土壌微生物学1

植物生産基礎実習（土壌微生物）の概要
テーマ
有機質肥料を有効化する土壌微生物の計数
目的
土壌中の微生物は植物への養分供給において重要な役割を担っている。その役割のひ
とつは、有機物（植物、動物、微生物の構成成分）を分解して、植物が養分として吸収
できる無機物に変換することである。
土壌に有機物が入ってくると、それを分解（代謝）できる土壌微生物が増殖し、有機
物を無機化する。タンパク質などの有機態窒素は無機化によってアンモニアに変換され
る。ナタネ油粕や魚粉などの有機質肥料は、土壌中で微生物の働きによって分解され、
成分が無機化されて植物生育に有効になる。
今回の実習では、土壌に有機質肥料を添加して、有機態窒素を無機化する微生物の増
殖を調べ、有機質肥料の有効化に対する土壌微生物の働きを確認するとともに土壌微生
物調査法の基礎を習得する。
実験項目
（1）有機質肥料添加土壌の培養（対照区は無添加）
（2）培養土壌中の全細菌と窒素無機化細菌（アンモニア生産菌）の計数
・MPN 法（Most Probable Number 法・最確値法）を用いる。
全細菌はペプトン・酵母エキス培地に生育する細菌。
アンモニア生産菌はペプトン・酵母エキス培地でアンモニアを生産する細菌。
実験工程
第 1 回（11/25, 2014）
(1)有機質肥料添加土壌の調製・培養開始
・土壌：畑土壌
・有機質肥料：粉末ナタネ油粕
・培養：保温静置
28℃
(2)細菌計数用培地の調製
・培地：ペプトン・酵母エキス液体培地
・オートクレーブ
120℃
15 分
(3)土壌試料希釈用滅菌水の調製
・水道水
・オートクレーブ
120℃
15 分
(4)実験器具の滅菌
・エッペンドルフチューブ、ピペットチップ
・オートクレーブ 120℃
15 分
-1-
第 2 回（12/2）
(1) 土壌試料の計数用希釈液調製
(2) MPN 計数のために、マイクロタイタープレートへの培地分注・土壌希釈液接種・
培養開始
・静置培養 28℃
第 3 回（12/9）
(1) マイクロタイタープレートの細菌生育ウェルの計数（生育細菌による濁り・沈殿）
(2) マイクロタイタープレートのアンモニア生産菌生育ウェルの計数（アンモニア生
産による培地 pH の上昇－pH 指示薬 BTB）
＊(1)と(2)は同じプレートで計数する。
(3) MPN 法での全細菌数・アンモニア生産菌数の計算
(4) 全細菌数・アンモニア生産菌数の表・グラフの作成
レポートの作成・提出
第 3 回が終了してから下記課題を含めて作成し、提出する。（詳細はマニュアル p.7）
締切：12 月 16 日（火）
、東館 1 階事務室前レポートボックスへ
課題 1 ナタネ油粕添加土壌と無添加土壌の全細菌とアンモニア生産菌について、MPN
法による計数結果を菌密度(菌数 / g 土壌）で表示して、表と棒グラフを作成する。
課題 2 ナタネ油粕を添加して土壌を培養することによって、土壌中の全細菌数とアン
モニア生産菌数がどのように変化したかを求めて、ナタネ油粕窒素の有効化に対
する土壌微生物の働きを考察する。
ヒント：多くの微生物は有機物を分解（代謝）して増殖するので、有機物の添加によって増
加する微生物はその有機物の分解に関与すると考察できる。
-2-
有機質肥料を有効化する土壌微生物の計数マニュアル
第 1 回（11/25, 2014）
１．有機質肥料添加土壌の調製・培養開始
（1）有機質肥料添加土壌の調製
1 土壌（畑土壌、2 mm のふるい掛け）50 g を 100 ml ビーカーに採取（各班 1 個）
2 ナタネ油粕 1 g を添加、混合
3 蒸留水 10 ml を添加（水添加後は撹拌混合不可）・ラベル
（2）有機質肥料無添加土壌（対照）の調製（各班 1 個）
1 土壌（畑土壌、2 mm のふるい掛け）50 g を 100 ml ビーカーに採取
2 蒸留水 10 ml を添加（水添加後は撹拌混合不可）・ラベル
（3）土壌試料の培養
土壌試料入りビーカーにアルミ箔でふたをして、28℃恒温器内で 1～3 週間（今回は
1 週間）、保温静置。
２．細菌計数用培地の調製
培地：ペプトン・酵母エキス液体培地
[培地組成] ペプトン 1 g、酵母エキス 0.1 g、
NaH2PO4･2H2O 2.3 g、Na2HPO4･12H2O 5 g
水 1 L、pH 6.80
（1）培地 100 ml を 200 ml ビーカー中で調製（各班 1 個）
ペプトン
0.1 g
酵母エキス
0.01 g
NaH2PO4･2H2O 0.23 g
Na2HPO4･12H2O 0.5 g
水
100 ml
pH 6.80
（2）100 ml ねじ口びんにほぼ半量ずつ（目分量）分注・ラベル（各班 2 本）
（3）オートクレーブ 120℃ 15 分
３．土壌試料希釈用滅菌水の調製
（1）水道水 270 ml を 500 ml 広口ねじ口びんに採取・ラベル（各班 2 本）
（2）水道水 50 ml を 100ml ねじ口びんに採取・ラベル（各班 2 本）
（3）オートクレーブ 120℃ 15 分
４．実験器具の滅菌
（1）1.5 ml エッペンドルフチューブ 20 本入り 200 ml ビーカー（各班 1 個）
（2）1 ml ピペットチップ 25 本入り箱（各班 2 箱）
（3）オートクレーブ 120℃ 15 分
＊オートクレーブはあとでスタッフがかけるので、物品を各班カゴに入れてまとめておく。
-3-
第 2 回（12/2）
各班の中を２グループに分けて、一つのグループが油粕添加土壌の微生物の計数を担当
し、もう一つのグループが油粕無添加土壌の微生物の計数を担当する。
１． MPN計数用にマイクロタイタープレートへの培地分注（無菌操作）
マイクロタイタープレート： 96穴、ふた付き（滅菌済み）（各グループ1枚）
培地：ペプトン・酵母エキス液体培地（滅菌済み）
(1)マイクロタイタープレートにラベル
ふたの右下に班名、試料名（油粕添加、油粕無添加）
(2)マイクロタイタープレートの横No.3～No.11、縦A～E（9×5）の各ウエルに
培地0.2 ml（200μl)をマイクロピペットで分注
２．土壌試料希釈用滅菌水の分注（無菌操作）
(1)滅菌水9 mlを15 ml滅菌ねじ口ポリ試験管にマイクロピペットで採取（各グループ1本）
(2) 1.5 mlエッペンドルフチューブにラベル：3, 4, ・・・, 11（各グループ1本ずつ計9本）
(3)滅菌水0.9 mlを各エッペンドルフチューブに分注
３．土壌試料の計数用希釈液の調製（無菌操作）
10倍希釈系列：500 mlねじ口びん（各グループ1本）、15 mlねじ口ポリ試験管（各グル
ープ1本）、1.5 mlエッペンドルフチューブ（各グループ9本）
(1)土壌試料30ｇを100 mlビーカーに採取し、270 mlの滅菌水の入った500 mlねじ口びんに
移し、数回ビーカーに懸濁水を戻して土壌試料を洗い込む。（各グループ1本）
(2)密栓して手で10分間振盪（しんとう＝shake）(2回/sec)して、土壌試料を分散、懸濁させ
る。（希釈液1）（10倍希釈：10-1 g/ml）
(3)希釈液1の1 mlをマイクロピペットでとって、9 mlの滅菌水が入った15 mlねじ口ポリ試
験管に加え、ふたをしてよく振盪する（ピペットチップは土壌粒子が詰らないように先
端を5 mm程度切り取って使用）。（希釈液2）（102倍希釈：10-2 g/ml）
(4)希釈液2の0.1 mlをマイクロピペットでとって、0.9 mlの滅菌水が入ったエッペンドルフ
チューブNo.3に加え、ふたをしてよく混合する。（希釈液3）（103倍希釈：10-3 g/ml）
(5)チューブNo.3から0.1 mlをとって、チューブNo.4に加え、ふたをしてよく混合する。
（希釈液4）（104倍希釈：10-4 g/ml）
5
11
(6)同様にして希釈液5～11を調製する（10 倍希釈～10 倍希釈）。
４．土壌試料希釈液のマイクロタイタープレート接種（無菌操作）・培養（各グループ1枚）
全細菌・アンモニア生産菌計数（MPN法）用、9希釈段階で各5ウエル
(1)希釈液3の0.1 mlをマイクロピペットで、培地分注済みプレートの横No.3の5ウエル（A
～E）に接種（混合は不要）
(2)希釈液4の0.1 mlを、プレートの横No.4の5ウエルに接種（混合は不要）
(3)同様にして希釈液5～11をプレートの横No.5～No.11に接種
(4)プレートをシールバッグに入れて、28℃恒温器内で7～14日間（今回は7日間）、静置培
養する。E5010 病害制御実験室
-4-
第 3 回（12/9）
１．マイクロタイタープレート（マイクロプレート）の細菌生育ウェルの計数
細菌生育の判定：細菌生育による培地の濁りまたは沈殿
(1)培養しているマイクロプレートをシールバッグから取り出し、ふたを開けて細菌の生育
を判定（プレートの下を黒色にし、明るい光を当てると見やすい）。マイクロプレート
の横No.3～No.11（希釈液3～希釈液11接種）について、それぞれ5個のウェルの内、
細菌の生育が認められるウェルの数を記録する。写真撮影もする。（各自）
マイクロプレートの細菌生育ウェル数
希釈液番号
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
細菌生育ウェル数
（このプレートをアンモニア生産菌計数にも使用するので取り扱い注意）
２．マイクロプレートのアンモニア生産菌生育ウェルの計数
アンモニア生産菌生育の判定：アンモニア生産による培地pHの上昇
培地pHの上昇の判定：pH指示薬BTBの色黄色(pH6以下) ― 緑 ― 青(pH7.6以上)
(1) マイクロプレートの横No.3～No.11、縦A～E（9×5）の全ウェルに、pH指示薬BTB
20μlをマイクロピペットで加える。（各グループ1枚）
(2) アンモニア生産菌生育ウェルを計数して記録する（プレートの下を白色にすると見や
すい）
。写真撮影もする。
（各自）
マイクロプレートのアンモニア生産菌生育ウェル数
希釈液番号
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
アンモニア生産菌
生育ウェル数
３．全細菌・アンモニア生産菌の最確値(MPN)の算出（各自）
(1)5個のウェルすべてで生育が認められる希釈段階の内、最も高い希釈段階から高希釈段
階の方に3段階の生育ウェルの数（例えば、5，2，0）を用いて、最確値表（10倍希釈5
連）から最確値を求める。
(2)得られる最確値は、用いた3希釈段階の内、中央の希釈段階の接種液（土壌希釈液）中
に存在した細菌数の最確値である。
最確値の記録は、例えば、「希釈液6、最確値0.49」とする。
４．全細菌・アンモニア生産菌の土壌中の菌密度の算出（各自）
得られた最確値は、接種した土壌希釈液0.1ml中の細菌数。この希釈液0.1 ml中の細菌数
から、もとの土壌試料1g中の細菌数（細菌密度）に換算する。
［例］最確値を求めた土壌希釈液が希釈液6の場合
106倍希釈になっているので、希釈液6の1 mlには土壌試料10-6 gが含まれている。
よって、
土壌試料1 g中の細菌数＝最確値(0.1 ml中）×10×106
細菌密度（土壌試料1 g中の細菌数）は4.9×106/g土壌のように表示する。
-5-
５．全細菌密度・アンモニア生産菌密度の表・グラフの作成（各自）
(1)各班内で情報交換して、各自、油粕添加土壌と油粕無添加土壌の両土壌の全細菌密
度・アンモニア生産菌密度を表にまとめる。また、菌数を対数表記した菌密度も表にす
る。レポート作成ではこれらの表をグラフ用紙に作成する。
表１．土壌中の全細菌密度とアンモニア生産菌密度（菌数/g土壌）
無添加
全細菌
ナタネ油粕添加
アンモニア生産菌
○.○ ×１０○
（○○億・万）
全細菌
○.○×１０○
（○○億・万）
アンモニア生産菌
○.○ ×１０○
（○○億・万）
○.○×１０○
（○○億・万）
表２．土壌中の全細菌密度とアンモニア生産菌密度（菌数の対数/g土壌）
無添加
全細菌
○.○○
ナタネ油粕添加
アンモニア生産菌
全細菌
○.○○
○.○○
アンモニア生産菌
○.○○
(2) グラフ用紙に菌数を縦軸にして棒グラフを作成する。
グラフの縦軸は「菌数(×106)/g土壌」のように。
また、菌数の対数を縦軸にした棒グラフも作成する。縦軸は「菌数の対数/g土壌」。
-6-
レポートの作成・提出
１．レポートは手書きで作成する。
２．レポートの内容
・テーマ、目的、方法
「実習の概要」
（p.1-2）の内容をもとに記述する。必要に応じて「マニュアル」
（p.3-6）
の内容で簡潔に補完する。
「マニュアル」を書き写す必要はない。
・結果と考察
「実習の概要」
（p.2）にある「課題１」と「課題２」について書く。
「課題１」の補足：実験で各自が得た写真、データ（生育ウェル数、MPN）、計算式・
計算結果および最終日に作成した表・グラフ（グラフ用紙に作成した完成版）
を含める。
「課題２」の補足：計算式・計算結果と考察を書く。計算では、
「増加数」及び「何
倍になったか」を求める。
・最後に、その他の考察または感想を書く。
３. 提出期限に遅れないように提出する。
-7-
最確f
薩 CMostp
robableNumber)表
凶器希釈 5連
P
l
P
3
P
2
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一
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