平�成�2�6�年�度�! 国立医薬品食品衛生研究所シンポジウム�� 第一部�革新的合成医薬品・再生医療�実用化のために� 病気の原因となるタンパク質を狙って壊す新しい 創薬手法の開発� 機能生化学部��内藤幹彦� 平成26年7月25日 異常タンパク質の発現による疾病と分子標的治療薬� 変異タンパク質� BCR-ABL! �チロシンキナーゼ! 病態� 慢性骨髄性白血病� 治療薬・阻害剤� Imatinib� （染色体転座t(9:22)により生じた融合遺伝子）� EML4-ALK! �セリンスレオニンキナーゼ! 肺がん� Crizotinib� 変異型EGF受容体! �チロシンキナーゼ� 肺がん� Gefitinib� （2番染色体の微小逆位による融合遺伝子）� これらの分子標的治療薬は、病気の原因となっているタンパク質の機能を阻害す ることにより極めて良好な治療効果を示す。� しかし、BCR-ABLではキナーゼ活性中心の変異等により耐性を獲得する がんの出現が問題となっている。� 病原性タンパク質の発現を減少させることができれば、タ ンパク質の機能を阻害する分子標的治療薬と同様な治療 効果を期待できる。� 転写� DNA� 翻訳� mRNA� proetin� degradation� 生理的な発現制御機構� メチル化制御� miRNA� ヒストン修飾� 翻訳制御� mRNA 安定性� 転写制御因子� mRNA decay� ERAD� ユビキチン・プロテアソーム系� オートファジー・リソソーム系� 人為的な発現制御技術� 遺伝子! ノックアウト� RNA干渉! siRNA� プロテインノックダウン� 標的タンパク質を特異的に分解することはできるか？� ユビキチンプロテアソーム系を利用すれば可能� ユビキチン・プロテアソーム系によるタンパク質の分解� ubiquitin! UBA! UBC! Ubi-ligase! E1! E2! E3! Substrate protein! K! Proteasome! 1，MeBSによるcIAP1タンパク質のプロテインノックダウン! �（自己ユビキチン化の活性化とプロテアソームによる分解）� 2，SNIPERによる標的タンパク質のプロテインノックダウン! �（SNIPER: Specific and Non-genetic IAP-dependent Protein ERaser）! cIAP1 as a target for cancer therapy! ・多くのがんで過剰発現が認められる� ・遺伝子増幅 (11q22) 、肺がん、子宮頸がん、食道がんなど� ・発現量が抗がん剤耐性と相関する� ・cIAP1遺伝子破壊マウスには顕著な異常は認められない� Destabilization of cIAP1 by small molecules! SMAC ! ユビキチン化� Casp9 ! cIAP1! BIR1! BIR2! BIR3! CARD! RING! Induction of proteasomal degradation of cIAP1, but not cIAP2 or XIAP, by ME-BS! ME-BS! WB: cIAP1! -! +! -! +! -! +! Z-LLH! THP1! Lacta! HT1080! MG132! EBC1! Exogenous None! Endogenous ME-BS! -!+!-!+!-!+!-!+! FLAG-cIAP1! XIAP! Actin! Actin! FLAG-cIAP2! Actin! MeBS FLAG-XIAP! Actin! BS� Me� An Idea for IAP-mediated ubiquitylation of target proteins subjected to proteasomal degradation� cIAP1! BIR! BIR! BIR! RING! E2! Auto-ubiquitylation� Proteasomal degradation of the target proteins� Target protein� BS� X� IAP-mediated ubiquitylation� cIAP1! BIR! BIR! BIR! E2! RING! 1，MeBSによるcIAP1タンパク質のプロテインノックダウン! �（自己ユビキチン化の活性化とプロテアソームによる分解）� 2，SNIPERによる標的タンパク質のプロテインノックダウン! �（SNIPER: Specific and Non-genetic IAP-dependent Protein ERaser）! SNIPER-2 induces degradation of CRABP-II, an ATRA-binding protein.� MeBS� BS� BS� Me� ATRA� cIAP1 auto-ubiquitylation� IAP-mediated ubiquitylation of ATRA-binding proteins� SNIPER-2� CRABP2! cIAP1! β-actin! SNIPER: Specific and Non-genetic IAP-dependent Protein ERaser� Development of SNIPER-4 that specifically degrades CRABP-II but not cIAP1� MeBS� SNIPER-2� SNIPER-4! Mechanism of protein knockdown by MeBS and SNIPERs� MeBSは、cIAP1の自己ユビキチン化を活性化して cIAP1を分解する! SNIPER-2は、cIAP1とCRABP-II両 方をユビキチン化して分解する。� SNIPER-4は、CRABP-IIを選択 的にユビキチン化して分解する。� 乳がん細胞におけるEstrogen受容体（ERα）及び Tamoxifenの機能� • • • 初発乳がんの多くはEstrogen依存性の 増殖を示す Tamoxifen（ERアンタゴニスト）はER陽 性乳がんの増殖を抑制する。 しかし、Tamoxifenは子宮内膜がんのリ スクを上げる。またp21が欠損した乳が んではTamoxifenがその増殖を促進す ることも報告されている。 Development of SNIPER(ER) to target estrogen receptors� Degradation of ERα without pS2 induction by SNIPER(ER)� 2.0 x 106 cells ! /10cm plate� 3.8 x 105 cells ! /6-well plate� 72h� MCF-7 10% FBS / RPMI / KAN� 24h� 4% charcoal/dextran-treated FBS ! / phenol-red free RPMI / KAN� Medium ! + E2 (10nM)! Western! change� + SNIPER (10µM)� mRNA� 24h� 9h� 0.2% charcoal/dextran-treated FBS ! / phenol-red free RPMI / KAN� Proteasomal degradation of ERα by SNIPER(ER) in breast cancer cells � MCF-7 (6hr) T47D (12hr) 1: DMSO, 30µM 2: MeBS, 30µM 3: 4-OHT, 30µM 4: MeBS + 4-OHT, 30µM 5: SNIPER(ER)-3, 3µM 6: SNIPER(ER)-3, 10µM 7: SNIPER(ER)-3, 30µM Induction of apoptosis in ER-positive MCF-7 breast cancer cells by SNIPER(ER)-3 � Induction of necrosis by SNIPER(ER) in breast cancer cells PI Hoechst Staurosporine HMGB1! (media) HMGB1! (cell) Actin H2O2 H2O2 (2 mM) H2O2 (0.5 mM) SNIPER(ER)-3 + MG132 Staurosporine (1 uM) Staurosporine (4 uM) SNIPER(ER)-3 ! + MG132 Control SNIPER(ER)-3 MeBS MeBS ! + 4OHT 4OHT MeBS + 4OHT SNIPER(ER)-3 Control Production of ROS in SNIPER(ER)-treated breast cancer cells Control MCF-7 MCF-7 ! + MG132 U2OS! MeBS + 4OHT SNIPER(ER)-3 N-Acetyl cysteine inhibits SNIPER(ER)-induced necrosis but not ERα degradation. SNIPER(ER)-3 NAC HMGB1! (media) HMGB1! (cell) ERα� Actin - + - + - - + + Mechanism of SNIPER(ER)-induced necrotic cell death SNIPER(ER) ERα degradation ROS production Necrotic cell death MG132 NAC SNIPERによるプロテインノックダウンのまとめ� 一般式� BS� N� 標的タンパク質� • 細胞質タンパク質! • 細胞膜結合タンパク質� X� 作用機序� Proteasomal degradation� Target protein� BS� X� IAP-mediated ubiquitylation� BIR! BIR! BIR! E2! RING! 従来の化合物との違い� 従来の小分子医薬品は、化合物自体が阻 害活性等をもつ。! （化合物に求めるハードルが高い）! SNIPERでは化合物に求める活性は標的タ ンパク質との結合活性のみであり、! 生物活性はSNIPERに結合したタンパク質 が担う!
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