ターゲットサイトの選択 ● 長さ ゲノム標的配列 標的配列の 3' 末端が NGG からなる proto-spacer adjacent motif（PAM）配 列 に隣 接した 19 塩 基 または 20 塩 基 の 長さの標的配列を選びます。 19-20 bp target sequence 19-20 bp target sequence PAM site オリゴを設計 5'- CATTTCTCAGTGCTATAGA NGG -3' ● 19-20 bp target sequence 方向性 CACCG tracrRNA CAAAA PolIIIterm 3' 端付加配列 5'- CATTTCTCAGTGCTATAGA GTTTT -3' TK pA F1 origin pUC origin CD4 または Bottom strand オリゴ Ampicillin OFP 2A Target specific reverse complementary region 3'- GTGGC GTAAAGAGTCACGATATCT -5' 相同性領域の確認 3' 端付加配列 CRISPR Nuclease Reporter Vector PCMV Top と Bottom strand オリゴを オフターゲット効果を低減させるために標的配列が他の 遺伝子と相同性がないことを確かめてください。 ● U6 promoter Top strand オリゴ ゲノムの 標 的 配 列 は 3' 末 端に PAM 配 列があることを 満 たしていれば、センス鎖あるいはアンチセンス鎖をコード のどちらを選んでもかまいません。 ● PAM site 5'- CATTTCTCAGTGCTATAGA NGG -3' アニーリング クローニングに必要な 3' 端付加配列 アニーリングした二本鎖オリゴ クローニングのための付加配列 5'-CATTTCTCAGTGCTATAGA GTTTT -3' 3'- GTGGC GTAAAGAGTCACGATATCT-5' 標 的 配 列 の 3' 突 出 末 端 に GTTTT を 加 え、Top strand オリゴ配列をつくります。Top strand オリゴの標的配列 と相補的な配列をつくり、3' 突出末端に CGGTG を加え、 Cas9 （with NLS1 and NLS2） クローニングに必要な 3' 端付加配列 Bottom strand オリゴを作成します。 CRISPR 用 オリゴのご注文はこちら（GeneArt® CRISPR 専用注文書が簡単便利） www.lifetechnologies.com/CRISPR ※ ガイドラインは一般的なもので、例外もあります。標的配列の選択により切断活性が異なります。1 ターゲットにつき、1 つ以上の特異的 gRNA をテストすることをおすすめします。 最近の論文では、gRNA 配列が標的配列と 1 塩基から 3 塩基のミスマッチを許容できることが示されています。標的配列の選択に関する見解は公表論文を参照してください（Fu et al., 2013; Mali et al., 2013） 。 CRISPR/Cas9 細胞の濃縮と標的部位切断の確認 103 4 3 2 1 0 102 SSC-A（10^6） 104 105 BL1-A FITC 106 ＣＤ4＋：80.0 ％ 103 磁気ビーズによる細胞濃縮 Sample 2 ＣＤ4＋：17.7 ％ SSC-A（10^6） SSC-A（10^6） SSC-A（10^6） Sample 1 4 3 2 1 0 102 104 105 BL1-A FITC 106 4 3 2 1 0 102 Sample 1 Sample 2 Pre Post Pre Post ＣＤ4＋：8.0 ％ Pre 未切断 103 104 105 BL1-A FITC 106 切断 4 3 2 1 0 102 ＣＤ4＋：92.3 ％ Post 103 104 105 BL1-A FITC % Indel： 3 106 （A）フローサイトメーターにおける FITC 標識抗体を用いた CD4 陽性細胞の解析 16.7 <1 13 （B）細胞濃縮前後の標的部位切断効率の解析 図 1：GeneArt® CRISPR Nuclease CD4 ベクター をトランスフェクションした 293FT 細胞を使用。 濃縮前の Sample1 および 2 は、Cas 9/CD4 を 発現する細胞集団の割合が低く、標的配列の 切断効率は 3% および 1% 以下であった。次に CRISPR/Cas9-CD4 発現細胞を抗CD4抗体で コートした磁気ビーズで濃縮し、濃縮前と後の 細胞ペレットを用いて、フローサイトメーター （A）およびゲノム標的部位切断の解析（B） を 行った。切断効率は濃縮前後でそれぞれ、3％ から 16.7％、1％ 以下から 13％を示した。 セルソータ―による細胞濃縮 Post sort: 99 % of cells were OFP positive Pre Sort: 9.5% cells were OFP positive 256 R3 256 R4 R9 192 Pre R4 R9 Post 192 R6 R6 R5 R3 R5 128 128 64 64 0 0 未切断 切断 100 101 102 103 104 100 FL2 Area Log 101 102 103 104 % Indel： 1.4 48.1 図 2：GeneArt® CRISPR Nuclease: OFP Reporter ベクターを 293FT 細胞へトラン スフェクションし、72 時間後、細胞を希釈し た後セルソーターを用いて細胞を濃縮した。 濃縮後の細胞集団を解析した結果、OFP 陽 性細胞の割合は 99% を示した（A）。次に濃 縮後の細胞集団における、ゲノム切断の割合 を電気泳動の結果から求めた。濃縮前の細 胞ではゲノム DNA の切断が 1.4% であった が、濃縮後では 48.1% を示した（B）。 FL2 Area Log （A）フローサイトメーターによる細胞濃縮前後の OFP 陽性細胞の解析 （B）細胞濃縮前後の標的部位切断効率の解析 Ordering Information 製品名 サイズ 製品番号 価格 GeneArt® CRISPR Nuclease: OFP Reporter Kit 10 反応 A21174 ￥ 180,000 GeneArt® CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Kit 10 反応 A21175 ￥ 180,000 公式 Facebook ページ & Twitter もチェック！ facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN 最新の価格および 在 庫数は、弊社ホームページ右上の“製品価格と在 庫の検 索”でご確認いただけます。 ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 コールセンター テクニカルサポート オーダーサポート カスタムプライマーについて 販売店 TEL.03-6832-9300 FAX. 03-6832-9580 TEL.06-6339-8165 FAX. 06-6339-8138 0120-650591（携帯からでもご利用いただけます） 0120-477-392 FAX：0120-477-120 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9585 サービスラボ 営 業 部 TEL：03-5753-3006 FAX：03-5753-3007 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。 標準販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. © 2013, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan. IVC027-A1311OB www.lifetechnologies.com
© Copyright 2024 ExpyDoc
