書の表題：Investigation of potential metabolites of anagrelide in dog urine by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection 試験番号：D00313-SPD422-IIIG 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.11 生物材料の由来： 乾燥イヌ尿抽出物 検体： 尿 分析対象物質： アナグレリド及びその代謝物 LC-MS/MS アッセイ系： 試験デザイン： m/z 216 ピークのグラジエント HPLC トレースをスキャンした結果、RL603 の予想位置に相当量のピークが観察された。m/z 256 の同様のスキャンにより、アナグレリドに一致するが、小さなピーク のみが観察された。 m/z 272 につき 5 つの薬物関連ピークが保持時間 16 分と 21 分の間に観測された。それらの内、保持時間 18.5 分のピークはヒト尿で以前に観察された m/z 272 の代謝物と一致した。 プロダクトイオンスキャン： 16.2 分のピークは、m/z 215、226、244 のフラグメントイオンを生成した。 18.3 分と 18.5 分のピークは、m/z 174、199、216、244 のフラグメントイオンを生成した。 18.9 分と 20.1 分のピークは、m/z 187、215、244 のフラグメントイオンを生成した。 結論： 16.2 分の溶出ピークのプロダクトイオンスペクトルから、ジクロロジヒドロキナゾリン骨格の水酸化が示唆された。 18.3 分と 18.5 分に溶出した代謝物は同様のフラグメンテーションパターンを有しており、異性体である可能性が示唆された。 18.5 分のピークはヒト代謝物 BCH24426 と一致した。 18.9 分と 20.1 分のピークはジクロロジヒドロキナゾリン環が水酸化された代謝物と一致すると考えられた。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12E CONFIDENTIAL Page 64 of 85 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法によるラット尿中の推定代謝物の検討 報告書の表題：Investigation of potential metabolites of anagrelide in rat urine by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection 被験物質：14C- アナグレリド 試験番号：R00312-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.12 14 生物材料の由来： C-アナグレリド約 50mg/kg 経口投与後のラットから採取した 0～48 時間プール尿からの抽出物 検体： 尿 分析対象物質： アナグレリド及びその代謝物 LC-MS/MS アッセイ系： 試験デザイン： 14 C-アナグレリド約 50 mg/kg を単回経口投与した 3 匹の雄ラットから得られた 0～48 時間尿をプール・抽出し、種々の質量分析条件で検討し、新規なヒト主要代謝物 BCH24426 の存在を調べた。代 謝物 RL603 と BCH24426 の標準検体を使用して、HPLC データとマススペクトルデータを比較した。 重要な知見： 薬物関連物質の存在： グラジエント HPLC のトレースをスキャンすることにより RL603 の予想保持時間に m/z 216 のピークが認められた。アナグレリドの予想保持時間 に m/z 256 の小さなピークも認められたが、感度が低く、同定には至らなかった。m/z 272 の抽出イオンクロマトグラフィーにより 16-～21 分の保 持時間に 5 つのピークが認められ、2 つの塩素原子に特徴的なパターンを示したため、これらのピークは薬物関連物質であることが示された。 m/z 272 のプロダクトイオンスキャン 18.5 分のピークのプロダクトイオンスキャンは BCH24426 と一致し、その後 BCH24426 であることを確認した。 他の 3 つのピークはすべて m/z 244 に顕著なフラグメントイオンを与え、カルボニル基の欠損と一致した。これらのピークは m/z 215 にフラグメン トイオンも有しており、BCH24426 関連化合物とは異なることが示され、ジクロロジヒドロキナゾリン骨格の水酸基置換とより一致した。 5 番目のピークは RL603、アナグレリドのいずれとも共通するフラグメントを有していなかった。 結論： 質量分析により、ヒトの代謝物 BCH24426 がラット尿中代謝物として確認された。 RL603 はアナグレリド塩酸塩の代謝物である。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12F CONFIDENTIAL Page 65 of 85 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁中排泄及び代謝物プロファイリング試験（Phase D） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing (1/3) 被験物質：[10a-14C]KRN654（14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 動物種／系統： ラット／SD [Charles River code Crl:CD(SD)] 性別及び 1 群当たりの動物数： 摂餌条件： 投与方法： 投与量 溶媒： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 雄、3 匹 絶食 単回経口（胃挿管） 経口 5 mg /kg（塩基相当量） 0.5% (w/v) メチルセルロース溶液 骨髄、血漿、腎臓、肝臓 14 C-アナグレリドの代謝物 Fujifilm FLA-5000 イメージアナライザー（英国、Sheffield、Raytek Scientific Ltd）を使用して薄層板上の放射性成分を検出し、代謝物プロファイ リングを実施した。 組織／臓器分布： 血漿中代謝物： M1 M2 M3 M4 M5b M6 M7c M8 M9 その他 d 平均抽出率（%） Rf 近似値 a 0.00 0.09 0.16 0.22 0.39 0.46 0.51 0.60 0.79 2 時間 1.2 22.6 2.3 2.1 29.9 8.1 14.9 10.9 2.7 5.3 97.5 ± 0.6 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する%） 4 時間 24 時間 1.5 7.2 27.9 ND 2.1 ND 1.9 2.2 23.5 ND 10.0 ND 13.6 4.0 10.4 ND 1.9 62.3 7.3 24.2 97 ± 0.8 65.3 ± 0.8 48 時間 7.7 ND ND ND ND ND ND ND 55.0 37.2 49.4 ± 5.8 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12F CONFIDENTIAL Page 66 of 85 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁中排泄及び代謝物プロファイリング試験（Phase D） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing 肝代謝物 M1 M2 M3 M4 M5b M6 M7c M8 M9 その他 d 平均抽出率（%） 腎代謝物 M1 M2 M3 M4 M5b M6 M7c M8 M9 その他 d 平均抽出率（%） (2/3) 被験物質：[10a-14C]KRN654（14C-アナグレリド） Rf 近似値 a 0.00 0.16 0.25 0.32 0.45 0.52 0.57 0.66 0.88 2 時間 7.5 6.8 8.7 2.1 31.6 3.9 24.7 6.4 0.7 7.6 86.7 ± 1.9 試験番号：KRB0001 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する%） 4 時間 24 時間 8.4 16.4 8.0 ND 10.0 4.6 2.8 ND 26.2 ND 4.4 9.5 25.7 19.7 6.6 22.3 0.7 1.9 7.1 25.7 84.0 ± 5.6 30.1 ± 0.5 Rf 近似値 a 0.00 0.17 0.25 0.38 0.43 0.49 0.57 - 2 時間 3.9 ND 16.8 2.2 12.2 4.7 40.6 12.3 ND 7.3 94.4 ± 0.5 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する%） 4 時間 24 時間 5.0 10.5 ND ND 14.8 4.7 2.8 ND 13.1 ND 7.9 9.2 37.7 29.4 11.1 15.9 ND 9.2 7.5 21.1 94.8 ± 0.1 79.4 ± 1.0 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 48 時間 21.2 ND ND ND ND 3.6 17.4 22.8 ND 35.1 19.3 ± 1.0 48 時間 15.8 ND ND ND ND 1.5 26.3 13.0 2.1 41.4 72.3 ± 0.5 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 12F CONFIDENTIAL Page 67 of 85 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁中排泄及び代謝物プロファイリング試験（Phase D） 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing (3/3) 被験物質：[10a-14C]KRN654（14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 放射性成分の平均比率（検体中総放射能に対する%） 4 時間 24 時間 1.8 3.2 ND ND 4.4 ND ND ND 50.9 ND 23.8 69.6 14.0 13.4 ND ND ND ND 5.1 13.8 91.7 76.2 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 プールした骨髄中の代謝物 Rf 近似値 a 2 時間 48 時間 e M1 0.00 1.4 ND M2 ND ND M3 0.21 4.2 ND M4 ND ND M5b 0.44 50.5 ND M6 0.50 22.0 ND M7c 0.56 17.2 ND M8 ND ND M9 ND ND 4.7 その他 d 93.7 60.7 平均抽出率（%） 結論： 同時クロマトグラフィーにより親化合物アナグレリド（M5）及びその 3-ヒドロキシ代謝物 BCH24426（M7）は単回経口投与後 2 時間及び 4 時間のラットにおける血漿、肝臓、腎臓及び骨髄中の主 要な成分であることが示された。他に 7 つの代謝物（M1、M2、M3、M4、M6、M8 及び M9）も観察された。 注： 報告された濃度は抽出率で補正されていない。 ND = 放射能検出されず a 血漿（及び腎臓）の Rf 値は肝臓、骨髄で観察された値よりやや低い b 同時クロマトグラフィーによりアナグレリドと一致 c 同時クロマトグラフィーにより BCH24426 と一致 d 特定の成分に該当せず e 成分検出されず 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13. 13A CONFIDENTIAL Page 68 of 85 薬物動態試験：薬物代謝酵素の誘導／阻害 アナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝に関わるチトクローム P450 の誘導試験 (1/2) 報告書の表題：Study to investigate the in vitro metabolism of anagrelide and BCH24426 Cytochrome P450 induction studies 被験物質：アナグレリド、BCH24426、RL603 試験番号：V00852-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.15 材料及び方法 1）アナグレリド、BCH24426 及び RL603 の CYP1A 及び CYP3A4 誘導能に関する探索試験：一人のドナーから単離した新鮮ヒト肝細胞（Human UK Tissue Bank）をコラーゲン被覆した 24 穴プレート（Human UK Tissue Bank）に播種した。最終播種濃度は 0.15×106 細胞/ cm2 であった。播種 には 10%ウシ胎児血清添加 Williams E 培地を用いた。細胞を更に 24 時間培養後、血清フリーの培養液中に最終濃度 100 ng/mL で溶解したアナ グレリド、BCH24426、又は RL603（最終 DMSO 濃度 0.1%）を添加した。1-ヒドロキシミダゾラム及びレゾルフィン濃度を LC-MS/MS を用い て定量した。 2）アナグレリドから BCH24426 及び RL603 への代謝に影響するオメプラゾールの作用の検討：付着性の凍結保存したヒト肝細胞を使用した。 この細胞をウェル当たり 140,000 個の濃度で 48 穴組織培養プレートに播種した（ウェル当たり最終容量は 200 µL）。LC-MS/MS により検体を 分析した。 重要な知見 1）アナグレリド、BCH24426、及び RL603 の CYP1A 及び CYP3A4 誘導能に関する探索試験 1)-1 新鮮単離ヒト肝細胞中のオメプラゾール、アナグレリド、BCH24426、及び RL603 の CYP1A 誘導能 化合物 レゾルフィン生成 レゾルフィン生成 誘導率 平均（pmol/分/106 細胞） 標準偏差 （%） 2.39 0.38 溶媒対照 22.47** 1.26 840 オメプラゾール 溶媒対照 アナグレリド（100 ng/mL） BCH24426（100 ng/mL） RL603（100 ng/mL） * = 溶媒対照と有意差有り、p<0.05 ** = 溶媒対照と有意差有り、p<0.01 2.64 3.21 3.44 3.50* 0.54 0.13 0.47 0.27 22 30 33 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13A CONFIDENTIAL Page 69 of 85 アナグレリド及び BCH24426 の in vitro 代謝に関わるチトクローム P450 の誘導試験 (2/2) 報告書の表題：Study to investigate the in vitro metabolism of anagrelide and BCH24426 Cytochrome P450 induction studies 被験物質：アナグレリド、BCH24426、RL603 試験番号：V00852-SPD422-IIIG CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.15 1)-2 新鮮単離ヒト肝細胞におけるデキサメタゾン、アナグレリド、BCH24426、及び RL603 の CYP3A4 誘導能 化合物 溶媒対照 デキサメタゾン 1-ヒドロキシ-ミダゾラム生成 平均（pmol/分/106 細胞） 6.83 1-ヒドロキシ-ミダゾラム生成 標準偏差 0.42 誘導率 （%） - 268.15** 6.32 3824 溶媒対照 22.02 0.53 - アナグレリド（100 ng/mL） 18.59 1.36 - BCH24426（100 ng/mL） 16.54 1.48 - RL603（100 ng/mL） 19.96 2.52 - アナグレリド 標準偏差（µM） 残存率 （％） 0.25 0.07 100 66.4 **溶媒対照との間に有意差有り、 p<0.01 2）オメプラゾールによる付着性ヒト凍結肝細胞誘導の in vitro アナグレリド代謝に及ぼす影響 化合物 アナグレリド 平均（µM） 1 時間 2.80 溶媒対照 1.86** オメプラゾール 2 時間 2.72 0.06 100 溶媒対照 2.19** 0.06 80.5 オメプラゾール ** 溶媒対照との間に有意差有り；p<0.01. 結論：データからアナグレリド及びその代謝物 BCH24426 と RL603 が CYP1A、CYP3A4 のいずれも誘導しないことが明らかとなった。また、CYP1A 誘導剤存在下でアナグレリドの代謝が亢 進する可能性が示唆された。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13B CONFIDENTIAL Page 70 of 85 ラット培養肝細胞を用いたアナグレリド及びその代謝物 BCH24426、RL603 の肝 CYP450 酵素誘導能の評価 報告書の表題：Assessment of the potential for anagrelide and its metabolites BCH24426 and RL603 to induce hepatic CYP450 enzymes using rat hepatocytes in culture 試験番号：V01233M-SPD422 被験物質：アナグレリド、BCH24426、RL603 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.16 生物材料の由来：ラット及びヒト肝細胞 試験デザイン： ラットとヒトの肝細胞を 4 日間培養し、その間、アナグレリドとその代謝物 BCH24426、RL603（混合液として）を頻回添加して細胞に曝露させた。培養後、肝細胞を種々の P450 酵素選択性の化 学基質とインキュベーションした。プロトタイプのチトクローム CYP450 酵素誘導剤も対照として試験した。 培地中最終濃度（ラット肝細胞用）： 混合液 1：アナグレリド 1.5 µg/mL、BCH24426 0.5 µg/mL、RL603 0.25 µg/mL 混合液 2：アナグレリド 15 µg/mL、BCH24426 5 µg/mL、RL603 2.5 µg/mL 使用した濃度はげっ歯類がん原性試験で観察された血漿の Cmax とその 10 倍濃度を包含する。 培地中最終濃度（ヒト肝細胞用）： 混合液 1：アナグレリド 0.1 µg/mL、BCH24426 0.2 µg/mL、RL603 0.05 µg/mL 混合液 2：アナグレリド 1.0 µg/mL、BCH24426 2.0 µg/mL、RL603 0.5 µg/mL 混合液 3：アナグレリド 10 µg/mL、BCH24426 20 µg/mL、RL603 5 µg/mL CYP1A（EROD） 被験動物 混合液 1 混合液 2 （%） （%） ラット肝細胞 124.9 91.1 雄 76.6 37.1 雄 反復 19 25.6 雌 CYP1A（EROD）# CYP1A（フェナセチン）# 被験者 混合液 1 混合液 2 混合液 3 混合液 1 混合液 2 混合液 3 ヒト肝細胞 （%） （%） （%） （%） （%） （%） 3.1 18.1 0 10.5 18.2 0 女性 データ表示：プロトタイプの酵素誘導剤で観察された誘導作用に対する比率（%） # マイナスの値はゼロとして報告された 結論： アナグレリド（1.5 µg/mL）、BCH24426（0.5 µg/mL）、RL603（0.25 µg/mL）の混合液はラット CYP1A の顕著な誘導をもたらす。 アナグレリド（1 µg/mL）、BCH24426（2 µg/mL）、RL603（0.5 µg/mL）の混合液はヒト CYP1A の誘導をもたらす（ただし、この誘導の程度は、in vivo での臨床評価が必要とされる誘導の推奨 レベルを下回っている）。 注： EROD = エトキシレゾルフィン O-脱エチル化 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13C CONFIDENTIAL Page 71 of 85 ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対するアナグレリド及びその代謝物 RL603 の作用の in vitro 探索試験 報告書の表題：An in vitro study to examine the effect of anagrelide and its pharmacologically active metabolite RL603 on human hepatic microsomal P450 activity 試験番号：V00232-SPD422-IIIG (1/3) 被験物質：アナグレリド、RL603 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.5 生物材料の由来： ヒト肝検体、男性 3 例、女性 3 例のドナー、International Institute for the Advancement of Medicine（米国、Pennsylvania、 Exton、）より 試験デザイン： プールしたヒト肝ホモジネートの分画遠心分離によって得られたミクロソームペレットをリン酸緩衝液（pH7.4）中で洗浄し、再懸濁した。ミクロソームタンパク含量と合計 CYP 含量を測定し、 NADPH による反応開始後のエトキシレゾルフィン O-脱アルキル化活性及びベンジロキシレゾルフィン O-脱アルキル化活性を連続蛍光測定することにより代謝能力を評価した。NADPH とのプレ インキュベーションによる反応開始 2 分後に、ミクロソームタンパク（標準阻害剤を含む、又は含まない）をアナグレリド塩酸塩又は RL603 と共に 37℃でインキュベーションした。インキュ ベーション終了後各検体を遠心分離し、上澄み液を分析した。CYP マーカー基質の代謝試験は以下の通りであった： CYP1A2 介在 EROD – 反応の測定が可能となる約 5 分のインキュベーション後、レゾルフィン標準品を検量体として添加した。励起波長、蛍光波長それぞれ 530 nm 及び 585 nm を用いる蛍光分光 法によって分析した。 CYP2C9 介在 WARF – 正リン酸の添加により約 60 分後にインキュベーションを停止させた。HPLC 蛍光検出により上澄み液を分析した。励起波長、蛍光波長それぞれ 320 nm、415 nm を用いて標 準品との同時クロマトグラフィーにより確認した。保持時間も測定した。 CYP2C19 介在 MEPH – 氷冷メタノール添加により約 30 分後にインキュベーションを停止させた。上澄み液の[14C] S-メフェニトイン及び 4-ヒドロキシ-S-メフェニトイン含量を HPLC-UV 検出装置 （波長 204 nm）及びオンライン放射能検出器により測定した。 CYP2D6 介在 BUF – 正リン酸の添加により約 30 分後にインキュベーションを停止させた。上澄み液中のブフラロール及び 1’-ヒドロキシブフラロール含量を HPLC 蛍光検出により分析した。励起 波長、蛍光波長それぞれ 252 nm、302 nm を用いて標準品との同時クロマトグラフィーにより確認した。保持時間も測定した。 CYP3A4 介在 TEST – 氷冷メタノール添加により約 15 分後にインキュベーションを停止させた。上澄み液の[14C] テストステロン及び代謝物含量を HPLC-UV 装置（波長 240 nm）及びオンライン 放射能測定器により分析した。 CYP3A4 介在 MDZ – 氷冷メタノール添加により約 15 分後にインキュベーションを停止させた。上澄み液のミダゾラム、1-OH ミダゾラム及び 4-OH ミダゾラム含量を HPLC-UV 装置（波長 240 nm）により分析した。保持時間も測定した。 重要な知見：投与関連の知見は太字で表示した。 チトクローム P450 含量及びミクロソーム調製 プールしたミクロソーム調製液の特異的な CYP 含量は 0.22 nmol.mg-1 タンパクであった。エトキシレゾルフィン及びベンジロキシレゾルフィン 液の代謝能力： O-脱アルキル化活性はそれぞれ 7.44、3.18 nmol.min-1.mg-1 タンパクであった。 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13C CONFIDENTIAL Page 72 of 85 ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対するアナグレリド及びその代謝物 RL603 の作用の in vitro 探索試験 報告書の表題：An in vitro study to examine the effect of anagrelide and its pharmacologically active metabolite RL603 on human hepatic microsomal P450 activity 試験番号：V00232-SPD422-IIIG (2/3) 被験物質：アナグレリド、RL603 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.5 CYP マーカー基質の代謝に対する作用 アナグレリド塩酸塩 37.7 nmol/L 179 nmol/L 1,790 nmol/L 18,800 nmol/L 1,790 nmol/La 18,800 nmol/La CYP マーカー基質の代謝に対する作用 （対照） RL603 フラフィリン スルファフェナゾー ル トラニルシプロミン キニジン ケトコナゾール CYP1A2 （EROD） 96.3 97.6 85.4 59.5 61.8 33.6 45 nmol/L 220 nmol/L 2,200 nmol/L 20,000 nmol/L 2,200 nmol/La 20,000 nmol/La 10,000 nmol/L 10,000 nmol/L CYP1A2 （EROD） 103.7 95.2 94.9 51.6 95.5 85.0 19.0 - 20,000 nmol/L 5,000 nmol/L 500 nmol/L - CYP2C9 （WARF） 代謝物生成率（対照活性に対する%） CYP2C19 CYP2D6 （MEPH） （BUF） CYP3A4 （TEST） 98.2 95.2 95.3 100.6 90.4 93.1 95.9 105.0 97.3 88.0 95.4 100.2 104.7 100.0 105.1 101.2 代謝物生成率（pmol.min-1.mg-1 タンパク当たり [対照活性に対する%] ） CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 （WARF） （MEPH） （BUF） （TEST） 81.8 94.2 93.7 105.1 98.7 86.2 96.2 105.6 87.5 94.0 89.8 98.2 108.8 97.3 111.2 94.6 0.00 - 37.1 - 27.3 - 13.5 CYP3A4 b （MDZ） 124.4 151.0 181.1 93.5 CYP3A4 b （MDZ） 163.3 108.5 94.7 77.4 31.1 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 13C CONFIDENTIAL Page 73 of 85 ヒト肝ミクロソーム P450 活性に対するアナグレリド及びその代謝物 RL603 の作用の in vitro 探索試験 報告書の表題：An in vitro study to examine the effect of anagrelide and its pharmacologically active metabolite RL603 on human hepatic microsomal P450 activity 試験番号：V00232-SPD422-IIIG (3/3) 被験物質：アナグレリド、RL603 CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.5 結論： アナグレリド（1790 nmol/L）が示した最大の作用は CYP1A2 に対する約 15%の阻害であった。同じ濃度のアナグレリドとプレインキュベーションすると阻害作用は約 40%にまで増加した。 18,800 nmol/L 濃度でのプレインキュベーションでは阻害作用は約 66%にまで増加した。アナグレリドは試験した他のチトクロームアイソフォームの何れに対しても有意な阻害作用を示さなかっ た。RL603 は 20,000 nmol/L でのコインキュベーションでも CYP1A2 以外のアイソフォームに対して阻害作用を示さなかった。プレインキュベーションはこの作用を減少させる傾向があった。 アナグレリドが CYP1A2 によって代謝されるという証拠があるので（ V00183-SPD422-IIIG 試験）、高濃度での代謝の欠損はアナグレリドがそれ自体の代謝を介在する酵素を阻害することと一致 する。 注： EROD = エトキシレゾルフィン O-脱エチル化 WARF = S-ワルファリン 7-水酸化 MEPH = [14C] S-メフェニトイン 4’-水酸化 BUF = ブフラロール 1’-水酸化 TEST = [14C] テストステロン 6β-水酸化 MDZ = ミダゾラム水酸化 a 基質添加前にミクロソームと補助因子で 15 分プレインキュベーションした。 b 4-ヒドロキシ代謝物の生成が低レベルであったので、1-ヒドロキシ代謝物のみを提示している。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14. 14A CONFIDENTIAL Page 74 of 85 薬物動態試験：排泄 アカゲザルにおける薬物動態 (1/2) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Disposition of BL-4162A in the rhesus monkey 試験番号：292-063 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.4 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： サル／アカゲザル 絶食 溶液：カーボワックス 300（経口及び静脈内） 懸濁液：0.2%トラガカントゴム 経口（溶液、懸濁液、及びカプセル）及び静脈内 血漿、尿、及び糞 アナグレリド及び放射能 HPLC 投与方法： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： 測定及び観察： 血漿中放射能濃度、尿糞中放射能排泄並びに親化合物の血漿中及び尿中濃度の HPLC による測定 試験デザイン： アナグレリドの血漿薬物動態 溶液 1 2 3 動物番号 4.0 3.5 4.2 投与量（mg/kg[塩基相当量]） 1.4 0.75 0.90 Cmax（µg/mL） 6.9 12 4.9 Tmax（h） 40 35 62 t1/2（h） 0.39 0.25 0.23 標準化した AUC 0-無限大 （x103） 2.5 4.1 4.3 分布容積（L） 0.017 0.020 0.011 終末相消失速度定数（h-1） 14 C 投与量に対する尿中% 22.5 12.9 25.7 0～12 時間 19.1 14.0 11.0 12～24 時間 13.7 20.7 15.4 24～48 時間 6.1 7.3 4.5 48～72 時間 1.7 2.9 1.0 72～144 時間 0.2 0.1 0.2 144～192 時間 63.3 57.9 57.8 合計 0～192 時間 懸濁液 カプセル 静脈内 4 3.2 0.60 2.9 41 0.20 5.0 0.017 5 3.9 0.71 26 41 0.30 3.3 0.017 6 4.9 0.79 1.2 74 0.28 3.4 0.009 7 0.87 8 0.82 45 0.29 2.9 2.9 69 0.34 2.0 2.0 36.0 11.7 7.7 2.0 0.5 0.1 58.0 4.5 24.5 16.1 5.8 2.3 0.1 53.3 25.2 16.6 9.4 1.6 0.8 0.2 53.8 64.9 3.7 2.4 1.0 0.7 0.2 72.9 23.8 31.0 13.0 2.4 1.5 0.3 72.0 該当せず 該当せず （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14A CONFIDENTIAL Page 75 of 85 アカゲザルにおける薬物動態 (2/2) 被験物質：14C-アナグレリド 報告書の表題：Disposition of BL-4162A in the rhesus monkey 試験番号：292-063 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.4 アナグレリドの血漿薬物動態 溶液 懸濁液 カプセル 静脈内 1 2 3 4 5 6 7 8 動物番号 4.0 3.5 4.2 3.2 3.9 4.9 0.87 0.82 投与量（mg/kg[塩基相当量]） 14 C 投与量に対する糞中% 11.3 0.6 0.8 19.0 0.0 24.6 14.2 0～24 時間 糞なし 5.3 4.5 28.5 9.7 14.3 15.9 7.4 11.5 24～48 時間 8.8 25.1 5.0 1.5 14.5 2.6 1.6 3.7 48～72 時間 6.3 3.5 0.6 0.6 6.3 0.5 0.4 1.2 72～144 時間 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 144～192 時間 31.8 33.8 35.0 30.9 35.2 43.7 23.7 16.5 合計 0～192 時間 95.2 91.7 92.8 88.9 88.5 97.6 96.5 88.6 総回収率 0～192 時間 結果： 血漿中放射能濃度は血液中濃度を上回り、かつ同様に推移した。血液中の細胞フラクションは総放射能の 10～20%を占めた。親化合物は血漿中濃度の 50%以上を占めた。Tmax では投与量の 1～2% のみが血漿中に存在した。親化合物は尿中放射能のわずか 3%以下であった。 結論： サルの薬物動態は経口投与用のすべての投与形態と静脈内投与で同様であった。アナグレリドは比較的ゆるやかに吸収され、広く分布し、広範に代謝された。排泄の主要な経路は尿経由であっ た。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14B CONFIDENTIAL ヒト、ラット、及びイヌで得られた代謝物の性質のクロマトグラフィー検討 報告書の表題：[14C]-Anagrelide: Chromatographic investigation into the nature of the metabolites obtained in human, rat and dog 試験番号：X00196-SPD422-IIIG Page 76 of 85 (1/2) 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.9 動物種／系統： 摂餌条件： 溶媒： 投与方法： 検体： ラット／SD、Crl:CD BR イヌ／ビーグル、Hsd:DOBE ラット；自由摂取 イヌ；投与前約 16 時間及び投与後 4 時間絶食 1%メチルセルロース（強制経口投与） 強制経口（ラット及び 1 匹のイヌ） 経口、カプセル（ヒト及び 1 匹のイヌ） ラット及びイヌ；尿、糞、血漿 ヒト；13,970-107A 試験の男性被験者 4 例及び女性被験者 1 例からの尿 放射能、代謝物 液体シンチレーションカウンター、HPLC（インライン放射能検出） 分析対象物質： アッセイ系： 試験デザイン： ラットとイヌに 14C-アナグレリドを投与量 50 mg/kg で投与後、72 時間にわたり種々の間隔で尿と糞を採取した。別検討として血漿も採取した。 適切にプールした尿検体を固相抽出カートリッジに負荷し、エタノールで溶出した。尿抽出物を、インライン放射能検出器を用いた HPLC 分析にかけた。適切にプールした糞検体をメタノールで 抽出し、薄層クロマトグラフィーで分析後、放射性成分を検出し、蛍光画像システムで定量した。 動物種 ／ 経口投与方法 ラット：強制経口 イヌ：カプセル イヌ：強制経口 ヒト：カプセル 50 50 50 1 投与量（mg/kg） 3 1 1 5 被験動物（被験者）数 パラメータ 抽出物、投与量に対する% 15.1 1.0 8.1 53.2 尿、0～24 時間 7.9 0.9 1.6 13.8 尿、24～48 時間 1.3 0.3 0.8 3.3 尿、48～72 時間 45.8 63.1 74.6 糞、0～24 時間 30.5 4.0 6.6 糞、24～48 時間 3.4 2.0 2.8 糞、48～72 時間 106.2 71.6 100.7 合計 71.9（168 時間時点） （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14B CONFIDENTIAL ヒト、ラット、及びイヌで得られた代謝物の性質のクロマトグラフィー検討 報告書の表題：[14C]-Anagrelide: Chromatographic investigation into the nature of the metabolites obtained in human, rat and dog 試験番号：X00196-SPD422-IIIG Page 77 of 85 (2/2) 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.4.9 参照化合物及び被験化合物と一致する放射能（%） RL603 BCH24426 検体 アナグレリド 32.16 10.44 1.22 ラット尿 9.40 14.32 < 1.0 イヌ尿（強制経口） 45.49 4.78 < 1.0 ヒト尿 < 1.0 < 1.0 > 99.9 ラット糞 < 1.0 < 1.0 78.08 イヌ糞、0～24 時間（カプセル） 4.33 < 1.0 14.96 イヌ糞、0～24 時間（強制経口） 5.23 < 1.0 29.54 イヌ糞、24～48 時間（強制経口） 結論： ラットとイヌの代謝はヒトよりも比較的広範であり、尿中に多くの未同定化学種が存在した。糞中の主要な化学種は未変化のアナグレリドであり、未吸収の薬物であると推測された。ラットとイ ヌのいずれも、ヒト尿中の主要な代謝物に曝露されると結論した。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14C CONFIDENTIAL 単回強制経口投与後のアカゲザルにおける放射能の薬物動態及び排泄 報告書の表題：Pharmacokinetics and excertion of radioactivity following administration of a single oral dose of [14C]Anagrelide to rhesus monkeys 試験番号：P00228-SPD422-IIIG Page 78 of 85 (1/3) 被験物質： 14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.5.1 動物種／系統： サル／アカゲザル（雄） 摂餌条件： 投与前夜から投与後 4 時間まで絶食 溶媒： 0.2%トラガカントゴム 投与方法： 強制経口 検体： 血液、血漿、尿、及び糞 分析対象物質： 放射能 アッセイ系： 液体シンチレーションカウンター、HPLC 測定及び観察： 有病率と死亡率：1 日 2 回。一般状態観察：連日。体重：無作為化、投与日及び最終検体採取後。摂餌量：正常、低い、なし、として連日記録。血液検体（5 mL）：投与後 0.25、0.5、1、2、4、 6、8、24、48、72、96、120、144、168 時間。尿糞採取と重量測定：投与前 1 晩及び投与後 24 時間間隔で 168 時間まで。ケージ残渣：各糞採取後 。ケージ洗浄液及びケージふき取り物採取と重量 測定：最終排泄物採取後。 試験デザイン： 各動物を投与前 1 晩から投与後約 4 時間まで絶食させた。採血後 1 時間以内に血漿を採取した。採取した検体は放射分析前にすべてホモジナイズし、燃焼（適宜）し、シンチレーションカクテルを 加え、液体シンチレーションカウンターで計測した。投与液の放射化学的純度、均一性、及び安定性を HPLC 系で測定した。. 群 雄動物数 目標投与量（mg/kg） 平均到達投与量（mg/kg） 1 3 4 3.90（± 0.040） µCi/kg 投与量（平均 値±標準偏差）： 比活性（µCi/mg） mg/動物 µCi/動物 18.31 22.6 (± 2.25) 71.4 (± 0.76) 414 (± 41.2) 重要な知見：投与関連の知見を太字で示した。 一般状態観察 投与関連の知見はなし。 体重 投与関連の知見はなし。 摂餌量 摂餌はすべての動物で Day 2 に低下、1 匹の動物は Day 6 まで低下が持続した。 Ke t1/2 Tmax Cmax AUC0-168 AUC0-∞ MRT 薬物動態： 投与量 （h） （h） （ng 相当/g） （ng 相当･h/g） （ng 相当･h/g） （h） （mg/kg） 3.90 0.012916 53.7 a 6 282 10800 12100 71.7 血漿（平均） （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14C CONFIDENTIAL Page 79 of 85 単回強制経口投与後のアカゲザルにおける放射能の薬物動態及び排泄 (2/3) 報告書の表題：Pharmacokinetics and excertion of radioactivity following administration of a single oral dose of [14C]Anagrelide to rhesus monkeys 試験番号：P00228-SPD422-IIIG 平均排泄量（投与放射能に対する%）： 尿 糞 ケージ残渣（168 時間） ケージ洗浄液（168 時間） ケージふき取り物（168 時間） 代謝物プロファイル： 代謝物と親化合物ピークの総放射能に対する% 平均（%） 保持時間範囲（分）b 平均（%） 保持時間範囲（分）c 平均（%） 保持時間範囲（分）c 放射化学的純度及び安定性 投与溶液の分析 0～24 13.7 7.49 - 24～48 5.79 17.5 - 48～72 3.24 32.5 - 採取間隔（投与後の時間） 72～96 96～120 1.69 1.08 5.65 1.90 - 被験物質： 14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.5.1 120～144 0.38 0.30 - 144～168 0.22 0.26 合計 小計 26.1 65.5 0.53 1.13 0.84 94.1 6 時間血漿中濃度成分 14 P2 P3 P4 P5 C-アナグレリド 4.52 4.94 2.94 5.53 47.0 21.90 13.10～13.20 15.50～15.70 17.6～18.1 18.80～18.90 投与量に対する尿マトリックス成分%（参照標準物質添加せず） U1 U2 U3 U4 5.23 66.1 11.7 5.67 15.30 11.00～11.10 11.60～11.70 12.80～12.90 投与量に対する尿マトリックス成分％（参照標準物質添加）d U1 U2 U3 U4 4.34 61.1 10.0 5.68 11.10 11.60～11.70 12.80～12.90 15.30～15.50 バルクの 14C-アナグレリド塩酸塩の放射化学的純度は 98.6%.であった。 投与前及び投与後の平均放射化学的純度はそれぞれ 97.7%、97.8%であり、これら試験条件下での材料の安定性を確認した。 LSC 分析の結果から、投与期間をとおして投与溶液は均一であることが示された。 （続く） P1 33.7 11.80 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 14C CONFIDENTIAL 単回強制経口投与後のアカゲザルにおける放射能の薬物動態及び排泄 報告書の表題：Pharmacokinetics and excertion of radioactivity following administration of a single oral dose of [14C]Anagrelide to rhesus monkeys 試験番号：P00228-SPD422-IIIG Page 80 of 85 (3/3) 被験物質： 14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.5.1 結論： 血液中の 14C-アナグレリド由来の放射能の大部分は血漿中に存在した。血液中の薬物由来放射能の平均 4%未満がすべての時点で細胞成分と結合していた。 経口投与されたアナグレリド塩酸塩の排泄の主要経路は糞であった。排泄された放射能の大部分は最初の 72 時間に排泄された（糞 57.4%及び尿 22.8%）。尿中放射能の回収率から、投与放射能の 少なくとも 26.1%が経口投与後吸収されたことが示された。 6 時間血漿の HPLC 分析により、14C-アナグレリドと 14C-アナグレリド由来の放射能を含有する 5 つの代謝物のピークが認められ、放射能の主要なピークは親化合物 14C-アナグレリドと一致した。 尿の HPLC 分析では、14C-アナグレリド由来放射能を含む 4 つの代謝物ピークが観察されたが、親化合物は見出されなかった。 血漿及び尿プロファイルで見られた放射能ピークのいずれも、ヒト尿中で以前に同定された既知のアナグレリド塩酸塩の代謝物である 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリンと一致する保 持時間のものはなかった。 注： Ke = 消失速度定数 MRT = 平均滞留時間 a 調和平均 = 0.693/平均 Ke b ヒト尿中アナグレリド塩酸塩代謝物として知られる 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリンの保持時間は 17.30 分であった。 c ヒト尿中アナグレリド塩酸塩代謝物として知られる 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン及び 14C-アナグレリドの保持時間はそれぞれ 17.30 分、21.90 分であった。 d 2-アミノ-5,6-ジクロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン及び 14C-アナグレリドの標準品を添加して評価。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL Page 81 of 85 薬物動態試験：胆汁中排泄 15. 14 [10a- C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁中排泄、及び代謝物プロファイリング試験 （Phase Ｃ） (1/2) 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing 被験物質：[10a-14C]KRN654 （14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 動物種／系統： 性別（雄、雌）／動物数： 摂餌条件： 投与方法： 外科的処置： 投与量： 溶媒： 検体： 分析対象物質： アッセイ系： PK パラメータ： 排泄率（投与量に対するトータル%） 胆汁 0～2（時間） 2～4（0～4 時間） 4～6（0～6 時間 6～24（0～24 時間） 24～48（0～48 時間） 合計 尿 0～6（時間） 6～24（時間） 24～48（時間） 合計 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 ラット／SD [Charles River code Crl:CD(SD)] 雄／5 匹 絶食 胃挿管による単回経口投与 胆管カニュレーション 5 mg/kg（塩基相当量） 0.5% (w/v) メチルセルロース溶液 胆汁、尿、糞、消化管（壁及び内容物）、残存死体 （薬物動態試験用胆汁検体採取：投与後 0～2、2～4、4～6、6～24、24～48 時間；尿検体採取：0～6、6～24、24～48 時間；糞検体採取：0～24、24 ～48 時間） 放射能 放射能は全て Wallac 1409 自動液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer Life & Analytical Sciences、Cambridge）を用いる液体シンチレーション 分析法により測定した。 平均値 ± 標準偏差（n = 3） 1.99 ± 1.60 2.20 ± 1.48 (4.19 ± 3.08) 2.59 ± 1.20 (6.79 ± 4.27) 13.13 ± 2.20 (19.91 ± 6.11) 0.48 ± 0.100 (20.39 ± 6.16) 20.39 ± 6.16 8.86 ± 2.27 29.32 ± 5.03 0.85 ± 0.12 39.03 ± 3.04 （続く） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide CONFIDENTIAL Page 82 of 85 15 [10a-14C]KRN654 単回投与後のラットにおける薬物動態、胆汁中排泄、及び代謝物プロファイリング 試験（Phase Ｃ） (2/2) 報告書の表題：[10a-14C]KRN654 Pharmacokinetic, biliary excretion and metabolite profling studies in the rat after single dosing 被験物質：[10a-14C]KRN654 （14C-アナグレリド） 試験番号：KRB0001 CTD 内の記載箇所：4.2.2.2.3 糞 0～24（時間） 24～48（時間） 合計 ケージ洗浄液 0～48 時間 残留 消化管壁 消化管内容物 死体 合計 33.75 ± 4.84 0.97 ± 0.30 34.72 ± 4.81 1.09 ± 0.09 0.01 ± 0.01 0.04 ± 0.01 1.22 ± 0.18 1.27 ± 0.18 96.51 ± 1.56 回収率 結論：投与後 0～48 時間の間に腎（約 39%）及び肝胆道経由（約 20%）で排泄され、約 1%が死体に残留した。従って、経口投与量の少なくとも 60%が吸収された。 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 16. 14 CONFIDENTIAL Page 83 of 85 薬物動態試験：授乳動物における試験 C-アナグレリド塩酸塩一水和物をラットに単回経口投与した後の乳汁移行 報告書の表題：SPD422: Milk secretion and placental transfer of [14C]-anagrelide hydrochloride monohydrate following a single oraldose in the rat 試験番号：R4845M-SPD422 被験物質：14C-アナグレリド CTD 内の記載箇所：4.2.2.3.6 第 1 相試験：乳汁中への移行 動物種／系統： ラット／SD 授乳日／1 群当たりの動物数 分娩後約 10 日／18 匹 摂餌条件： 非絶食 溶媒／投与形態： 0.5%ヒドロキシメチルセルロース水溶液／懸濁液 投与方法： 強制経口 3 投与量（mg/kg[塩相当量]） 分析対象物質 放射能 アッセイ 液体シンチレーションカウンター 0.5 1 2 4 8 24 時間（h） 濃度（ng/g[遊離塩基相当量]）： 568 ±253 1670 ± 354 2140 ± 506 1560 ± 308 288 ± 123 20.2 ± 8.69 乳汁 516 ± 108 734 ± 156 739 ± 55.4 451 ± 108 105 ± 28.7 16.8 ± 2.88 血漿 556 ± 157 824 ± 98.3 894 ± 43.9 738 ± 148 499 ± 124 231 ± 18.7 血液 1.06 ± 0.304 2.40 ± 0.878 2.91 ± 0.820 3.50 ± 0.461 2.67 ± 0.393 1.23 ± 0.534 乳汁/血漿比 結論： 授乳ラットの血液中の 14C-アナグレリド関連放射能濃度は対応する血漿中濃度より高く、14C-アナグレリド及びその代謝物またはそのいずれかは赤血球と結合することが示唆された。薬物関連物 質は容易に乳汁中に分配された。母動物の血漿中濃度に対する乳汁中濃度の比率の最大値は 3.50 であった。 薬物関連物質は最後の検体採取時間である 24 時間でも乳汁中に移行していた。授乳ラットにおける血漿及び乳汁中の薬物関連物質の消失半減期はそれぞれ 4.61 時間及び 3.42 時間であったが、全 血中ではより長時間（12.5 時間）であった。 注： 3 匹の分娩ラットから、投与後 0.5、1、2、4、8、24 時間に乳汁を採取した。 検出限界：乳汁 = 5.66 ng/g（塩基相当量）、血漿 = 1.45 ng/g（塩基相当量）、血液 = 1.98 ng/g（塩基相当量） 消失 t1/2：乳汁 = 3.42 時間、血漿 = 4.61 時間、血液 = 12.5 時間 Cmax：乳汁 = 2140 ng/g（塩基相当量）、血漿 = 739 ng/g（塩基相当量）、血液 = 894 ng/g（塩基相当量） tmax：乳汁 = 2 時間、血漿 = 2 時間、血液 = 2 時間 AUCall：乳汁 = 10900 ng･h/g（塩基相当量）、血漿 = 4060 ng･h/g（塩基相当量）、血液 = 11000 ng･h/g（塩基相当量） 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 17. 該当なし 薬物動態試験：薬物相互作用 CONFIDENTIAL Page 84 of 85 2.6.5 薬物動態概要表 Anagrelide 18. 該当なし 薬物動態試験：その他 CONFIDENTIAL Page 85 of 85
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