2014 小児感染免疫 Vol. 26 No. 3 395 第 45 回日本小児感染症学会教育講演 細胞間接着装置タイト結合と生体防御 ―ヒト鼻粘膜上皮を中心に― 澤 田 典 均＊ はじめに フェンス機能 バリア機能 シグナル伝達 ヒトの身体は，上皮細胞によって外界から隔絶 されている．例えば，消化管では粘膜上皮細胞が 身体の内外を隔絶し，肝細胞の毛細胆管内の胆汁 は血中に漏れ出ることがない．このような生体バ リアの本体は，細胞と細胞の隙間（paracellular space）をシールするタイト結合である ．さら 1,2） 基底膜 図 1 タイト結合の機能 にヒトの身体は，半独立した内部環境をもついく つかのコンパートメントからなっている．例え る生体防御の最前線に位置し，自然免疫および獲 ば，心臓血管系は，それ自体が内皮細胞に囲まれ 得免疫において重要な役割を担っている．本稿で た閉鎖腔であると同時に，中枢神経系や網膜など は，前半ではタイト結合について概説し，後半で を隔絶するバリア（blood tissue barrier）となっ ヒト鼻粘膜上皮細胞を用いたタイト結合の機能調 ている．このような細胞間隙の物質の通過を制御 節機構についてわれわれの研究を中心に紹介する． する働きをタイト結合のバリア機能という．した がってタイト結合の機能失調は，浮腫，黄疸，下 Ⅰ．タイト結合とその機能調節1,2） 痢といったヒトの病態と深くかかわっている．タ タイト結合は，上皮細胞の管腔面近くに存在 イト結合は，細胞間での物質の透過を制御するバ し，細胞の全周をベルトのように取り巻き，膜貫 リア機能だけでなく，細胞膜の頂側（apical）領 通性蛋白質 claudin により，細胞膜と細胞膜を密 域と基底側（basolateral）領域の境界を形成し， 着させている．そのためタイト結合は，細胞間隙 細胞膜上の蛋白質や脂質の拡散を防ぎ細胞極性を （パラセルラー経路） （図 1 の矢印）を通過する物 維持するフェンス機能を有している．またシグナ 質の透過性を制御するバリア機能をもつ．凍結割 ル伝達のプラットホームとしても重要な役割を果 断レプリカ法で観察すると，タイト結合は膜内蛋 たしている2∼4） （図 1） ． 白質が数珠状に配列したストランドによる網目構 の透過を防いでいることから，最近では，タイト タイト結合は，claudin や occludin などの膜貫 粘膜上皮細胞のタイト結合が物理的に外来抗原 造を呈する（図 2） ． 結合は自然免疫系の重要な要素として注目されて 通分子，それらを固定する ZO 1 をはじめとする いる．ヒト鼻粘膜は，さまざまな外来抗原に対す 裏打分子，さらにそれらと結合する数十の分子か ＊ 札幌医科大学医学部病理学第二講座 〔〒 060 8556 札幌市中央区南 1 条西 17 丁目〕 396 2014 a b Tight junctions bar : 50 nm Paracellular space 図 2 タイト結合の模式図（a）とタイト結合の凍結割断レプリカ像（b） らなる蛋白複合体である．タイト結合の最も重要 な蛋白である claudin は分子量約 23 kDa で，膜貫 通 ド メ イ ン を 4 個 も ち，2 つ の 細 胞 外 ル ー プ （ECL）を有している．Claudin は，C 末端の PDZ ドメインを介して前述の ZO 1 だけでなく ZO 2， ing and membrane domain） の subfamily である． Occludin は タ イ ト 結 合 の 最 も 信 頼 で き る マ ー カ ー で あ り，tricellulin と LSR，ILDR1，ILDR2 は 3 細胞接着点に特異的に局在する．しかし，こ れらの蛋白の固有の機能は，これから明らかにさ ZO 3，PATJ，MUPP1 などの蛋白と結合してい れよう 6）．細胞質蛋白として ZO 1，ZO 2，ZO 3 る．Claudin の 1 つ目の ECL は，数個の荷電性ア や cingulin など多くのタイト結合裏打ち蛋白が見 ミノ酸を含みイオンの選択的透過性に関与し，ス 出されている（表 1）．特に ZO 1 と ZO 2 は，足 トランドを構成する claudin の組合せ（ヘテロポ 場蛋白としてタイト結合形成に必須である． リマー）により，物質を透過しやすくなるポアを タイト結合は，サイトカイン受容体，toll like 形成すると考えられている．2 つ目の ECL は，ス receptor，protease activated receptor などを介 トランド形成に関与している5）．Claudin は，少な したさまざまなシグナル伝達系によって，細胞特 くとも 27 種の遺伝子ファミリーを形成しており， 異的に制御されていると考えられている．最近， おのおの単独でストランドを形成することができ 神経線維腫症Ⅱ型の責任遺伝子蛋白 Merlin がタ る．Claudin は，1 細胞に複数の発現が認められ， イト結合に局在することが明らかになった．Mer- claudin の組合せが細胞や臓器の特異性に関与し lin が器官サイズや再生を決定したり，腫瘍の発生 ていると考えられている．サイトカインなどによ を抑制する Hippo 経路7）の情報伝達に重要である る発現制御は，それぞれの claudin 特異的であり， ことから，腫瘍形成の観点から注目されている． かつ細胞特異的であることが明らかになってきた． タ イ ト 結 合 バ リ ア 機 能 は， 細 胞 内 ATP，actin Claudin のほか，膜貫通蛋白質 occludin，JAM， filament，gap junction 機能に影響を受けること tricellulin，MarvelD3 な ど が 発 見 さ れ て い る． が知られている． Occludin，tricellulin，MarvelD3 は，MARVEL （MAL and related proteins for vesicle traffick- 2014 小児感染免疫 Vol. 26 No. 3 397 タイト結合のバリア機能低下が知られている．タ Ⅱ．タイト結合とヒト疾患1） イト結合には細胞極性を維持する働きもあり，多 ヒト遺伝性疾患では，低マグネシウム血症の原 くのがん細胞では，タイト結合が未熟である． 因遺伝子（claudin 16， 19） ，感音性難聴（clau- 薬物治療の視点から，BBB 血管内皮細胞は，タ din 14，tricellulin） ，魚鱗癬と胆管炎の合併症 （claudin 1）が報告されている．タイト結合バリ イト結合が非常に発達しており，脳腫瘍の有効な 薬物治療が制限されている．BBB に限らず，消化 ア機能は，さまざまな疾患で機能低下を起こす． 一 般 的 な 原 因 と し て， 虚 血 な ど に よ る 細 胞 内 ATP の低下，細菌毒素などによるマイクロフィ ラメントの変化，ギャップ結合の機能低下があ る．感染症との関係では，レオウイルスが JAM A，コクサッキーウイルスとアデノウイルスが CAR をレセプターとしている（図 3） ．最近，C 型 肝 炎 ウ イ ル ス が ヒ ト 肝 細 胞 に 感 染 す る 際 に， CD81 とともに，occludin，claudin 1 が co recepor として必須であることが明らかになった．さ らにコレラ菌は occludin，ウエルシ菌は claudin 3，claudin 4，ヘリコバクターピロリの CagA は par 1 に結合して，腸管病原性大腸菌，クロスト リジウムディフィシル，ジフテリア菌などは，ア クチン重合を変化させ，タイト結合機能を低下さ せる．VEGF を筆頭に多くのサイトカインがタイ ト結合機能を低下させるので，炎症や腫瘍組織で は血管内皮細胞のタイト結合機能が低下（血管透 過性が亢進） している．表 2 に示すような疾患で， 表 1 タイト結合関連蛋白 ・タイト結合膜蛋白 Claudin family（cldn 1∼ 27） ：タイト結合ストランド の本体 MarvelD3 subfamily（occludin，tricellulin，MarvelD3） Immunoglobulin superfamily（JAM family，ESAM， CAR） LSR（lypolysis stimulated lipoprotein receptor） LSR related proteins（ILDR1，ILDR2） ・タイト結合細胞質蛋白 PDZ domain を含む ZO 1，ZO 2，ZO 3，MAGI 1，MAGI 2，MAGI 3，MUPP 1，PAR 3，PAR 6，PALS 1，PATJ， mDlg，Scrib，afadin PDZ domain を含まない Cingulin，Symplekin，heterotrimeric G protein， Rab3b，Rab13，ZONAB，huASH1，GEF H1， aPKC，PP2A，PTEN，7H6，Pilt，CRB3，LYRIC， CASK/LIN 2，Merlin，Angiomotin/JEAP，TAZ/ YAP，etc. Apical Apical Crumbs complex C型肝炎ウイルス （claudin1，6，9） Crumbs claudin TJ Par complex 腸毒素 （CPE） （claudin−3，−4） PAR−6 occludin C型肝炎ウイルス レオウイルス JAM−A コクサッキーウイルス アデノウイルス PATJ PALS1 SARSウイルス MAGI−1 アデノウイルス ヒトパピローマウイルス インフルエンザAウイルス MUPP1 アデノウイルス ヒトパピローマウイルス 狂犬病ウイルス ZO−1 デングウイルス ダニ媒介性脳炎ウイルス ZO−2 アデノウイルス aPKC PAR−3 アデノウイルス ヒトパピローマウイルス CAR Lateral 図 3 タイト結合関連分子とウイルス分子の相互作用 398 2014 表 2 タイト結合バリア機能に関連したヒト疾患 鼻咽腔粘膜上皮の重要な働きである．腸管での研 1 ．血管系：浮腫，サイトカイン血症，糖尿病性網膜症， 多発性硬化症，血行性転移 2 ．消化管系：細菌性胃炎，偽膜性腸炎，クローン病， 潰瘍性大腸炎，カルシウム吸収障害（ビタミン D 欠 乏性） 3 ．肝：黄疸，原発性胆汁性肝硬変，原発性硬化性胆管 炎 4 ．呼吸器系：喘息，アレルギー性鼻炎，呼吸窮迫症候 群 5 ．ウイルス感染：レオウイルス，アデノウイルス，コ クサッキーウイルス，ロタウイルス，HIV ウイルス 6 ．皮膚：アトピー性皮膚炎 7 ．遺伝性疾患：家族性低マグネシウム血症，難聴，囊 胞性線維症 8 ．その他：卵巣過剰刺激症候群（OHSS） 究では，非特異的な輸送経路として M 細胞を介す るものが知られているが，ヒト消化管免疫の全容 はいまだ不明な点が多い． 筆者らは，まず免疫組織学的にヒト鼻粘膜組織 のタイト結合蛋白の検索を行った．驚いたことに 上皮細胞のみならず樹状細胞にもタイト結合蛋白 の発現が認められた．樹状細胞は，上皮細胞間の タイト結合を突き抜けるようにその突起を鼻腔内 8） へとのばしていた（図 4） ．アレルギー性鼻炎患 者では，上皮内に存在する樹状細胞の数が有意に 増加しており，さらに上皮細胞では，アレルギー 性炎症のマスタースイッチである thymic stromal lymphopoitin（TSLP）の発現が亢進していた9）． 上皮細胞タイト結合と樹状細胞の解剖組織関係 管，気道などの上皮細胞タイト結合は非常に発達 は，皮膚組織，chronic dermatitis 患者の皮膚組織 しており，生体防御の重要な要素である一方，薬 で報告されている10,11）． 剤吸収の障壁となっている．もし，これらの上皮 細胞のタイト結合を可逆的に調節することができ Ⅳ．培養ヒト鼻粘膜上皮細胞のタイト結合 れば，より効率的に薬物を投与できると期待され TSLP は主に上皮細胞から分泌されることか ている． ら，ヒト鼻粘膜上皮細胞のタイト結合の機能制御 Ⅲ．ヒト鼻粘膜組織とタイト結合 を検索するために，レトロウイルスベクターを用 いてテロメラーゼを正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に導 鼻咽腔粘膜は，自然免疫，粘膜免疫，獲得免疫 入・延命化して実験に用いた12）．この細胞は， の最前線である．外来因子の侵入をいかに防御す toll like receptor（TLR）1 10 を発現しており， るか，あるいは外来抗原をいかに感知するかにつ TLR3 リガンドにより TSLP 産生が有意に上昇し いては，近年，自然免疫に関する重要な受容体の た9）．上皮細胞から TLR3 リガンドによって TSLP 発見により，抗原認識や炎症のメカニズムが解明 が放出される．それでは樹状細胞ではどうだろう しつつある．しかし，これらの反応が惹起するた か？ 残念ながら，ヒト鼻粘膜から樹状細胞がと めには，抗原などの物質が上皮細胞バリアを超 え，上皮下へ輸送されなければならない．この上 皮バリアの本体がタイト結合であり，これまで病 原体に対して物理的な障壁とした自然免疫の最前 線と考えられてきた．しかし，タイト結合が極め てダイナミックに制御されていることから，自然 れないため，マウス樹状細胞株に TSLP を作用さ せると claudin 7 発現が有意に上昇した13）．鼻粘 膜組織の claudin 7 免疫でも，鼻粘膜上皮細胞間 に散在性に存在する樹状細胞と上皮細胞に claudin 7 発現が確認された14）．樹状細胞は，何らか のタイト結合分子を発現して上皮細胞間を滑らす 免疫におけるタイト結合の役割に興味がもたれて ように突起を伸長させる，と想像される．この点 いる．鼻粘膜上皮細胞層を介した物質輸送メカニ は，今後ヒト鼻粘膜に存在する樹状細胞を用いて ズムは，鼻咽腔での炎症・免疫反応過程でいまだ 確認する必要がある． 解明されていない重要なステップである．すなわ アレルギー性鼻炎のアレルゲンには，Der p 1， ち，特異的免疫反応をもたらす物質の認識には樹 花粉やアスペルギルス胞子など，プロテアーゼ活 状細胞などが重要な役割をもつが，薬剤の輸送， 性をもつものがあり，protease activated recep- 効率よい抗原を含む物質の粘膜固有層への輸送も tor（PAR）の関与が考えられている．気道上皮細 2014 小児感染免疫 Vol. 26 No. 3 399 アレルゲン 抗原 微生物 IgG タイト結合 PRRs FcRn PAR NF−κB M 細胞 ケモカイン サイトカイン 活性化 上皮細胞 PRRs：pattern recognition receptors PAR：protease−activated receptor 樹状細胞 図 4 鼻粘膜におけるタイト結合と自然免疫系 生体の内外の境界にタイト結合があり，外来分子が体内に侵入するには，細胞内を通過する経路（transcellular pathway）と細胞間隙のタイト結合を通過する経路（paracellular pathway）がある． 胞では，緑膿菌はエラスターゼによりタイト結合 を壊し上皮バリア機能の低下を誘導すると考えら Ⅴ．実験系としての培養ヒト鼻粘膜上皮細胞 れている．そこで緑膿菌エラスターゼを培養鼻粘 さきにタイト結合蛋白を標的とするウイルスを 膜上皮細胞に作用させ RT PCR 法で調べると， 紹介したが，鼻粘膜は上気道の入り口であり，多 PAR 1 の発現は影響を受けないが，PAR 2 の発 くの上気道感染ウイルスの初感染部位である．培 現は一過性に低下した．タイト結合バリア機能は 養ヒト鼻粘膜上皮細胞に RS ウイルス（RSV）を やや遅れて一過性に低下した．単に PAR 2 を 感染させ検討した．この細胞は，RSV に感染する ノックダウンしてもタイト結合蛋白の発現が低下 と，全身の上皮細胞が抗ウイルス状態になるよう した．一方，PAR 2 をノックダウンしてエラス にシグナルとしてⅢ型インターフェロン（inter- ターゼを作用させても，タイト結合蛋白の発現低 feron λ）を放出する16）．一方 RSV 感染細胞にお 下が認められた ．この結果は，緑膿菌エラス 15） いては，ウイルスは細胞極性を維持するように， ターゼは，PAR 2 を介する経路と介さない経路に 細胞極性を規定するタイト結合分子の発現を誘導 より，タイト結合バリア機能を低下させることを する．RSV は，必ず上皮細胞の頂面（apical sur- 示している．面白いことに PAR 2 アゴニストを face）から侵入し，頂面から出芽し，鼻腔から下 作用させると，タイト結合に対するエラスターゼ 気道へと感染が拡大する17）．RSV 増殖は，NFκB の作用が抑制された． 依存性があり，NFκB 活性抑制作用があるクルク ヒト鼻腔における常在菌と TLR や PAR の関 ミン（ウコンの黄色色素）18）やフムロン（ホップの 係，さらにそれらの相互作用の結果としてのタイ 苦み成分）19）が RSV の増殖を抑制した．RSV に特 ト結合バリア機能とのかかわりの解明が今後の課 題である（図 4）． 異的に効果を期待できるわけではないが，治療の 一助になる可能性がある， 400 2014 おわりに 病気は，遺伝子と環境の相互作用で発症する． 感染症は環境因子の影響が強い．その意味で生体 と外界の境界をなすタイト結合が果たす役割は大 きく，自然免疫の最初の関門ともいえる．タイト 結合は，通常あらゆる異物に対して閉じられてい るが，異物からの刺激やサイトカインストームに よりいったん開くと，その機能はダイナミックに 変化する．タイト結合の機能制御の解明は，drug delivary system の新しい局面を拓くと期待され る．ヒトを念頭に生体バリアの変化を解析するに は，やはり“ヒト” “正常”上皮細胞を使うことが 重要であろう．また実験系においても，常在細菌 叢との関係を考慮する必要があろう． ヒト疾患とタイト結合について改めて考える機 会を与えていただいた堤裕幸教授，氷見徹夫教授 をはじめとする札幌医科大学耳鼻科学講座の共同 研究者に感謝します． 文 献 1）Sawada N：Tight junction related human diseases. Pathol Int 63：1 12, 2013 2）Schneeberger EE, Lynch RD：The tight junction：a multifunctional complex. Am J Physiol Cell Physiol 286：C1213 1228, 2004 3）Murata M, Kojima T, Yamamoto T, et al：Down regulation of survival signaling through MAPK and Akt in occludin deficient mouse hepatocytes in vitro. Exp Cell Res 310：140 151, 2005 4）Sugimoto K, Ichikawa Tomikawa N, Satohisa S, et al：The tight junction protein claudin 6 induces epithelial differentiation from mouse F9 and embryonic stem cells. PLoS One 8：e75106, 2013 5）Rossa J, Ploeger C, Vorreiter F, et al：Claudin 3 and claudin 5 protein folding and assembly into the tight junction are controlled by non conserved residues in the transmembrane 3（TM3） and extracellular loop 2（ECL2）segments. J Biol Chem 289：7641 7653, 2014 6）古瀬幹夫：トリセルラータイトジャンクションの 分子機構．薬学雑誌 134：615 621，2014 7）Zhao B, Tumaneng K, Guan KL：The Hippo pathway in organ size control, tissue regeneration and stem cell self renewal. 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