最新の微粒子充.剤カラムを使いこなすテクニックと高速

Sep/5/2014 JASIS
最新の微粒子充塡剤カラムを使いこなすテクニックと
高速分析ソリューション
Tips for High-throughput HPLC Analysis by Newly Developed Columns
with Fine Packing Materials
東ソー株式会社
本日の講演内容
1.
微粒子充塡剤カラムの特徴
2.
高速分析への移行におけるカラムと溶離条件の設定
3.
高速分析への移行におけるシステムの最適化
4.
アプリケーション例の紹介
180
160
140
Signal Intensity, mAU
120
100
80
60
40
20
0
-20
0.0
0.5
1.0
1.5
Retention time, min
2.0
2.5
3.0
1
1. 微粒子充塡剤カラムの特徴
UHPLC（Ultra High Performance Liquid Chromatography）
微粒子充塡剤を用いて、高速分析、高分離分析を実現
微粒子充塡剤
粒子径：Sub 2μm
微細粒子化により高性能化と同時に、高圧力損失化
粒度分布
狭い分布により、高性能化。分布が広い場合、性能低下や詰りの原因
機械的強度
十分な機械的強度が無いと物理的に破砕
高性能化
カラム内外におけるバンド拡散の抑制
カラム内におけるバンドの拡がりの要因
・多流路拡散（Multiple path）
Hp= 2λdp
dp : 充塡剤の平均粒子径
λ : 定数
・分子拡散（Molecular diffusion）
LV
LV
Hd = 2γDm/v
Dm : 溶離液中における分析種の拡散係数
γ : 充塡剤による拡散制限因子
v : 線速度
・物質移動（Mass transfer）
Hm = ωdp2 v /Dm
Dm : 溶離液中における分析種の拡散係数
ω : 定数
dp : 充塡剤の平均粒子径
v : 線速度
2
Van Deemter 曲線
カラムの理論段高さは、カラム内におけるバンド拡散の総和として表される。
Hp : 多流路拡散のパラメーター
Hd : 分子拡散のパラメーター
Hm : 物質移動のパラメーター
H = Hp + Hd + Hm
= 2λdp + 2γDm/v +ωdp2 v /Dm
Hm
Hd
Hp
分子拡散支配
物資移動支配
各粒子径の充塡剤によるVan Deemter 曲線とカラム圧力
0.0025
100
90
0.002
80
1.9μm / 100 mm
Pressure Drops, MPa
HETP, cm
70
0.0015
2.3μm
3.0μm
0.001
1.7μm
1.7μm / 50 mm
60
50
40
1.9μm / 50 mm
30
0.0005
20
1.7μmの最適線速度域
0
0
1
2
3
4
2.3μm / 50 mm
10
5
LV, mm/sec
6
0
0
1
2
3
4
5
6
LV, mm/sec
最適線速度 Voptimun = (2γDm2/ω)1/2 /dp
カラム圧力Pdp1= Pdp2* (dp22/dp12)
最小理論段高 Hmin= ( 2λ+ 2（2γω)1/2) dp
例：粒子径2.3μm→1.7μm；
（2.32/1.72)=1.8倍
3
Kinetic Plotによる性能評価の例
全多孔性充塡剤のみでなく、表面多孔性充塡剤、モノリスとの総合評価に対応
一定圧力下での、各線速度で送液可能な最長カラムによる理論段数N
長い
遅い
-6
t0=1000 s
ｔ0 N2
カラム長
線速度
100 s
短い
速い
10 s
1s
Δp=40 MPa
log(t0/N2)
小さいほど高性能
-6.5
（時間短縮、高理論段）
-7
3.0μm
1.7μm
5.0μm
-7.5
この圧力における
カラム性能の限界
-8
6
5.5
5
4.5
log N
4
3.5
3
参照文献
1) H. Poppe, J. Chromatography A, 778, 3-21(1997)
2) G. Desmet, D. Clicq, and P. Gzil, Anal. Chem., 77(13), 4058-4070 (2005)
3) S. Miyazaki, et al, Chromatography, 32(2), 87-94 (2011)
2. 高速分析への移行におけるカラムと溶離条件の設定
USP General Chapter621の改定（2014.8.1）
USP収載のHPLC条件を変更する場合のガイドライン（バリデーション不要）
変更前
変更後
カラム内径
線速度を維持すれば変更可
線速度を維持すれば変更可
カラム長さ
±70 %の範囲で変更可
L/dpを-25 %～+50 %の範囲で変更可
粒子径
最大50 %の減少が可能、増加は不可
（L：カラム長さ、dp：粒子径）
カラム断面積比により調整する。
更に、±50 %の範囲で変更可
カラム断面積比と粒子径比により調整する。
粒子径3μm以上から未満、或いは3μm以
上から未満に変更する場合、理論段数が
20 %以上低下しない範囲での線速度の変
更可。
更に、±50 %の範囲で変更可
流速
微粒子充塡剤による高速分析への移行が可能となる
4
カラムと溶離条件の設定～充塡剤の粒子径とカラム長さ
・ L/dpが同等のカラムを選択する
分離度 R =
N
√N
x α-1 x
4
α
max
k
k+1
N：カラムの理論段数 α：分離係数
k：保持係数
L：カラム長さ
dp：充塡剤の粒子径
C：定数（0.4前後）
L
dp
=Cx
30 mm
α：充塡剤の分離特性に依存
k：充塡剤の保持力に依存
50 mm
1.9
75 mm
Particle size, μm
100 mm
充塡剤の特性が同一の場合、
αとkは変化しない。
150 mm
30 mm
50 mm
3
75 mm
100 mm
L/dpを維持することで、分離が
維持される
150 mm
50 mm
5
150 mm
250 mm
0
20000
40000
L/dp
60000
80000
カラムと溶離条件の設定～流速
・線速度を合わせる。更に、粒子径比に反比例させて設定する
d22
F2 = F1 x d12
x
dp1
dp2
F1, F2：移行前後の流速（1；移行前, 2；移行後）
d1, d2：移行前後のカラム内径
dp1, dp2：移行前後の充塡剤粒子径
0.0025
最適線速度
Voptimun = (2γDm2/ω)1/2 /dp
HETP, cm
Van Deemter曲線より、最適線速度は、
充塡剤の粒子径の逆数に比例する。
0.002
条件の変更例
条件1： 4.6 mmI.D. x 150 mm, 粒子径5μm, 流速 1.00 mL/min
→
条件2： 3.0 mmI.D. x 50 mm, 粒子径1.9μm
流速 1.0 x (3.0)2 / (4.6)2 x 5.0 / 1.9 = 1.12 mL/min
0.0015
3.0μm
2.3μm
0.001
1.7μm
0.0005
最適線速度域
0
0
1
2
3
4
5
6
LV, mm/sec
5
高速分析への移行
粒子径：5.0 μm
カラム：4.6 mmI.D. x 250 mm
流速：1.00 mL/min
1
A
2
3
4
5
6
0
5
7
10
15
1
2
粒子径：3.0 μm
カラム：4.6 mmI.D. x 150 mm
流速：1.67 mL/min
3
4
5
6
0
1
C
1
4
3
4
5
6
0.5
7
1
1.5
Retention time, min
3.77
C
19,361
3.90
2
Column : TSKgel ODS-120H
Eluent : A ; Water
B ; Acetonitrile
A/B=35/65
Detection : UV 254 nm
Column temp. : 40 ℃
Peaks:
1 ; Methyl 4-hydroxybenzoate, 2 ; Ethyl 4-hydroxybenzoate
3 ; n-Propyl 4-hydroxybenzoate, 4 ; n-Butyl 4-hydroxybenzoate
5 ; n-Pentyl 4-hydroxybenzoate
6 ; n-Hexyl 4-hydroxybenzoate
7 ; n-Heptyl 4-hydroxybenzoate
グラジエント条件の設定
・カラム容量と流速に合わせて比例設定する
Tg2 = Tg1 x
Vc2
Vc1
100
x
F1
F2
Tg1, Tg2：移行前後のグラジエント時間（1；移行前, 2；移行後）
Vc1, Vc2：移行前後のカラム容量
F1, F2：移行前後の流速
UHPLC条件
HPLC条件
80
B, %
0
20,236
5
粒子径：1.9 μm
カラム：3.0 mmI.D. x 100 mm
流速：1.12 mL/min
2
4.76
B
流速:
1.0 x (4.6)2/(4.6)2 x 5.0/3.0 = 1.67 (Case B)
1.0 x (3.0)2/(4.6)2 x 5.0/1.9 = 1.12 (Case C)
7
2
3
Retention time, min
R(Peak_1-2)
23,940
L/dp = 250,000/5 = 50,000
(Case A)
150,000/3 = 50,000
(Case B)
100,000/1.9 = 52,631 (Case C)
Retention time, min
B
TP(Peak_7)
A
60
Tg2
40
Tg1
20
0
0
5
10
Retention time, min
15
20
6
カラムと溶離条件の設定～ピークキャパシティー
ピークキャパシティー（ピーク容量、Peak capacity）
・ HPLCカラムの分離性能を表すパラメーターの１つ
・そのカラムの理論段数が全ての溶質において等しいと仮定した場合に、
クロマトグラム上のある区間（通常は、最初の素通りピークの溶出から
最後のピークの溶出までの間）における分離可能な成分数（n）を表したもの
Giddingsの式1)
ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ溶離曲線
ｼｸﾞﾅﾙ強度
Vn
Vn
V1
N：カラムの理論段数
V1：最初の素通りピークの溶出容量
Vn：最後のピークの溶出容量
Tg：グラジエント溶離時間
A%
V1
√N
ln
4
n　= 1 +
ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ %
B%
ピークキャパシティーを向上させる
→ N及びVnを増加させる
Tg
１）J.C. Giddings, Anal. Chem., 39(8), 1027-1028 (1967)
高速分析への移行～グラジエント条件
A
1
粒子径：5.0 μm
カラム：4.6 mmI.D. x 150 mm
流速：1.00 mL/min
グラジエント時間：12 min
2
3
4
0
5
6
5
7
10
TP(Peak_7)
R(Peak_1-2)
PC
A
39,821
5.65
58
B
35,939
4.75
61
C
32,894
4.42
80
15
Retention time, min
B
1
粒子径：1.9 μm
カラム：3.0 mmI.D. x 75 mm
流速：1.12 mL/min
グラジエント時間：2.5 min
2
3
4
5
6
0
1
7
カラム容量：
2490μL (4.6 mmI.D. x 150 mm)
530μL (3.0 mmI.D. x 75 mm)
グラジエント時間：
12 x 530/2490 x 1.0/1.12 = 2.3 (Case B)
2
3
Retention time, min
1
C
流速：1.9 mL/min
グラジエント時間：2.0 min
温度：60 ℃
2
3
4
5
0
0.5
6
1
Retention time, min
7
1.5
Column : TSKgel ODS-120H
Eluent : A ; Water
B ; Acetonitrile
Gradient : B 55%→73%
Detection : UV 254 nm
Column temp. : 40 ℃
Peaks:
1 ; Methyl 4-hydroxybenzoate, 2 ; Ethyl 4-hydroxybenzoate
3 ; n-Propyl 4-hydroxybenzoate, 4 ; n-Butyl 4-hydroxybenzoate
5 ; n-Pentyl 4-hydroxybenzoate
6 ; n-Hexyl 4-hydroxybenzoate
7 ; n-Heptyl 4-hydroxybenzoate
7
3. 高速分析への移行におけるシステムの最適化
装置構成図及びカラム外拡散効果
サンプルインジェクター
遅延容量
（Dwell Volume）
ミキサー
サンプルインジェクター
検出器
カラム
ミキサー
遅延容量
（Dwell Volume）
ポンプ
拡散容量
（Bandspread Volume）
廃液
ポンプ1
カラム
検出器
拡散容量
（Bandspread Volume）
廃液
電磁弁
ポンプ2
溶離液1
溶離液2
溶離液1
高圧グラジエントシステム
溶離液2
低圧グラジエントシステム
データ処理条件の影響
・検出器のレスポンス
・データ収集時のサンプリング点数
システムの最適化～カラム外拡散（配管容量）
インジェクター～カラム間
内径：0.1 mm, 長さ：400 mm
容量：3.1 μL
1
2
3
4
5
6
7
インジェクター～カラム間
内径：0.17 mm, 長さ：400 mm
容量：9.1 μL
1
2
3
4
5
6
0
0.5
1
1.5
Retention time, min
7
2
2.5
3
TP
0.1 mm
0.17 mm
Peak_1
10,231
5,306 (51.9)
Peak_2
10,439
5,584 (53.5)
Peak_3
11,335
6,199 (54.7)
Peak_4
11,725
7,089 (60.5)
Peak_5
12,060
7,344 (60.9)
Peak_6
13,337
8,299 (61.7)
Peak_7
13,965
9,500 (68.0)
Column : TSKgel ODS-120H (1.9μm)
Column size : 3.0 mmI.D. x 100 mm
Eluent : A ; 0.1 % Formic acid in Water
B ; 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
A/B=8/2
Flow rate : 1.4 mL/min
Injection volume : 2 μL
Detection : UV 270 nm
Column temp. : 40 ℃
Peaks: 1 ; Sulfacetamide, 2 ; Sulfathiazole, 3 ; Sulfapyridine,
4 ; Sulfamerazine, 5; Sulfamethizole,
6 ; Sulfachloropyridazine, 7 ; Sulfadoxine
8
システムの最適化～カラム外拡散(セル容量)
1
セミミクロセル
2 3
4
Semi-micro cell
Normal cell
Height(Peak_4)
10.21
16.75 (164)
5
6
7
1
2
TP(Peak_4)
11,725
8,185 (69.8)
R(Peak_1-2)
2.90
2.09 (72.1)
Cell volume
2.5μL
12 μL
Pass Length
5 mm
10 mm
Inlet volume
5.0μL
50μL
標準セル
3
4
5
6
Column : TSKgel ODS-120H (1.9μm)
Column size : 3.0 mmI.D. x 100 mm
Eluent : A ; 0.1 % Formic acid in Water
B ; 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
A/B=8/2
Flow rate : 1.4 mL/min
Injection volume : 2 μL
Detection : UV 270 nm
Column temp. : 40 ℃
Peaks: 1 ; Sulfacetamide, 2 ; Sulfathiazole, 3 ; Sulfapyridine,
4 ; Sulfamerazine, 5; Sulfamethizole,
6 ; Sulfachloropyridazine, 7 ; Sulfadoxine
7
0
0.5
1
1.5
Retention time, min
2
2.5
3
システムの最適化～検出器のレスポンス
1
2 3
フィルタ処理なし
4
5
6
7
50 ms
100 ms
500 ms
1000 ms
0
0.5
1
1.5
Retention time, min
2
2.5
3
Res
(ms)
TP
(Peak_4)
W1/2
(Peak_1)
R
(Peak_1-2)
Noise
処理
なし
14,875
(100)
0.860
(100)
3.11
(100)
0.026
(100)
50
14,813
(99.6)
0.868
(101)
3.10
(99.7)
0.019
(73.0)
100
14,212
(95.5)
0.896
(104)
2.92
(93.9)
0.017
(65.3)
500
8,639
(58.1)
1.319
(153)
2.08
(66.9)
0.014
(53.8)
1000
4,469
(30.0)
2.018
(235)
1.34
(43.1)
0.012
(46.1)
Column : TSKgel ODS-120H (1.9μm)
Column size : 3.0 mmI.D. x 100 mm
Eluent : A ; 0.1 % Formic acid in Water
B ; 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
A/B=8/2
Flow rate : 1.4 mL/min
Injection volume : 2 μL
Detection : UV 270 nm
Column temp. : 40 ℃
Peaks: 1 ; Sulfacetamide, 2 ; Sulfathiazole, 3 ; Sulfapyridine,
4 ; Sulfamerazine, 5; Sulfamethizole,
6 ; Sulfachloropyridazine, 7 ; Sulfadoxine
9
システムの最適化～データ収集条件
Peak_1
30 ms
10 ms
100 ms
50 ms
200 ms
Sampling
Pitch
Data Point
Area(Peak_1)
RSD
(%, n=5)
10 ms
348
15.87
0.3
30 ms
116
15.88
0.4
50 ms
70
15.71
0.7
100 ms
35
15.70
1.1
200 ms
17
15.56
2.5
Column : TSKgel ODS-120H (1.9μm)
Column size : 3.0 mmI.D. x 100 mm
Eluent : A ; 0.1 % Formic acid in Water
B ; 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
A/B=8/2
Flow rate : 1.4 mL/min
Injection volume : 2 μL
Detection : UV 270 nm
Column temp. : 40 ℃
Peak: 1 ; Sulfacetamide
0.68
0.7
Retention time, min
0.72
0.74
まとめ：高速分析に移行する際の留意点
HPLC → UHPLC
1) カラムと溶離条件の設定
・充塡剤とカラムサイズ
充塡剤の粒子径とカラムの長さの比を考慮する。
・流速
線速度と粒子径比により設定
・グラジエント条件
カラム容量及びピークキャパシティー
2) システムの最適化
・配管、セル、ミキサーの容量（カラム外拡散）
遅延容量、拡散容量
・検出器のレスポンス
ピークの最小半値幅
・データ収集時のサンプリング点数
100ポイント/ピーク、S/Nより判断
180
160
140
120
Signal Intensity, mAU
0.66
100
80
60
40
20
0
-20
0.0
0.5
1.0
1.5
Retention time, min
2.0
2.5
3.0
10
4. アプリケーション例の紹介
ハロ酢酸類の高速分離
Monochloroacetic acid
Monochloroacetic acid
m/z 93 / 35
Column:
Eluent:
Gradient:
Flow rate:
Column temp.:
Injection vol.:
Dichloroacetic acid
TSKgel ODS-100V 3μm (4.6 mmI.D. x 15 cm)
A; 0.2 % formic acid in water
B; methanol
0 min (B 5 %) → 38 min (B 100 %) → 38.1 min (B 5 %)
0.2 mL/min
30 ℃
20 μL
m/z 127 / 83
水質試験法に準拠した分析条件
TSKgel ODS-120H (1.9 μm, 2.0 mmI.D. x 100 mm)
A; 0.2 % Formic acid in water
B; Acetonitrile
Gradient :
B conc. (0.0 min) 2 % → (3.0 min) 55 % →
(3.1- 5.0 min) 90% → (5.1- 8.0 min) 2 %
Flow rate :
0.5 mL/min
Column temp. : 50 ℃
Inj. vol. :
2 μL
Instrument :
Q TRAP (AB SCIEX)
Ionization :
ESI (Negative)
Mode :
SRM
Column :
Eluent :
Trichloroacetic acid
m/z 161 / 117
ステビオサイド粗精製物の高速分離
Stevioside
Siganl intensity, mABU
10
Column :
Eluent :
TSKgel Amide-80 5μm (4.6mmI.D. x 25 cm)
5 mmol/L Pottasium Phosphate buffer(pH3.5)
/Acetonitrile=20/80
Flow rate :
1.00 mL/min
Injection volume : 5 μL
Column temp. : 40 ℃
Detection :
UV (210 nm)
5
0
0
5
10
Retention time, min
15
Siganl intensity, mABU
10
8
6
Column :
Eluent :
TSKgel Amide-80 2μm (3.0 mmI.D. x 15 cm)
5 mmol/L Pottasium Phosphate buffer(pH3.5)
Acetonitrile=20/80
Flow rate :
1.20 mL/min
Injection volume : 1 μL
Column temp. : 40 ℃
Detection :
UV (210 nm)
4
2
0
0
1
2
Retention time, min
3
4
11
市販感冒薬中の有効成分の高速分析
Peaks
1: Maleic acid (from Chlorpheniramine maleate)
2: Fumaric acid (from Clemastine fumarate)
3: Aminophylline
4: Acetoaminophen
5: Caffeine
6: Benfotiamine
7: Dihydrocodeine
8: dl-Methylephedrine
9: Ethenzamide10: 1-(2-Bromoisovaleryl)urea
11: Methoxyphenamine
12: Chlorpheniramine
13: Noscapine
14: Isopropylantipyrine
15: Clemastine
16: Ibuprofen
180
5
160
140
100
13
7
80
4
6
60
1
40
14
10
11 12
8
16
15
2
20
140
4
0
市販感冒薬
120
-20
0.5
1.0
1.5
Retention time, min
2.0
2.5
3.0
100
Signal Intensity, mAU
0.0
TSKgel ODS-120H (1.9 μm, 3.0 mmI.D. x 50 mm)
A; 10 mmol/L Sodium Dihydrogenphosphate(pH2.5)
+ 100 mmol/L Sodium perchlorate
B; Acetonitrile
Gradient :
B conc. (0.0 min) 1 % → (3.0-4.0 min) 80 % → (4.5-7.0 min) 1 %
Flow rate :
1.2 mL/min
Column temp. : 50 ℃
Inj. vol. :
1 μL
Detection :
UV 210 nm
Column :
Eluent :
80
5
60
40
13
7
20
6
8
15
0
-20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Retention time, min
2.5
3.0
CNET誘導体化アルデヒド、ケトン類の高速分離
6.5E+05
Peaks
1: CNET-Formaldehyde (8 μg/L)
2: CNET-Acetaldehyde (8 μg/L)
3: CNET-Acetone (0.4 μg/L)
4: CNET-Acrolein (10 μg/L)
5: CNET-Propionaldehyde (4 μg/L)
6: CNET-Crotonaldehyde (1 μg/L)
7: CNET-2-Butanone (0.4 μg/L)
8: CNET-Butylaldehyde (2 μg/L)
9: CNET-Benzaldehyde (4 μg/L)
10: CNET-Methacrolein (8 μg/L)
11: CNET-Valeraldehyde (2 μg/L)
12: CNET-m-Tolualdehyde (0.5 μg/L)
13: CNET-Hexaldehyde (2 μg/L)
12
6.0E+05
9
5.5E+05
13
11
5.0E+05
m/z 295
9
4.5E+05
m/z 281
4.0E+05
6
4
m/z 261
3.0E+05
2
m/z 247
2.5E+05
7
8
m/z 275
3.5E+05
Intensity
Signal Intensity, mAU
9
3
120
1
4
3
5
7
10
6
2
m/z 245
2.0E+05
m/z 233
1.5E+05
m/z 231
1.0E+05
m/z 219
5.0E+04
m/z 205
0.0E+00
-5.0E+04
0
1
2
3
Retention time, min
4
5
Column :
Eluent :
Gradient :
Flow rate :
Column temp. :
Inj. vol. :
Instrument :
Ionization :
Mode :
6
TSKgel ODS-120H (1.9 μm, 2.0 mmI.D. x 150 mm)
A; Water
B; Acetonitrile
B conc. (0.0 min) 50 % → (5.0-7.0 min) 90 % → (7.1-12.0 min) 50%
0.45 mL/min
50 ℃
2 μL
Q TRAP (AB SCIEX)
ESI (Positive)
SIM
12

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